纤维蛋白凝胶-聚乳酸微球复合支架及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于3D细胞培养技术领域，具体涉及一种纤维蛋白凝胶-聚乳酸微球复合 支架及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 3D细胞培养技术是在细胞培养过程中，为细胞提供一个更加接近体内生存条件的 三维微环境，使细胞能够具有高质量、高密度的细胞繁殖的优势；这些微环境的构建方式， 通常有支架、微球载体等等方式实现。
[0003] 而其中，微球载体其原理是将对细胞无害的颗粒加入到培养容器的培养液中作为 载体，使细胞吸附在其表面附着生长，同时通过持续搅动使微球载体始终保持悬浮状态。因 为贴壁依赖性细胞只有贴附在固体基质表面才能增殖，故细胞在微球载体表面的贴附是进 一步铺展和生长的关键。而目前使用较多的微球载体有液体微球载体、大孔明胶微球载体、 聚苯乙稀微球载体、PHEMA微球载体、甲壳质微球载体、聚氨酯泡沫微球载体、藻酸盐凝胶 微球载体以及磁性微球载体等。这些类型的微球载体在根据细胞培养的需求进行选择时， 主要是根据细胞能否在微球载体表面黏附，具体主要是细胞与微球载体的接触概率和相融 性；影响这两个因素的是细胞的表面和载体表面的静电引力和范德华力。但是，出于微球之 间各自不能稳定的结合，相对之间游离性较大，无法构建比较稳定的细胞生长空间，所以在 3D细胞培养的过程中，通常多倾向于用支架进行。
[0004] 而目前效果较好的支架大多是胶原、蚕丝蛋白、纤维蛋白、海藻酸盐、透明质酸、壳 聚糖等原材料制备。但是这些材料在使用中尽管相比具有良好的生物相容性，但是来源非 常受限，且受制于材料自身的因素难以控制。而且各种类型的支架都有其有缺陷，比如凝胶 类型支架亲和性好一些，但是自身强度低、降解快、机械力学不足、形态变化不稳定；又如聚 合物类型的支架形态稳定、密度均一、降解缓慢，却不能提供稳定的细胞贴壁强度。所以采 用上述类型的微球载体进行一些培养环境要求较高细胞时，比如DC、CIK等免疫细胞培养 时，都无法较好地满足需求。
【发明内容】
[0005] 本发明实施的目的在于克服现有的缺陷，提供一种机械强度高、孔隙多，且相容亲 和性也能相应大大提升的纤维蛋白凝胶-聚乳酸微球复合支架。
[0006] 为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：
[0007] -种纤维蛋白凝胶-聚乳酸微球复合支架制备方法，包括如下步骤：
[0008] 获取聚乳酸微球；
[0009] 对所述聚乳酸微球进行表面氨解处理，获取氨解聚乳酸微球；
[0010] 在所述氨解聚乳酸微球上接枝纤维蛋白原，获取接枝聚乳酸微球；
[0011] 将所述接枝聚乳酸微球于纤维蛋白原溶液中固化凝结。
[0012] 本发明的上述方法步骤，采用将聚乳酸微球作为共价内部基质对纤维蛋白凝胶支 架进行填充，制备得到具有微球载体内填充的凝胶复合支架；通过微粒的填充一方面可以 大大提高蛋白凝胶的强度，另一方面微球通过接枝之后，微球之间的凝胶孔隙、微球表面的 相容亲和性也能相应大大提升；能够稳定地构成细胞生长的环境，以及便于营养和代谢产 物的交换。
[0013] 在上述方法过程的基础上，本发明进一步还提出一种根据上述方法步骤制备得到 的纤维蛋白凝胶-聚乳酸微球复合支架。采用本发明所制备的纤维蛋白凝胶-聚乳酸微球 复合支架，在组织工程进行细胞培养的后期，纤维蛋白凝胶发生大部分降解后，微球载体之 间依然能保持相互连接堆砌，仍然可以维持细胞生长的空间，二者的复合可以互相弥补其 缺点，具有一定的协同作用，对于一些生长和培养条件和要求严格的细胞生长更为有利。
【附图说明】
[0014] 下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
[0015] 图1为本发明实施例制备的纤维蛋白凝胶-聚乳酸微球复合支架的场发射扫描电 镜扫描图。
【具体实施方式】
[0016] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并 不用于限定本发明。
[0017] 本发明实例提出一种纤维蛋白凝胶-聚乳酸微球复合支架制备方法，包括如下步 骤：
[0018] S10,制备聚乳酸微球；
[0019] S20,对聚乳酸微球进行表面氨解处理；
[0020] S30,在表面氨解后的聚乳酸微球上接枝纤维蛋白原；
[0021] S40,将纤维蛋白原接枝后的聚乳酸微球与纤维蛋白原溶液共同凝结固化。
[0022] 本发明的上述制备方法步骤，采用将聚乳酸微球作为共价内部基质对纤维蛋白凝 胶支架进行填充，制备得到具有微球载体内填充的凝胶复合支架；通过微粒的填充一方面 可以大大提高蛋白凝胶的强度，另一方面微球通过接枝之后，微球表面的相容亲和性也能 相应大大提升；微球之间的凝胶孔隙，能够稳定地构成细胞生长的环境，以及便于营养和代 谢产物的交换。同时，在组织工程进行细胞培养的后期，纤维蛋白凝胶发生大部分降解后， 微球载体之间依然能保持相互连接堆砌，仍然可以维持细胞生长的空间，二者的复合可以 互相弥补其缺点，具有一定的协同作用。对于一些生长和培养条件要求严格的细胞生长更 为有利。
[0023] 其中在上述步骤S10中制备聚乳酸微球，或者可以直接购买；聚乳酸微球是使用 比较多的聚合物微球载体，是比较成熟的商品，可以直接购买得到。进一步，在本发明的上 述实施过程中，聚乳酸微球主要的目的是为了在纤维蛋白凝胶内形成填充，而且最好填充 之后能在微球之间能利于形成凝胶内部孔隙，提升细胞的附着和生长空间。而经过试验之 后，采用粒径和尺寸比较均一的微球填充之后，比较难产生内部应力和孔隙差，相对比较均 一；所以本发明中采用粒径尺寸不相同的聚乳酸微球进行混合，以增加填充之后凝胶内部 的孔隙差。而具体实施中，根据所购买的聚乳酸凝胶产品的规格（市售的聚乳酸微球一般 都是在60~250 ym之间），本发明中优选采用三种粒径不同的聚乳酸微球进行配合，三 种粒径不同的聚乳酸微球的添加比例按照小粒径微球：中粒径微球：大粒径微球为4~6 : 2~3 :1的比例进行。其中，这三种粒径不同的微球尺寸和大小均是相对的，实施中一般可 以分别选择250 y m左右、180 y m左右、120 y m左右稍微比较有差别的进行。
[0024] 进一步在步骤S10选料完成之后，步骤S20进一步对微球的表面进行处理，处理的 方式为氨解处理，聚乳酸微球的聚酯类聚合物链中的酯键可以在氨基存在下发生断裂，一 端与氨基形成酰胺键，另一端形成羟基。氨解反应之后增加微球表面的活性基团数量，这 些活性的基团一方面可以便于后续与纤维蛋白的连接；第二方面可以改变微球表面的亲水 性，便于细胞的细胞粘附、增殖。其中，在该步骤中氨解反应的过程采用己二胺对聚乳酸微 球表面进行氨解，己二胺中的一个氨基与断开的聚乳酸的酯键形成酰胺键，而另一端保存 形成为自由氨基，从而将自由氨基引到聚乳酸微球的表面。
[0025] 并且，在该步骤中氨解发生的过程只需微球表面产生这些暴露的基团即可，而尽 量避免聚乳酸微球自身的大量损失；而且氨解的处理中，在保证氨基引入量和基体机械强 度的前提下，本发明相比其他的氨解的过程，采用尽量加强引入氨解的反应物的浓度，增加 局部反应的程度和效率，且尽量降低反应时间；其目的在于反应的初始阶段尽量增加局部 的剧烈性，局部剧烈之后能够在很短的时间内将微球表面产生凹陷或者孔洞形态，增加孔 隙率；有利于在后续填充之后提升支架的细胞吸附空间。所以，本发明该步骤相比正常其他 的表面处理的方式中，用于改性的己二胺的浓度控制在12~15%mg/mL的质量体积浓度， 同时将氨解的过程控制10~15min ;并且更加优选地为了加快初始反应的速率，可以将反 应温度提升至50~60°C的温度。
[0026] 在上述步骤S20之后，步骤S30进一步将表面氨解之后的聚乳酸微球进行表面接 枝；而采用该手段进行的处理中，接枝采用的接枝物为纤维蛋白原；接枝上纤维蛋白原的 目的，一方面是接枝上的纤维蛋白原可以在后续的过程中，自身形成纤维蛋白凝胶的成分， 可以提升微球与凝胶的结合力；而另一方面，接枝上的纤维蛋白原固化之后会形成微球之 间连接的丝网或者骨架，通过该丝网或者骨架，后续组织工程培养中当整体的纤维蛋白凝 胶发生降解之后，这些微球所接枝并固化的纤维蛋白形成微载体之间保持相互连接堆砌的 桥梁，仍然可以维持细胞生长的空间，大大延缓并提升了复合支架的使用的效率。
[0027] 其中在本发明的步骤S30中进行接枝处理的方式可以采用"schiff碱反应"进 行，具体实施的方式可以采用将步骤S20氨解之后的聚乳酸微球戊二醛溶液中，使微球表 面的氨基转换成醛基-CH0,而后表面富含醛基的聚乳酸微球浸泡于纤维蛋白原溶液中，由 于Schiff碱反应，醛基与纤维蛋白胶原分子链中的氨基反应形成-C= N-基团，从而实现 将纤维蛋白原共价接枝固定在微球表面。
[0028] 同时，在接枝反应的过程中，本身表面氨解处理之后能接枝上纤维蛋白的量已经 确定（即为氨解过程中聚乳酸表面上所生成的活性集团的数量），所以接枝的过程中，直接 可以稍微过量添加纤维蛋白原，以保证基本上都能接枝上即可。
[0029] 最后，最终步骤S40在步骤S30接枝完成之后，将接枝后的微球浸到纤维蛋白原溶 液中整体进行固化凝结，形成聚乳酸填充的纤维蛋白凝胶支架。
[0030] 在上述方法过程的基础上，本发明进一步还提出一种根据上述方法步骤制备得到 的纤维蛋白凝胶-聚乳酸微球复合支架。采用本发明所制备的纤维蛋白凝胶-聚乳酸微球 复合支架，得到具有微球载体内填充的纤维蛋白凝胶复合支架；通过微粒的填充一方面可 以大大提高蛋白凝胶的强度，另一方面微球通过接枝之后，微球表面的相容亲和性也能相 应大大提升；微球之间的凝胶孔隙，能够稳定地构成细胞生长的环境，以及便于营养和代谢 产物的交换。同时，在组织工程进行细胞培养的后期，纤维蛋白凝胶发生大部分降解后，微 球载体之间依然能保持相互连接堆砌，仍然可以维持细胞生长的空间，二者的复合可以互 相弥补其缺点，具有一定的协同作用，对于一些生长和培养条件和要求严格的细胞生长更 为有利。
[0031] 为使本发明的上述实施的技术细节和过程方法能更易于本领域技术人员的理解 和实施参考