一种制备生物性复合气管补片的方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及医疗器械领域，尤其涉及一种制备生物性复合气管补片的方法及其制备的气管补片及应用。
【背景技术】
[0002]由于气管先天畸形、肿瘤切除、外伤等各种病因，常会导致气管壁部分缺失。如果直接将气管纵行缝合，可能会造成医源性气道狭窄，引起一系列并发症包括反复发作的致命性肺炎，此时将气管切断再吻合是目前解决这一难题的主要方法。但是，行长段气管切除术(成人大于全长的50%，儿童大于30%)后，由于两断端距离太远造成吻合口张力过大，手术无法进行。故寻找一种良好的补片材料对缺损的气管壁进行修补，对于解决这一临床问题有着重要的意义。
[0003]同种异体移植作为最经典的器官替代、修复和重建方法，已经有百余年的历史，并在多个领域取得一定的成功。但是，一方面供体器官的严重缺乏在世界范围内面临的难题；另一方面，由于控制排异反应存在，需要长期服用免疫抑制剂所带来的巨大副作用不容小觑。即便是在长期坚持服用药物的情况下，慢性排异反应也无法阻止，移植物最终会失去功能，从而需要再次手术或其他替代治疗。更重要的是，研究表明气管粘膜上皮细胞具有很高的MHC I和MHC II抗原，异体上皮细胞是免疫攻击的把目标和重要环节，所以造成气管的同种异体移植成功率更低、风险更大。降低移植物的免疫原性，减少排异反应是同种异体移植亟待解决的问题。
[0004]组织工程是在体外构建具有生命力的活体植入体内。从而达到修复缺损、重建功能、提高生活质量之目的。理想的气管补片应该最大限度地降低移植物的免疫原性，并且尽可能的保留细胞外基质。组织工程气管正好满足了这些基本条件，是目前该领域研究的热点。2008年瑞典的Macchiarini医生利用气管脱细胞支架材料完成了第一例成功的组织工程气管移植手术，标志着气管重建的组织工程时代的开始。然而，由于这一技术仍然依赖于供体捐献气管以制作脱细胞气管支架，所以气管来源仍然面临挑战。另一方面，由于受者的细胞要经过很长一段时间的复杂培养工艺才能定植、攀附到脱细胞气管支架上，所以这种制作方法的效率仍然有待提高。
[0005]最近的十年，增材制造技术，也就是人们熟悉的“三维打印技术”的快速发展，为生物医学界带来新的启迪。它是一种个性化制备复杂支架和组织工程植入物的多功能快速成型技术。而生物打印在传统三维打印的基础上，进一步实现了对于细胞空间分布的精确定位。可是，目前研究得到的三维打印气管补片存在生物相容性差、细胞成活率低、制作工艺复杂、产品可塑性差、无法满足个性化需求等缺点。
【发明内容】
[0006]本发明为解决现有技术中的上述问题提出了一种制备生物性复合气管补片的方法，通过精确调控多种细胞的空间分布、改善补片材料配方、完善内部结构设计，能够临床提供安全可行的气管补片产品。
[0007]本发明解决上述技术问题所采取的技术措施为:
[0008]—种制备生物性复合气管补片的方法，包括以下步骤:
[0009]步骤一，利用支气管镜，无菌刷取支气管上皮细胞，体外培养扩增；提取耳廓软骨细胞，消化、分散，体外培养扩增；
[0010]步骤二，将胶原和透明质酸与去离子水混合，经滤菌器过滤除菌，得到软材料；将壳聚糖经乙醇熏蒸后，于紫外灯下照射彻底灭菌，均匀分散于灭菌培养液中；
[0011]步骤三，将所述步骤二中所得的软材料和培养液以1:1的体积比相混合，制成重悬细胞的软材料混合物；
[0012]步骤四，将聚乳酸-羟基乙酸共聚物与聚乙二醇溶于二氯甲烷中，超声搅拌使分散均匀后，置于通风橱内使二氯甲烷自然挥发，制得硬材料混合物；
[0013]步骤五，分别将所述步骤一中扩增培养的支气管上皮细胞和软骨细胞消化、重悬、计数并离心，弃去上清后，重悬于所述步骤三的软材料混合物中，分别制得支气管上皮细胞生物复合材料和软骨细胞生物复合材料；
[0014]步骤六，将所述步骤五中的支气管上皮细胞生物复合材料和软骨细胞生物复合材料分别置于两只低温墨仓内，安装直径为0.2毫米的打印针头，加载于3D打印机上备用；将所述步骤四中的硬材料混合物置于高温墨仓内，安装直径为0.1毫米的打印机针头，加载于3D打印机上备用；
[0015]步骤七，使用建模软件构建贴合的三层矩形片状结构模型，依次为上皮细胞层、软骨细胞层和硬材料层，所述上皮细胞层由支气管上皮细胞生物复合材料组成，所述软骨细胞层由软骨细胞生物复合材料组成，所述硬材料层由硬材料混合物组成；
[0016]步骤八，将结构模型导入打印机并进行3D打印，得到生物性复合气管补片。
[0017]为进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括:
[0018]上述步骤八具体包括:
[0019]步骤1，将结构模型导入打印机驱动程序，分层解析；
[0020]步骤2，将一片无菌载玻片置于打印机作业平台上，校准定位打印机针头；
[0021]步骤3，设置打印机运行参数:硬材料混合物加热温度为150-210°C，内部结构间隙为0.2-0.5毫米，墨仓内驱动气压为0.1-0.5Bar，针头运行速度为5_10毫米/秒；支气管上皮细胞生物复合材料和软骨细胞生物复合材料保持室温，内部结构间隙为0.1-0.3毫米，墨仓内驱动气压为0.1-0.3Bar，针头运行速度为7_13毫米/秒；
[0022]步骤4，启动打印流程，按照设置的运行参数打印硬材料层；
[0023]步骤5，打印软骨细胞层，完成软骨细胞层的打印后暂停打印作业，用超声雾化机将三聚磷酸钠水溶液均匀喷于软骨细胞层上，使之充分交联；
[0024]步骤6，继续打印作业，打印上皮细胞层，完成后用超声雾化机将三聚磷酸钠水溶液均匀喷于上皮细胞层上，使之充分交联；
[0025]步骤7，用镊子小心将制作完成的生物性复合气管补片从载玻片上揭下，无菌条件下修剪成受体所需求的形状。
[0026]上述步骤二为将10%胶原和5%透明质酸按照质体积比与去离子水混合，经滤菌器过滤除菌，得到软材料；将壳聚糖经乙醇熏蒸后，于紫外灯下照射24小时彻底灭菌，以8%质量体积比分散于灭菌培养液中。
[0027]上述步骤四为将聚乳酸-羟基乙酸共聚物与聚乙二醇按照19:1的比例溶于二氯甲烷中，超声搅拌使分散均匀后，置于通风橱内使二氯甲烷自然挥发，制得硬材料混合物。
[0028]上述步骤五为分别将所述步骤一中扩增培养的支气管上皮细胞和软骨细胞消化、重悬、计数并离心，弃去上清后，按照I X 16个/毫升的细胞浓度重悬于所述步骤三的软材料混合物中，分别制得支气管上皮细胞生物复合材料和软骨细胞生物复合材料。
[0029]上述步骤七中构建的贴合的三层矩形片状结构模型中，所述上皮细胞层和软骨细胞层厚度为0.2毫米，所述硬材料层为0.6毫米。
[0030]上述步骤5中的三聚磷酸钠水溶液我8 %三聚磷酸钠水溶液。
[0031 ] 上述步骤6中的三聚磷酸钠水溶液我8 %三聚磷酸钠水溶液。
[0032]另一方面，本发明还提供一种根据上述方法所制备的生物性复合气管补片。
[0033]最后一方面，本发明还提供根据上述方法所制备的生物性复合气管补片的应用。
[0034]本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果:
[0035]本发明的生物材料配方生物相容性好，用于打印气管补片，避免了对于供体气管的依赖；本发明所用材料同时具备柔韧性和一定机械强度，补片的内部结构设计亦有所改进，使之可以根据临床需要进行弯折和修剪；将由受体自己的气道上皮细胞和软骨细胞扩增得到的种子细胞打印于补片上，避免了患者对于细胞的排异反应；制备时的种子细胞由终末分化的成熟细胞组成，避免了使用干细胞所带来的诱导分化难题和成瘤风险；细胞的空间分布在打印中精确可控，按照组织学规律分布(上皮朝向管腔，软骨朝向纵膈)加速了修复过程；植入的补片可在体内降解，减少了异物残留体内所带来的并发症，避免了二次手术取出的风险。
【附图说明】
[0036]图1为本发明的生物性复合气管补片的结构示意图。
【具体实施方式】
[0037]本发明提供了一种制备生物性复合气管补片的方法，包括以下步骤:
[0038]步骤一，利用支气管镜，无菌刷取支气管上皮细胞，体外培养扩增；提取耳廓软骨细胞，消化、分散，体外培养扩增；
[0039]步骤二，将胶原和透明质酸与去离子水混合，经滤菌器过滤除菌，得到软材料；将壳聚糖经乙醇熏蒸后，于紫外灯下照射彻底灭菌，均匀分散于灭菌培养液中；
[0040]步骤三，将所述步骤二中所得的软材料和培养液以1:1的体积比相混合，制成重悬细胞的软材料混合物；
[0041]步骤四，将聚乳酸-羟基乙酸共聚物与聚乙二醇溶于二氯甲烷中，超声搅拌使分散均匀后，置于通风橱内使二氯甲烷自然挥发，制得硬材料混合物；
[0042]步骤五，分别将所述步骤一中扩增培养的支气管上皮细胞和软骨细胞消化、重悬、计数并离心，弃去上清后，重悬于所述步骤三的软材料混合物中，分别制得支气管上皮细胞生物复合材料和软骨细胞生物复合材料；
[0043]步骤六，将所述步骤五中的支气管上皮细胞生物复合材料和软骨细胞生物复合材料分别置于两只低温墨仓内，安装直径为0.2毫米的打印针头，加载于3D打印机上备用；将所述步骤四中的硬材料混合物置于高温墨仓内，安装直径为0.1毫米的打印机针头，加载于3D打印机上备用；
[0044]步