骤七，使用建模软件构建贴合的三层矩形片状结构模型，依次为上皮细胞层、软骨细胞层和硬材料层，所述上皮细胞层由支气管上皮细胞生物复合材料组成，所述软骨细胞层由软骨细胞生物复合材料组成，所述硬材料层由硬材料混合物组成；
[0045]步骤八，将结构模型导入打印机并进行3D打印，得到生物性复合气管补片。
[0046]图1为本发明的结构示意图，其中的附图标记为:上皮细胞层1、软骨细胞层2、硬材料层3。
[0047]下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
[0048]实施例一
[0049]利用支气管镜，无菌刷取接受手术的患者自体支气管上皮细胞，体外培养扩增备用；然后利用手术提取患者耳廓软骨，消化分散软骨细胞，体外培养扩增备用。
[0050]配制软材料:将10%胶原和5%透明质酸按照质体积比与去离子水混合，经滤菌器过滤除菌。将壳聚糖经乙醇熏蒸后，于紫外灯下照射24小时彻底灭菌，以8%质量体积比分散于培养液中。将上述两种溶液1:1混合，制成用于重悬细胞的软材料混合物。
[0051]将体外扩增的两种细胞分别消化、重悬、计数后离心，弃去上清液，按照100万/毫升的细胞浓度重悬于前述混合物中，制成支气管上皮细胞生物复合材料和软骨细胞生物复合材料。
[0052]将支气管上皮细胞生物复合材料和软骨细胞生物复合材料别置于两只低温墨仓内，安装直径为0.2毫米的打印针头，加载于打印机上备用。
[0053]将聚乳酸-羟基乙酸共聚物与聚乙二醇按照19:1溶于二氯甲烷中，超声搅拌使分散均匀后，置于通风处内使二氯甲烷自然挥发，得到硬材料混合物。将硬材料混合物置于高温墨仓内，安装直径为0.1毫米的打印机针头，加载于打印机上备用。
[0054]使用建模软件构建如图1所示的贴合的三层矩形片状结构，分别为上皮细胞层1、软骨细胞层2、硬材料层3，上皮细胞层I和软骨细胞层2厚度均为0.2毫米，硬材料层3的厚度为0.6毫米。
[0055]将模型导入打印机驱动程序，分层解析，硬材料拆解为三层打印，两种细胞软材料分别拆解为一层打印。
[0056]将一片无菌载玻片置于打印机作业平台上，校准定位打印针头。设置打印机运行参数:硬材料加热温度为185°C，内部结构间隙为0.35毫米，墨仓内驱动气压为0.3Bar，针头运行速度为7毫米/秒；软材料温度为室温，内部结构间隙为0.30毫米，墨仓内驱动气压为0.1Bar，针头运行速度为10毫米/秒。启动打印流程，按照上述参数打印硬材料层。
[0057]打印富含软骨细胞的软骨细胞层2，完成后暂停打印作业，用超声雾化机将8%三聚磷酸钠均匀喷于软骨细胞层2上。经过大约20分钟，使之充分交联后，用滤纸吸去多余液体。
[0058]继续打印作业，使上抬打印头0.4毫米，打印富含上皮细胞的上皮细胞层1，完成后用超声雾化机将8%三聚磷酸钠水溶液均匀喷于软材料上。经过大约20分钟，使之充分交联。
[0059]用镊子小心将制作完成的补片材料从载玻片上揭下。无菌条件下修剪成受体所需求的形状。手术植入患者体内，修补气管壁缺损。
[0060]本发明的制备生物性复合气管补片的方法，生物材料配方生物相容性好，用于打印气管补片，避免了对于供体气管的依赖；本发明所用材料同时具备柔韧性和一定机械强度，补片的内部结构设计亦有所改进，使之可以根据临床需要进行弯折和修剪；将由受体自己的气道上皮细胞和软骨细胞扩增得到的种子细胞打印于补片上，避免了患者对于细胞的排异反应；制备时的种子细胞由终末分化的成熟细胞组成，避免了使用干细胞所带来的诱导分化难题和成瘤风险；细胞的空间分布在打印中精确可控，按照组织学规律分布(上皮朝向管腔，软骨朝向纵膈)加速了修复过程；植入的补片可在体内降解，减少了异物残留体内所带来的并发症，避免了二次手术取出的风险。
[0061]以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
【主权项】
1.一种制备生物性复合气管补片的方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤一，利用支气管镜，无菌刷取支气管上皮细胞，体外培养扩增；提取耳廓软骨细胞，消化、分散，体外培养扩增； 步骤二，将胶原和透明质酸与去离子水混合，经滤菌器过滤除菌，得到软材料；将壳聚糖经乙醇熏蒸后，于紫外灯下照射彻底灭菌，均匀分散于灭菌培养液中； 步骤三，将所述步骤二中所得的软材料和培养液以1:1的体积比相混合，制成重悬细胞的软材料混合物； 步骤四，将聚乳酸-羟基乙酸共聚物与聚乙二醇溶于二氯甲烷中，超声搅拌使分散均匀后，置于通风橱内使二氯甲烷自然挥发，制得硬材料混合物； 步骤五，分别将所述步骤一中扩增培养的支气管上皮细胞和软骨细胞消化、重悬、计数并离心，弃去上清后，重悬于所述步骤三的软材料混合物中，分别制得支气管上皮细胞生物复合材料和软骨细胞生物复合材料； 步骤六，将所述步骤五中的支气管上皮细胞生物复合材料和软骨细胞生物复合材料分别置于两只低温墨仓内，安装直径为0.2毫米的打印针头，加载于3D打印机上备用；将所述步骤四中的硬材料混合物置于高温墨仓内，安装直径为0.1毫米的打印机针头，加载于3D打印机上备用； 步骤七，使用建模软件构建贴合的三层矩形片状结构模型，依次为上皮细胞层、软骨细胞层和硬材料层，所述上皮细胞层由支气管上皮细胞生物复合材料组成，所述软骨细胞层由软骨细胞生物复合材料组成，所述硬材料层由硬材料混合物组成； 步骤八，将结构模型导入打印机并进行3D打印，得到生物性复合气管补片。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤八具体包括: 步骤1，将结构模型导入打印机驱动程序，分层解析； 步骤2，将一片无菌载玻片置于打印机作业平台上，校准定位打印机针头； 步骤3，设置打印机运行参数:硬材料混合物加热温度为150-210°C，内部结构间隙为0.2-0.5毫米，墨仓内驱动气压为0.1-0.5Bar，针头运行速度为5-10毫米/秒；支气管上皮细胞生物复合材料和软骨细胞生物复合材料保持室温，内部结构间隙为0.1-0.3毫米，墨仓内驱动气压为0.1-0.3Bar，针头运行速度为7_13毫米/秒； 步骤4，启动打印流程，按照设置的运行参数打印硬材料层； 步骤5，打印软骨细胞层，完成软骨细胞层的打印后暂停打印作业，用超声雾化机将三聚磷酸钠水溶液均匀喷于软骨细胞层上，使之充分交联； 步骤6，继续打印作业，打印上皮细胞层，完成后用超声雾化机将三聚磷酸钠水溶液均匀喷于上皮细胞层上，使之充分交联； 步骤7，用镊子小心将制作完成的生物性复合气管补片从载玻片上揭下，无菌条件下修剪成受体所需求的形状。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤二为将10%胶原和5%透明质酸按照质体积比与去离子水混合，经滤菌器过滤除菌，得到软材料；将壳聚糖经乙醇熏蒸后，于紫外灯下照射24小时彻底灭菌，以8%质量体积比分散于灭菌培养液中。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤四为将聚乳酸-羟基乙酸共聚物与聚乙二醇按照19:1的比例溶于二氯甲烷中，超声搅拌使分散均匀后，置于通风橱内使二氯甲烷自然挥发，制得硬材料混合物。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤五为分别将所述步骤一中扩增培养的支气管上皮细胞和软骨细胞消化、重悬、计数并离心，弃去上清后，按照IX16A/毫升的细胞浓度重悬于所述步骤三的软材料混合物中，分别制得支气管上皮细胞生物复合材料和软骨细胞生物复合材料。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤七中构建的贴合的三层矩形片状结构模型中，所述上皮细胞层和软骨细胞层厚度为0.2毫米，所述硬材料层为0.6毫米。7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤5中的三聚磷酸钠水溶液我8%三聚磷酸钠水溶液。8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤6中的三聚磷酸钠水溶液我8%三聚磷酸钠水溶液。9.一种根据权利要求1-8任意一项方法所制备的生物性复合气管补片。10.一种根据权利要求1-8任意一项方法所制备的生物性复合气管补片的应用。
【专利摘要】本发明结合3D打印技术提供了一种制备生物性复合气管补片的方法，通过精确调控多种细胞的空间分布、改善补片材料配方、完善内部结构设计，能够临床提供安全可行的气管补片产品。本发明的生物材料配方生物相容性好，用于打印气管补片，避免了对于供体气管的依赖；本发明所用材料同时具备柔韧性和一定机械强度，补片的内部结构设计亦有所改进，使之可以根据临床需要进行弯折和修剪；将由受体自己的气道上皮细胞和软骨细胞扩增得到的种子细胞打印于补片上，避免了患者对于细胞的排异反应；细胞的空间分布在打印中精确可控；植入的补片可在体内降解，减少了异物残留体内所带来的并发症，避免了二次手术取出的风险。
【IPC分类】A61L27/20, A61L27/18, A61L27/58, A61L27/26, A61L27/38, A61L27/50, A61F2/04, A61L27/24, B33Y70/00
【公开号】CN105107024
【申请号】CN201510501963
【发明人】李牧, 张洪波, 陈昶, 殷瑞雪, 郑卉, 邢天龙, 王龙
【申请人】上海市肺科医院
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年8月14日