一种无菌可注射材料的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种无菌可注射材料的制备方法，特别涉及无菌可注射透明质酸凝胶 的制备方法。
【背景技术】
[0002] 透明质酸（Hyaluronic acid)是一种是由单位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺 组成的高分子粘多糖。D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺之间由0-1，3-配糖键相连，双糖 单位之间由0-1，4-配糖键相连。商品化透明质酸一般为其钠盐，即透明质酸钠（Sodium Hyaluronate)，简称HA，习惯上仍称为透明质酸。透明质酸以其独特的分子结构和理化性 质在机体内显示出多种重要的生理功能，尤其具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界 中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子（Natural moisturizing factor，NMF)。 透明质酸广泛分布于人体各部位，其中皮肤也含有大量的透明质酸。透明质酸被广泛应用 于眼科粘弹性保护、骨关节功能改善、外科防粘连、组织填充等医用和整形美容领域。透明 质酸被注入真皮或皮下组织中，使皮下组织容积增大，同时透明质酸可以吸收周围组织的 水分，使原本松弛、凹陷的皮肤体积增大而恢复饱满的形态。在整形美容领域，透明质酸主 要用于填充面部凹陷、除皱、隆鼻、治疗半侧颜面部萎缩等方面。
[0003] 由于人体透明质酸酶、自由基降解等原因，外援天然的透明质酸在体内维持存在 的时间短，限制了透明质酸在皮下组织填充或皮肤修复、手术防粘连以及关节腔润滑等方 面的应用。因此，国内外一些公司研究通过改进不同的加工工艺来提高透明质酸在人体内 降解周期。
[0004] 透明质酸在体内的降解周期受到材料本身和体内微环境的影响，而本身主要受到 材料组成和加工工艺影响。最近一些年，国外一些公司使用交联剂，例如1，4-丁二醇缩水 甘油醚（BDDE)，制造的交联透明质酸被应用于软组织填充，在体内降解周期只有达到6到 12个月的时间，整形美容患者需要连续注射两次才可以达到预期效果。很显然，这样快的降 解周期满足不了人们对于更长降解周期透明质酸产品的需求。
[0005] 大家知道，透明质酸注射前必须灭菌，透明质酸凝胶在110°C以上加热处理或者辐 照处理后，稳定性不好，灭菌后的弹性模量G'显著降低，降解加快，会影响其被植入体内后 填充效果。一些专利讲到透明质酸与维生素C或其衍生物的应用，专利W0 2012/104419提 示可以通过添加一定量的维生素C及其衍生物到含有镇静剂的透明质酸，可以提高透明质 酸的热稳定性，使得灭菌后弹性模量G'的变化不大。但是，该专利又指出单独添加维生素 C及其衍生物对透明质酸材料的稳定性没有作用或者作用不显著。专利US2014/0088037 也显示添加维生素C磷酸酯镁（MAP)HA的弹性模量G'灭菌后保持不变或者提高5-400Pa。 但专利的产品存在大小不一的透明质酸颗粒，通过增大颗粒来维持降解周期的。透明质酸 颗粒较大时，虽然对稳定有帮助，但是大颗粒常常不柔软，植入时非常困难，而且植入人体 后往往伴有胀痛和不舒适感的产生。瑞典公司Q-MED AB公司生产透明质酸产品一瑞蓝 2 被临床应用多年，将近150万人次使用过，显示安全、有效。但是，临床也反 映，由于该产品含有大小不均一的凝胶颗粒，柔软度不高，植入体后会有胀痛等不舒适感而 且体内降解周期太短，半年内往往需要二次注射。美国专利No. 2011/0171286提到，添加维 生素B、维生素C、微生素E中至少一个的交联透明质酸凝胶表现出比不含添加物的交联透 明质酸凝胶有更大的稳定性。该专利产品成凝胶状态，虽然延展性好，但是可塑形较差，影 响了在整形方面应用。
[0006] 因此，本发明提供一种制备降解周期更长、可塑性强、稳定性好且柔软度高的无菌 可注射材料的方法，来解决上述存在的问题。
【发明内容】
[0007] 本发明提供了一种无菌可注射材料制备方法。
[0008] 透明质酸凝胶是指由交联透明质酸凝胶和自由透明质酸组成的混合物。交联透明 质酸凝胶是指用交联剂交联透明质酸形成的凝胶。自由透明质酸溶液是指透明质酸干粉溶 解于中性生理性等渗磷酸缓冲液或水中形成的溶液，不含交联剂。中性生理性等渗磷酸缓 冲液是指由Na2HP04、NaH2P04和NaCl组成或Na2HP04、KH2P04和NaCl组成构成的pH值为 6. 5-7. 5、渗透压为280-320m0sm〇l/L溶液。交联度是指透明质酸双糖单体结合一个交联剂 分子的百分比，用透明质酸单体与交联剂的摩尔比计算。
[0009] 将平均分子量在1. OMDa-4. OMDa的称为高分子量透明质酸，将0. 2MDa-0. 99MDa的 称为低分子量透明质酸。高分子量透明质酸对延长交联透明质酸凝胶降解周期很重要，低 分子量对交联透明质酸凝胶柔软度很重要，选择合适的比例，对于产品的长效性、柔软度很 关键。
[0010] 一种制备无菌可注射材料的方法，步骤包括：
[0011] 第一步，提供交联透明质酸凝胶：将高分子量透明质酸和低分子量透明质酸干粉 至少3:1(W/W)的比例溶解形成水溶液，碱性条件下渐进添加双功能或多功能的交联剂，添 加总浓度范围是0. 005-0. 05mol/L。然后外力作用下使透明质酸分子垂直方向、水平方向 间歇交错交联，隔一段时间交错进行一次。接着低温自由平衡溶胀分离除去多余的自由交 联剂残，交联透明质酸凝胶中自由交联剂的残留量小于lppm。交联透明质酸凝胶的交联度 是2. 5% -15%，也可以是3% -12%，或者5% -10%，当然，其他适宜的交联度只要满足要 求也是可以的。双功能或多功能的交联剂，比如可以是1，4-丁二醇缩水甘油醚、乙二醇而 缩水甘油酿、1 _乙基_3_ (3-二甲氨基-丙基）-碳二亚胺、二乙烯基讽、聚乙二醇、1，3-二 环氧丁烷、N-羟基琥珀酰亚胺、1，2, 7, 8-二环氧辛烷其中的一种或多种。
[0012] 第二步，将第一步形成的交联透明质酸凝胶低温均质，形成均一微粒。所谓的低温 范围是不高于8°C。可以是液氮温度，也可以在-20-10°C或者-12-8°C，也可以是-4-6°C或 者0-4°C。低温条件可以保证交联透明质酸凝胶和透明质酸分子在均质过程没有受到或者 受到的热所引起不利影响非常小，同时也可以改变其形态。低温后可以采用研磨均质、粉碎 均质、切割均质，或者其他适宜的低温均质方式得到均一的交联透明质酸凝胶微粒，当然， 均质的方式不局限以上几种，其他适宜的均质方式只要满足要求也是可以的。根据需要， 可以将交联透明质酸凝胶均质成能通过27G-32G的注射针的均一颗粒，粒径大小的范围是 40-300 y m，也可以是60-200 y m或者80-120 y m。这样的粒径，可以保证注射时阻力小且柔 软度高，又可以保证可塑性强，易于塑形，且能保证合适的降解周期。
[0013] 第三步是将高分子量透明质酸干粉溶解于中性生理性等渗磷酸缓冲液中形 成自由透明质酸溶液，然后添加水溶性维生素，比如水溶性维生素B、维生素C或维生 素E的衍生物中的一种或多种，添加浓度是0. 01-50mg/ml，也可以是0. l-30mg/ml或者 0.5-20mg/ml。维生素B的衍生物可以硫是辛酸。维生素C衍生物可以是维生素C糖苷 (Ascorbyl-2-glucoside)，比如选用AA2G?。维生素C衍生物可以是维生素C磷酸酯盐，比 如维生素C磷酸酯镁、维生素C磷酸酯钠、维生素C磷酸酯钙。水溶性维生素E衍生物可以 是TPGS，一种叫做天然水溶性维生素E。水溶性维生素的添加，不仅可以提高透明质酸对热 或者辐照的稳定性，如弹性模量G'提高10-300Pa，而且还能起到美白、清除自由基等其他 功效，但是水溶性维生素浓度太高反而会产生其他不利结果。因此，本步骤必须衡量一个平 衡点，将预期想要的和预期避免的结果保留在一个可接受的范围，而且这个范围符合相关 安全要求。将制备的自由透明质酸溶液以1:49-3:7(W/W)比例添加至第二步获得的产物 中，比例还可以是1:24-2:8 (W/W)，其他适宜的比例满足要求也是可以的。接着，在不剪切透 明质酸分子链的机械力作用下混匀，可以使用设备混匀或者用手进行混匀。
[0014] 本步骤中，还可以添加右旋糖酐和/或利多卡因。右旋糖酐对植入部位的血液微 循环起到一定的帮助作用，对减少后遗症会产生有利的帮助，右旋糖酐可以是高分子量右 旋糖酐、中分子量右旋糖酐、低分子量右旋糖酐、小分子量右旋糖酐中的一种或几种，浓度 为1%-10% (W/W)之间。利多卡因的添加，可以在透明质酸产品植入后一段时间提高使用 者的舒适度，减少疼痛感等症状。本发明推荐的利多卡因添加浓度为0.1 %-3% (W/W)，也 可以是0.3%-1% (W/W)，或其他适宜的浓度范围。
[0015] 第四步是将第三步形成的产物进行灭菌。灭菌方式可以是湿热灭菌、环氧乙烷灭 菌、辐照灭菌其中一种或多种组合。湿热灭菌可以是115-130°C、4-30min高压灭菌。辐照 可以是x射线、0射线或y射线辐照灭菌。无论哪一种灭菌方式均不能影响可注射材料 的理化性能，例如降解周期、弹性模量G'、推挤力等性能。
[0016] 本发明提供的无菌可注射材料，浓度为15-35mg/ml，或者为18-30mg/ml，也可以 是20-27mg/ml或者22-25mg/ml，当然，其他适宜的浓度满足要求也是可以的。
[0017] 本方法制备的无菌注射材料，体内降解周期至少在18个月以上，常常能保持 24-36个月，有的甚至36个月以上。无菌注射材料稳定性好，可以在高温加热、辐照或者环 氧乙烷处理后，弹性模量G'有良好的维持效果。此外，无菌注射材料有优良的可塑性与柔 软度，制备工艺简单、易于产业化。
[0018] 本发明提供的无菌注射材料，可应用于软组织填充、修复以及外科手术医疗等。例 如，可以用于非医疗的提高皮肤的美观度、填充或去除皱纹、隆鼻、隆胸，也可以用于医疗外 科手术用的防粘连和骨科关节的润滑。 实施例
[0019] 实施例一：制备交联透明质酸凝胶
[0020] 取3g高分子量透明质酸（1. OMDa)和lg低分子量透明质酸（0. 4MDa)干粉溶解于 50ml、pH 8. 5水溶液，分两次添加1，4- 丁二醇缩水甘油醚进行交联，1，4- 丁二醇缩水甘油 醚终浓度0.001M。交联过程有两次向下压力、两次左右水平的力各作用10分钟。接着中性 生理性等渗磷酸缓冲液在4-8°C条件下溶胀至pH值为7. 2除去未交联的交联剂，交联产物 的交联度是2. 5%。在4-8°C均质化，形成均一的交联透明质酸凝胶微粒，然后分成四等份。
[0021] 实施例二：制备无菌可注射透明质酸凝胶
[0022] 取0. 2g高分子量透明质酸（1. 6MDa)溶解于5ml中性生理性等渗磷酸缓冲液形 成自由透明质酸溶液，添加250mg维生素C磷酸酯镁（MAP)。将制得溶液以1:49的比例添 加至实施例一产物的一份中，然后手动搅拌混匀。130°C、4min湿热灭菌。实施例二制得的 透明质酸凝胶性能参数见表1，其中推挤力是通过一次性注射器带30G的针头、在推挤速度 10. 5mm/min条件下测定的。
[0023]表1.
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