用于pdgf受控释放的纤维蛋白凝胶及其应用的制作方法

专利名称：用于pdgf受控释放的纤维蛋白凝胶及其应用的制作方法
技术领域：
总的来说，本发明涉及含有血小板衍生生长因子(PDGF)的纤维蛋白密封胶 (fibrin sealants)，通过原位可逆结合进行受控释放，用于治疗性应用，包括肌肉骨骼和
血管疾病。
背景技术：
纤维蛋白密封胶是一类外科"胶水"，由人类凝血蛋白制成，典型地在手术过程中 用于控制出血。这些密封胶中的成分在使用过程中相互作用，形成了稳定的由血液蛋白纤 维蛋白构成的凝块。目前，在外科手术中，纤维蛋白密封胶用于几种不同的目的控制外科 医生正在手术的区域中的流血，加速伤口愈合，封闭中空的身体器官或覆盖由标准缝合产 生的孔，向外科手术过程中暴露的组织提供药物的缓释投送。 纤维蛋白密封胶一般由两种人类血浆衍生的成分构成(a)高度浓縮的纤维蛋白 原复合物(FC)，它主要由纤维蛋白原和纤连蛋白以及催化量的因子XIII和纤维溶酶原构 成，以及(b)高效凝血酶。纤维蛋白密封胶也可以含有抑蛋白酶肽。通过凝血酶的作用， (可溶性)纤维蛋白原首先被转变成纤维蛋白单体，它们自发地聚集，形成了所谓的纤维蛋 白凝块。同时，存在于溶液中的因子XIII (FXIII)，在存在钙离子的情况下被凝血酶活化成 因子XIIIa。聚集的纤维蛋白单体和可能存在的任何残余纤连蛋白发生交联，通过形成新 的肽键产生了高分子聚合物。通过这种交联反应，显著增加了形成的凝块的强度。 一般来 说，凝块与伤口和组织表面粘附良好，导致了粘合和止血效应(美国专利7，241，603)。因 此，纤维蛋白粘合剂通常用作双组分粘合剂，它含有纤维蛋白原复合物(FC)组分以及凝血 酶组分，此外还含有钙离子。 纤维蛋白密封胶的特殊优点在于，粘合剂/凝胶不像外来物体一样残留在其施加 位点处，而是被完全再吸收，就像自然伤口愈合中那样，并被新形成的组织代替。各种不同 细胞、例如巨噬细胞和随后的成纤维细胞，迁移到凝胶中，裂解和重新吸收凝胶材料，并形 成新组织。纤维蛋白密封胶已经被用于原位形成纤维蛋白凝胶，这些纤维蛋白凝胶已被用 于投送细胞和生长因子(Cox等，Tissue Eng 10 :942-954， 2004 ;Wong等，Thromb Haemost 89 :573-582,2003)。 对于组织修复来说，需要将生长因子和细胞定位于基质、例如纤维蛋白凝胶中。 例如，纤维蛋白凝胶已被用于在各种不同的复杂混合物中投送TGF-I3，该混合物包含胎 牛血清、珊瑚颗粒和脂质体(Fortier等，Am J Vet Res 58(1) :66-70， 1997 ;Arnaud等， Chirurgie PlastiqueEsthetique 39(4) :491-498，1994 ;Arnaud等，Calcif Tissue Int 54 :493-498，1994 ;Giannoni等，Biotechnology and Bioengineering 83(1) :121-123， 2003)。从纤维蛋白凝胶投送生长因子的可选手段，包括含有转谷酰胺酶底物、抗体和与 生长因子结合的VEGF片段的结合物(参见例如美国专利Nos. 6， 506， 365， US 6， 713， 453和美国专利公布2003/0012818，在此以其全文引为参考)。也可以参见美国专利申请 20030012818，该专利申请描述了用于增进伤口愈合的药物投送基质。此外，已经显示纤维 蛋白凝胶诱导细胞生长(例如人类间充质干细胞(HMSC))和增殖，以及在某种程度上诱导 成骨分化，这取决于基质中FC和凝血酶的浓度(Catelas等，Tissue Eng 12:2385-2396， 2006)。 纤维蛋白密封胶将生长因子投送到身体中的特定位点的能力可能是有益的，但是 组织的适当重新生长，需要向位点以特定的速率持续地/稳定地供应生长因子或细胞因 子，以便确保适合的治疗。在治疗蛋白在体内具有短的半衰期的情况下，尤其是这样。目前 使用的纤维蛋白密封胶，为所播散的药物或药剂提供了一定程度的延迟释放，但是延长药 剂在密封胶中的寿命的能力将改进长期体内组织修复。 因此，在本技术领域中，对于开发用于体内投送治疗各种病症和疾病的生长因子 的有效手段，开发用于生长因子从纤维蛋白凝胶的受控释放的改进的方法，仍然存在着需 求。 发明简述 本发明提供了含有血小板衍生生长因子(PDGF)的纤维蛋白密封胶组合物，通过 生长因子的可逆结合在体外和体内进行受控释放。本发明还提供了通过改变用于配制密封 胶的纤维蛋白原复合物(FC)组分的含量，改变PDGF蛋白从纤维蛋白密封胶中的释放的方 法。为了治疗病症或疾病，考虑到了当PDGF从纤维蛋白密封胶释放后，保留其生物学活性， 使得PDGF可以在体外或体内介导其预期的生物学活性。 —方面，本发明提供了用于改变血小板衍生生长因子(PDGF)蛋白从纤维蛋白密 封胶的释放的方法，所述蛋白选自PDGF-AB和PDGF-BB，其中纤维蛋白密封胶通过将FC组 分、凝血酶组分和PDGF组分相混合而产生，方法包括，a)确定从具有已知PDGF起始量和已 知FC终浓度的第一种纤维蛋白密封胶中释放的PDGF的量，以及b)改变在步骤(a)的第一 种纤维蛋白密封胶中使用的FC的已知终浓度以产生第二种纤维蛋白密封胶，其中第二种 密封胶中FC的浓度与第一种密封胶中FC的已知终浓度相比增加，使得从第二种密封胶释 放PDGF的速率与从步骤(a)的第一种密封胶释放PDGF相比降低了，并且其中第二种密封 胶具有与步骤(a)的第一种密封胶相同的PDGF起始量。 在相关方面，本发明提供了用于改变PDGF蛋白从纤维蛋白密封胶的释放的方法， 所述蛋白选自PDGF-AB和PDGF-BB，其中纤维蛋白密封胶通过将FC组分、凝血酶组分和 PDGF组分相混合而产生，方法包括，a)确定从具有已知PDGF起始量和已知FC终浓度的第 一种纤维蛋白密封胶中释放的PDGF的量，以及b)改变在步骤(a)的第一种纤维蛋白密封 胶中使用的FC的已知终浓度以产生第二种纤维蛋白密封胶，其中第二种密封胶中FC的浓 度与第一种密封胶中FC的已知终浓度相比降低，使得从第二种密封胶释放PDGF的速率与 从步骤(a)的第一种密封胶释放PDGF相比增加了，并且其中第二种密封胶具有与步骤(a) 的第一种密封胶相同的PDGF起始量。 在一个实施方案中，第一或第二种密封胶中FC的终浓度在大约lmg/ml到大约 150mg/ml的范围内。在相关实施方案中，第一或第二种密封胶中FC的终浓度在大约5mg/ ml到大约75mg/ml的范围内。 在另一个实施方案中，考虑到了第一种纤维蛋白密封胶中FC的终浓度与第二种密封胶中FC的终浓度的差别为大约lmg/ml到大约149mg/ml。在另一个实施方案中，第一 种纤维蛋白密封胶中FC的终浓度与第二种密封胶中FC的终浓度的差别为大约5mg/ml到 大约75mg/ml。在另一个实施方案中，第一种纤维蛋白密封胶中FC的终浓度与第二种密封 胶中FC的终浓度的差别为大约10mg/ml到大约60mg/ml。 在某些实施方案中，考虑到了第一或第二种密封胶中凝血酶组分的终浓度在大约 1IU/ml到250IU/ml的范围内。在另一个实施方案中，第一或第二种密封胶中PDGF的终浓 度在大约lng/ml到大约lmg/ml的范围内。 另一方面，本发明考虑到了在需要的患者中受控释放PDGF蛋白的方法，所述蛋 白选自PDGF-AB和PDGF-BB，包括给所述患者施用含有PDGF的纤维蛋白密封胶，其中至少 25%的PDGF在纤维蛋白密封胶中保留至少3天。 在相关方面中，本发明提供了在需要的患者中受控释放PDGF蛋白的方法，所述蛋 白选自PDGF-AB和PDGF-BB，包括给所述患者施用含有PDGF的纤维蛋白密封胶，其中至少 20%的PDGF在纤维蛋白密封胶中保留至少10天。
考虑到了从纤维蛋白密封胶释放的PDGF是有生物活性的。 在某些实施方案中，至少35 %到90 %的PDGF在纤维蛋白密封胶中保留至少3天。 在相关实施方案中，至少45%到75%的PDGF在纤维蛋白密封胶中保留至少3天。在另一 个实施方案中，至少60%的PDGF在纤维蛋白密封胶中保留至少3天。 在另一个实施方案中，至少25%到75X的PDGF在纤维蛋白密封胶中保留至少10 天。在相关实施方案中，至少45X到55X的所述PDGF在纤维蛋白密封胶中保留至少10天。
在相关实施方案中，考虑到了纤维蛋白密封胶可以在3天或10天或两者的时间内 具有上述范围的释放动力学。 在一个实施方案中，纤维蛋白密封胶通过将FC组分与凝血酶组分在混合物中混 合而产生。在另一个实施方案中，在将FC组分与凝血酶组分混合之前，将PDGF加入到FC 组分中。在另一个实施方案中，将PDGF加入到凝血酶组分中。 在相关实施方案中，考虑到了 PDGF的释放可以每天以规则的量减少。例如，纤维 蛋白密封胶中PDGF的量可以以每天大约1%、每天大约2%、每天大约3%、每天大约4%、 每天大约5 % 、每天大约6 % 、每天大约7 % 、每天大约8 % 、每天大约9 %或每天大约10 %的 量减少，或可以根据用于配制纤维蛋白密封胶的FC浓度或凝血酶浓度来调整所需的释放 本发明考虑到了密封胶中FC组分的终浓度在大约lmg/ml到大约150mg/ml的 范围内。也考虑到了在某些实施方案中，密封胶中凝血酶组分的终浓度在大约1IU/ml到 250IU/ml的范围内。在一个实施方案中，FC终浓度是大约5mg/ml 、大约10mg ml 、大约20mg/ ml或大约40mg/ml，凝血酶的终浓度是大约2IU/ml。 在一个实施方案中，密封胶中PDGF的终浓度在大约lng/ml到大约lmg/ml的范围 内。 在另一个实施方案中，考虑到了 PDGF是PDGF-AB。在一个实施方案中，至少60% 的所述PDGF-AB在所述纤维蛋白密封胶中保留至少3天，其中至少40%的所述PDGF-AB在 所述纤维蛋白密封胶中保留至少IO天。在另一个实施方案中，至少80X的所述PDGF-AB在 所述纤维蛋白密封胶中保留至少3天，并且其中至少60%的所述PDGF-AB在所述纤维蛋白密封胶中保留至少10天。 在相关实施方案中，考虑到了 PDGF是PDGF-BB。在一个实施方案中，至少55 %的 所述PDGF-BB在所述纤维蛋白密封胶中保留至少3天，并且其中至少25%的所述PDGF-BB 在所述纤维蛋白密封胶中保留至少10天。 在另一方面，本发明考虑到了用于治疗患者的方法，该患者患有可以得益于PDGF 蛋白的原位受控释放的病症或疾病，所述蛋白选自PDGF-AB或PDGF-BB，所述方法包括给所 述患者施用含有PDGF蛋白的纤维蛋白密封胶，其中纤维蛋白密封胶提供了PDGF的受控释 放，其中至少25X的PDGF在纤维蛋白密封胶中保留至少3天，并且所述PDGF以有效治疗所 述病症或疾病的速率释放。 另一方面，本发明考虑到了用于治疗患者的方法，该患者患有可以得益于生物活 性PDGF蛋白的原位受控释放的病症或疾病，所述蛋白选自PDGF-AB或PDGF-BB，所述方法包 括给所述患者施用含有PDGF蛋白的纤维蛋白密封胶，其中纤维蛋白密封胶提供了 PDGF的 受控释放，其中至少20X的PDGF在纤维蛋白密封胶中保留至少IO天，并且所述PDGF以有 效治疗所述病症或疾病的速率释放。 本发明还提供了使用含有选自PDGF-AB或PDGF-BB的PDGF蛋白的纤维蛋白密封 胶来制造药物，用于治疗患有可以得益于PDGF蛋白的原位受控释放的病症或疾病的患者， 其中纤维蛋白密封胶提供了如上所述的PDGF的受控释放。 本发明考虑到，上述的释放动力学适用于可以得益于PDGF蛋白的原位受控释放
的患者的治疗方法，或适用于使用纤维蛋白密封胶制造治疗所述患者的药物。 —方面，患者所患有的可以得益于PDGF蛋白的体内受控释放的疾病，对于本技术
领域的普通技术人员来说将是明显的。在一个实施方案中，疾病或病症选自肌肉骨骼疾病
或病症、软组织疾病或病症，以及心血管疾病。 在一个实施方案中，使用本技术领域熟知的方法，将纤维蛋白密封胶施用于患者， 例如注射、喷洒、内视镜给药，或预形成的凝胶，以本身或与其它材料的组合，以及本技术领 域的普通技术人员已知的其它方法。 本发明还提供了用于制备含有生物活性PDGF蛋白的纤维蛋白密封胶的试剂盒， 所述蛋白选自PDGF-AB或PDGF-BB，所述纤维蛋白密封胶具有所需PDGF释放速率，试剂盒 包含，a)含有FC组分的第一个小瓶或第一个储存容器，其中小瓶任选含有PDGF组分，以及 b)含有凝血酶组分的第二个小瓶或第二个储存容器，当第一个小瓶或第一个储存容器不包 含PDGF组分时，所述试剂盒任选包含含有PDGF组分的第三个小瓶或第三个储存容器，所述 试剂盒还包含其使用说明书。试剂盒也可以包含体外或体内使用或给药纤维蛋白密封胶的 器械。 从下面的详细描述中，本发明的其它特点和优点将变得明显。但是，应该理解，当 说明本发明的具体实施方案时给出的详细描述和具体实施例，仅仅是为了说明，因为在本 发明的精神和范围内的各种不同的改变和修饰，对于本技术领域的专业人员来说，将因这 些详细描述而变得显然。


图1显示了 PDGF-AB的量对它从TISSEEL VH S/D凝胶中的累积释放的影响([FC]
9=20mg/ml，[凝血酶]=2IU/ml)。 图2显示了 PDGF-BB的量对它从TISSEEL VH S/D凝胶中的累积释放的影响([FC] =20mg/ml，[凝血酶]=2IU/ml)。 图3显示了 FC浓度对PDGF-AB从TISSEEL VH S/D凝胶中的每日释放(图3A)和 累积释放(图3B)的影响([凝血酶]=2IU/ml)。 图4显示了 FC浓度对PDGF-BB从TISSEEL VH S/D凝胶中的每日释放(图4A)和 累积释放(图4B)的影响([凝血酶]=2IU/ml)。 图5显示了 TISSEEL VH S/D批次号对PDGF-AB累积释放的影响([FC] = 20mg/ ml，[凝血酶]=2IU/ml)。 图6显示了 TISSEEL VH S/D批次号对PDGF-BB累积释放的影响([FC] = 20mg/ ml，[凝血酶]=2IU/ml)。 图7显示了 PDGF-BB的量对它从TISSEEL VH凝胶中的累积释放的影响([FC]= 20mg/ml，[凝血酶]=2IU/ml)。 图8显示了 FC浓度对PDGF-BB从TISSEEL VH凝胶中的每日释放(图8A)和累积 释放(图8B)的影响([凝血酶]=2IU/ml)。 图9显示了 TISSEEL VH批次号对PDGF-BB累积释放的影响([FC] = 20mg/ml，[凝 血酶]=2IU/ml)。 图10显示了 PDGF-AB从TISSEEL VH S/D凝胶的释放对培养在单层中最多7天的 HMSC增殖的影响。 图11显示了 PDGF-BB从TISSEEL VH S/D凝胶的释放对培养在单层中最多7天的 HMSC增殖的影响。 图12显示了从TISSEEL VH S/D凝胶释放的PDGF-AB对ALP活性的影响(根据增 殖进行归一化)。 图13显示了从TISSEEL VH S/D凝胶释放的PDGF-BB对ALP活性的影响(根据增 殖进行归一化)。 图14显示了 PDGF-AB (图14A)和PDGF-BB (图14B)与来自TISSEEL VH S/D的FC 相互作用的传感图。图14C显示了 PDGF-AB与来自TISSEEL VH S/D的FC相互作用的结合 和解离速率常数的图解测定。
发明详述 本发明提供了含有PDGF的纤维蛋白凝胶，通过原位可逆结合进行受控释放，用于 治疗性应用中，包括肌肉骨骼疾病、软组织病症和血管疾病的治疗。本发明考虑到了从凝胶 释放的PDGF保留其生物学活性，使得在体内或体外从纤维蛋白密封胶的释放调节了所需 的生物学活性。本发明还提供了用于确定可用于配制纤维蛋白密封胶、以获得所需PDGF释 放动力学的FC组分或凝血酶组分的浓度的方法。 除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语，都与本发明所属技术领 域的普通专业人员所通常理解的意义相同。下面的参考文献，为专业技术人员提供了许多 在本发明中使用的术语的通用定义Singleton等，《微生物学和分子生物学词典》(1994 年第二版)(DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2d ed.1994));《剑 桥科学技术词典》(THE CAMBRIDGEDICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY) (Walker等，1988);《遗传学词汇》(第五版)(THE GLOSSARY OF GENETICS, 5TH ED.) ， R. Rieger等主 编，Springer Verlag(1991);以及Hale和Marham，《HARPER COLLINS生物学词典》(THE HARPERCOLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY) (1991)。 在本文中引用的每个出版物、专利申请、专利和其它参考文献，在其与本公开相一 致的程度上全文引为参考。 在这里指出，在本说明书和随附的权利要求书中使用的不带数量的名词形式，包 含了复数的指称，除非上下文清楚地表明不是这样。 在本文中使用时，下面的术语具有属于它们的意义，除非特别指明不是这样。
本文中使用的术语"纤维蛋白密封胶"、"纤维蛋白凝胶"、"纤维蛋白粘合剂"、"纤 维蛋白凝块"或"纤维蛋白基质"可以相互交换使用，是指至少含有纤维蛋白原复合物(FC) 组分和凝血酶组分的三维网络，它们可以用作细胞生长和生物活性材料随时间释放的支 架。 本文使用的术语"受控释放"和"延迟释放"具有同样的意义，是指药剂(例如生 长因子)在纤维蛋白凝胶中的持留。受控释放不仅是由于生长因子通过扩散或通过被结合 的生长因子的解离、然后从凝胶中释放，而缓慢和稳定地分泌/释放，而且还由于基质的解 体和酶促裂解。 本文中使用的"原位形成"是指或者在生理温度下和在注入身体的位点处形成， 或者纤维蛋白密封胶在适合的体外条件下形成。典型情况下，该术语用于描述纤维蛋白密 封胶中前体分子之间的共价连接的形成，这些前体分子在给药前或给药时是基本上未交联 的。 本文中使用的"纤维蛋白原复合物(FC)组分"是指与凝血酶混合时产生凝块状 纤维蛋白密封胶的纤维蛋白/纤维蛋白原溶液。FC主要由纤维蛋白原和纤连蛋白构成， 也可以包含催化量的FXIII和纤维溶酶原。FC组分也可以被称为密封剂蛋白(Sealer Protein)。 本文中使用的"凝血酶组分"是指与FC组分混合时产生凝块状纤维蛋白密封胶的 凝血酶溶液。 本文中使用的"血小板衍生生长因子组分"或"PDGF组分"是指向液体形式的纤 维蛋白密封胶添加的生长因子溶液。PDGF组分、FC复合物组分和凝血酶组分中的每一种， 可以分别添加，以形成含有PDGF的纤维蛋白密封胶。任选，PDGF组分在与凝血酶组分混合 之前添加到FC组分中，或在与FC组分混合之前添加到凝血酶组分中。PDGF组分可以包含 PDGF-AB或PDGF-BB，或PDGF-AB和PDGF-BB两者。 本文中使用的"重组人类PDGF"是指通过重组DNA技术获得的重组的人类血小板 衍生生长因子(rh PDGF)。它可以通过本技术领域任何已知方法来生产。
本文中使用的术语"生物活性"或"生物学活性"，是指其中溶液中或纤维蛋白密封 胶中的蛋白，例如PDGF蛋白，当与天然表达的(即当重组表达或体内表达时)蛋白相比时， 显示出同样的或类似的生物学活性的生物学性质。 本文中使用的"可检测的部分"、"可检测标记物"或"标记物"，是指可以通过光谱 学、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段检测的组合物。例如，有用的标记物包括32P、 弋、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如在ELISA中常用的)、生物素_链亲和素、洋地黄毒甙、其抗血清或单克隆抗体可得的半抗原和蛋白，或具有与靶互补的序列的核酸分子。可检 测部分通常产生可测量的信号，例如放射活性、显色或荧光信号，可用于对样品中结合的可 检测部分的量进行定量。
纤维蛋白密封胶 已有许多形式的纤维蛋白用作纤维蛋白密封胶。纤维蛋白凝胶可以从自体血浆、 冷沉淀血浆(例如纤维蛋白胶试剂盒，可以商购)、从血浆纯化的纤维蛋白原、以及重组纤 维蛋白原和因子XIIIa合成。这些材料中的每种都提供了基本上相同的基质，在生物化学 组成上有少许差别(Sierra DH，J Biomater A卯l， 7， 309-352 (1993))。这些材料之间在特 定酶学生物活性和总的愈合应答方面存在相似性。 可用于本发明的纤维蛋白凝胶从纤维蛋白密封胶形成，它由两种主要组分构成 纤维蛋白原复合物(FC)和凝血酶。FC主要由纤维蛋白原和纤连蛋白构成，也可以含有催化 量的FXIII和纤维溶酶原。FC和凝血酶组分一般源自于人类血桨，但是也可以由重组/遗传 工程技术生产。纤维蛋白密封胶的例子描述在US 5，716，645、US 5， 962， 405、US6， 579， 537 中，包括TISSEEL VH和TISSEEL VH S/D (Baxter AG， Vienna, Austria)。
为了形成纤维蛋白凝胶，首先将FC复溶、融化或按照包装说明书制备，根据需要 使用稀释缓冲液进一步稀释，将治疗药剂加入到液体FC中。可选地，治疗药剂可以加入到 凝血酶组分中。大多数可商购的纤维蛋白密封胶包含凝胶裂解抑制剂，例如抑蛋白酶肽，它 们可以由用户自行斟酌添加到FC中。关于抑蛋白酶肽和其它凝胶裂解抑制剂的描述，提供 在W0 99/11301中。凝血酶组分也用CaCl2溶液复溶成液体形式，并根据需要使用稀释缓冲 液进一步稀释。考虑到了将凝血酶组分与还含有PDGF的FC组分混合，以形成纤维蛋白凝 胶。纤维蛋白密封胶也被设计成缺乏抑蛋白酶肽成分(EVICEL，Ethicon，Inc，NewJersey)。
其它用于生产含有纤维蛋白原的、可以用作组织粘合剂的制备物的方法，包括从 冷沉淀物生产，任选具有使用乙醇、硫酸铵、聚乙二醇、甘氨酸或P -丙氨酸的进一步洗涤 和沉淀的步骤，以及分别从已知血浆分级方法范围内的血浆生产(参考例如《血浆蛋白分 级方法》(Methods of plasma protein fractionation) ， 1980， Curling主编，Academic Press，第3-15、33-36和57-74页，或Blomb ck B.和M.，《人和牛纤维蛋白原的纯化》 (Purification of human and bovine fibrinogen)，Arkiv Kemi 10，1959，p.415 f.)。纤 维蛋白密封胶也可以使用患者自己的血浆制造。例如，CRYOSEAL(Thermogenesis Corp.， Rancho Cordova, CA)或VIV0STAT(Vivolution A/S， Denmark)纤维蛋白密封胶系统，能够 从患者的血浆生产自体纤维蛋白密封胶组分。可用的纤维蛋白密封胶组分是冷冻干燥、深 冻液体或液体的形式。 以适合的浓度加入纤维蛋白凝胶组分，提供了所需的受控释放的类型。可以以不 同的浓度添加FC组分，包括但不限于5mg/ml， 10mg/ml， 15mg/ml， 20mg/ml， 25mg/ml， 30mg/ ml ， 35mg/ml ， 40mg/ml ， 45mg/ml ， 50mg/ml ，直到150mg/ml (凝胶中的终浓度)，或需要的中间 浓度。此外，FC组分的浓度可以与任何适合浓度的凝血酶组分混合，包括但不限于lIU/ml， 2IU/ml， 5IU/ml， 7IU/ml，10IU/ml，15IU/ml， 20IU/ml， 25IU/ml， 30IU/ml， 35IU/ml， 40IU/ml， 50IU/ml，60IU/ml，70IU/ml，80IU/ml，90IU/ml，100IU/ml，125IU/ml，150IU/ml，175IU/ml， 200IU/ml，225IU/ml和250IU/ml，或需要的中间浓度。 考虑到了将药剂例如PDGF添加到纤维蛋白密封胶组合物中，以便制造用于治疗
12药剂的受控释放系统。PDGF可以以提供足够延迟释放剂型的任何浓度添加，在lng/ml到 lmg/mL PDGF的范围内。纤维蛋白密封胶中PDGF的示例浓度包括但不限于lng/ml，5ng/
ml， 10ng/ml， 15ng/ml， 20ng/ml， 40ng/ml， 50ng ml， 100ng/ml， 250ng/ml， 500ng/ml， lug.
ml， 5 li g/ml， 10 li g/ml， 25 u g/ml， 50 u g/ml， 100 u g/ml， 250 u g/ml， 500 u g/ml， 750 u g/ml 考虑到了在纤维蛋白密封胶中使用的FC或凝血酶的浓度是使得添加在纤维蛋白 凝胶中的PDGF，以治疗有效的量在几天到数周的过程中释放。 一种情况下，PDGF从纤维蛋 白凝胶中释放1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14 天、15天、16天、17天、18天、19天、20天或更长时间。 PDGF以受控或延迟释放的方式从纤维蛋白密封胶释放，使得可以在持续的时间中 可以原位获得PDGF。考虑到了 PDGF的释放可以以每天规则的量减少，例如PDGF水平的降 低可以为每天大约1 % 、每天大约2 % 、每天大约3 % 、每天大约4 % 、每天大约5 % 、每天大约 6%、每天大约7%、每天大约8%、每天大约9%、每天大约10%或以上。
在相关的实施方案中，考虑到了至少25X的PDGF在纤维蛋白凝胶中保留至少3 天。在另一个实施方案中，至少35 %到90 % ，至少45 %到75 % ，或至少60 %的PDGF在纤维 蛋白凝胶中保留至少3天。还考虑到了至少25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、 33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41 %、42%、43%、44%、45%、46%、47%、 48%、49%、50%、51 %、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61 %、62%、 63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71 %、72%、73%、74%、75%、76%、77%、 78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%或90 %的PDGF在纤 维蛋白凝胶中保留至少3天。 在另一个实施方案中，至少20X的PDGF在纤维蛋白凝胶中保留至少IO天。在另 一个实施方案中，至少25 %到75 % ，或45 %到55 %的PDGF保留至少10天。还考虑到了至 少20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、 35% 、36% 、37% 、38% 、39% 、40% 、41% 、42% 、43% 、44% 、45% 、46% 、47% 、48% 、49%、 50%、51 % 、52% 、53% 、54% 、55% 、56% 、57% 、58% 、59% 、60% 、61 % 、62% 、63% 、64%、 65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%或75%的PDGF在纤维蛋白凝胶 中保留至少10天。 本发明提供了通过改变纤维蛋白密封胶的组分的浓度，配制具有所需释放动力学 的纤维蛋白密封胶的方法。在一方面，方法考虑到了确定从具有已知PDGF起始量和已知FC 终浓度的第一种纤维蛋白密封胶中释放的PDGF的量，改变在步骤(a)的第一种纤维蛋白密 封胶中使用的FC的已知终浓度以产生第二种纤维蛋白密封胶、，其中第二种密封胶中FC的 浓度与第一种密封胶中FC的已知终浓度相比的增加或减少，与PDGF从步骤的第一种密封 胶释放相比，调整了PDGF从第二种密封胶释放的速率，并且其中第二种密封胶具有与步骤 中第一种密封胶相同的PDGF起始量。 在一个实施方案中，第一或第二种密封胶中FC的终浓度，在大约lmg/ml到大约 150mg/ml的范围内。在相关实施方案中，第一种纤维蛋白密封胶的FC浓度与第二种密封胶 中FC的终浓度的差别为大约lmg/ml到大约149mg/ml，为大约5mg/ml到大约75mg/ml，或为 大约10mg/ml到大约60mg/ml。在另一个实施方案中，第一种纤维蛋白密封胶的FC终浓度与第二种密封胶的FC终浓度的差别为大约lmg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、10mg/ ml 、 15mg/ml 、20mg/ml 、25mg/ml 、30mg/ml 、35mg/ml 、40mg/ml 、45mg/ml 、50mg/ml ，或这些浓度 之间的任何量，直到大约149mg/ml。 考虑到了可用于本发明的纤维蛋白密封胶可以与目的在于体外或体内应用的其 它材料或药剂混合。这样的药剂包括其它的治疗性药剂，包括但不限于生长因子、细胞因 子、化学因子、凝血因子、酶、化学因子、可溶性细胞表面受体、细胞粘附分子、抗体、激素、细 胞骨架蛋白、基质蛋白、蛋白伴侣、结构蛋白、代谢蛋白，以及本技术领域已知的其它药剂 (参见例如《医生桌面参考》(第62版)(PhysiciansDesk Reference, 62nd Edition) ， 2008， Thomson Healthcare, Montvale， NJ)。 其它可用于纤维蛋白密封胶的材料包括可以与密封胶混合用于肌肉骨骼疾病 的材料，它们可以是承载材料，包括但不限于聚合物、珊瑚、陶瓷、玻璃、金属、骨骼衍生 的材料、羟基磷灰石、合成的支架材料、这些材料的组合，以及本技术领域已知的其它材 料(参见例如Guehennec等(European Cells and Materials, 8 :1-11， 2004)，美国专利 7， 122， 057和美国专利6， 696， 073)。 在一个实施方案中，纤维蛋白凝胶可以用作载体系统，用于在可逆结合后、并通过 调整FC和凝血酶的浓度以受控方式投送生物学活性PDGF。 在本发明的一个实施方案中，当纤维蛋白凝胶使用5mg/ml的FC和2IU/ml的凝血 酶(凝胶中的终浓度)由TISSEEL蒸汽加热溶剂/去污剂(TISSEEL VH S/D)制成时，至少 大约65X的添加的PDGF-BB(15ng)在凝胶中保留到3天后。在本发明的另一个实施方案 中，当纤维蛋白凝胶使用40mg/ml的FC和2IU/ml的凝血酶(凝胶中的终浓度)由TISSEEL VH S/D制成时，至少大约85X的添加的PDGF-BB(15ng)在凝胶中保留到3天后。因此，当 使用由TISSEEL VH S/D制成的纤维蛋白凝胶时，PDGF-BB的持留随着FC浓度的升高而增 加。 在本发明的另一个实施方案中，当纤维蛋白凝胶使用20mg/ml的FC和2IU/ml的 凝血酶(凝胶中的终浓度)由不同批号的TISSEEL VH制成时，至少大约70X的PDGF-BB在 来自一个批号的凝胶中保留到10天后，在第二个批号的凝胶中有大约60%、第三个批号的 凝胶中有大约40%保留。这些批次之间的一个差别是因子XIII的含量(分别为42. 2U/ml、 33. 9U/ml和< 1U/ml)。在本发明的另一个实施方案中，当纤维蛋白凝胶使用20mg/ml的FC 和2IU/ml的凝血酶(凝胶中的终浓度)由不同批号的TISSEEL VH S/D制成时，至少大约 60%的PDGF-BB在来自所有批次的凝胶中保留到10天后。对于PDGF-AB的释放来说，在三 批中的两批中，至少大约75%保留到10天，至少68%的生长因子在第三批中保留到10天。
对于本技术领域的普通专业人员来说，应该理解，上面提出的实施方案是PDGF从 可商购纤维蛋白密封胶释放的示例性实施方案，并不意味以任何方式限制了本发明。
PDGF蛋白 血小板衍生生长因子(PDGF)由血小板在伤口和骨折愈合的早期阶段中分泌。已 经显示，它能剌激成骨细胞和间充质祖细胞的迁移(Mehrotra等，J Cell Biochem 93: 741-52,2004 ;Fiedler等，J CellBiochem 93 :990-98， 2004)，但是它在骨折愈合和骨骼修 复中的作用还没有完全确定。PDGF也调控血管发生的不同方面，血管发生本身在骨骼生长 过程中也是关键的。PDGF还在剌激血管发生中发挥作用，血管发生是组织的正常生长和发育所需的基本过程，并参与从已存在血管增殖新的毛细血管。增加血管发生的速率在某些 病症中是有用的，例如与组织灌注减少相关的病症，例如冠状动脉和外周血管疾病，这仅仅 是举几个例子。PDGF-A (Genbank登记号NP_002598)和PDGF-B (Genbank登记号NP_002599)可 以同源二聚或异源二聚，产生三种不同的同工型PDGF-AA、 PDGF-AB或PDGF-BB。 PDGF-A 只能与PDGFa -受体结合(PDGFR-a包括PDGFR-a/a同源二聚体)。PDGF-B可以与 PDGFR-a和第二种PDGF受体(PDGFR-P)结合。更具体来说，PDGF-B可以与PDGFR-a / a 和PDGFR-P/e同源二聚体、以及PDGFR-a/p异源二聚体结合。 PDGF-AA和_BB对于间充质来源的细胞来说是主要的有丝分裂原和化学吸引剂， 但是对于内皮谱系的细胞没有影响或影响很小，尽管PDGFR-a和-p 二者都表达在内皮细 胞(EC)上。已经显示，PDGF-AB和PDGF-BB参与新形成血管的稳定化/成熟作用(Isner等， Nature415 :234-9,2002 ;Vale等，J Interv Cardiol 14 :511-28， 2001 ;Heldin等，Physiol Rev 79 :1283-1316， 1999 ;Betsholtz等，Bioessays 23:494-507,2001)。然而，其它数据 显示，PDGF-AA和PDGF-BB在体内通过PDGFR- a信号传导，抑制了 bFGF诱导的血管生成。 PDGF-AA是间充质细胞迁移的最有力剌激物之一，但是它或者不剌激或者仅最小程度地剌 激EC迁移。在某些条件下，PDGF-AA甚至抑制EC迁移(Thommen等，J Cell Biochem. 64 : 403-13,1997 ;De Marchis等，Blood 99 :2045-53,2002 ;Cao等，FASEB. J. 16 :1575-83， 2002)。然而，已经显示，PDGFR-a拮抗PDGFR-P诱导的SMC迁移(Yu等，Biochem. Biophys. Res. Commun. 282 :697-700， 2001)，针对PDGF-AA的中和抗体增强了平滑肌细胞(SMC)的迁 移(Palumbo， R.等，Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 22 :405-11,2002)。因此，PDGF-A 和-B的血管生成/动脉生成活性，特别是当通过PDGFR-a进行信号传导时，还有争论。
已报道，PDGF-AA和_BB在心血管和神经干/祖细胞的增殖和分化中发挥重要作 用。PDGF-AA通过a v|3 3整联蛋白剌激少突胶质细胞前体增殖(Baron等，Embo. J. 21 : 1957-66， 2002)，而PDGF-BB诱导Flkl+胚胎干细胞分化成血管壁细胞(Carmeliet， P.， Nature 408 :43-45,2000 ;Yamashita等，Nature 408 :92-6， 2000)，并潜在增加了源自于存 活神经元的神经球(neurosphere) (Caldwell等，Nat Biotechnol. 19 :475-479,2001)。
PDGF蛋白已经成功地混合用于纤维蛋白凝胶制剂中。Thomopoulous等(J Orth Res 25:1358-68,2007)制备了含有纤维蛋白原、凝血酶、肽组分和肝素的纤维蛋白凝胶， 并进一步添加了不同浓度的PDGF-BB，以确定生长因子的被动释放动力学。研究显示，生长 因子的释放依赖于纤维蛋白凝胶中肝素的量。PDGF也已经在含有血浆血小板T制备物的纤 维蛋白凝胶中检测到(参见例如Yazawa等，JCraniofac Surg 15 :439-46， 2004)，并用于剌 激纤维蛋白支架中的胚胎干细胞(Willerth等，Stem Cells. 25 :2235-2244,2007)。
可用于本发明的PDGF分子包括全长蛋白、蛋白前体、蛋白亚基或片段、及其功能 性衍生物。指称PDGF意味着包括这些蛋白的所有可能形式，包括天然来源的蛋白制备物。
根据本发明，术语重组PDGF没有隐含具体的限制，可以包括任何PDGF，异源的或 天然存在的，通过重组DNA技术获得的，或其生物学活性衍生物。在某些实施方案中，该术 语涵盖了蛋白和核酸，例如基因、前mRNA、mRNA，以及多肽、多态性变异体、等位基因、突变体 和种间同源物，它们(1)具有的氨基酸序列，在至少大约25、50、100、150、200个或以上氨基 酸的区域中，与参比核酸编码的PDGF-AB或PDGF-BB多肽或本文描述的氨基酸序列，具有
15高于大约60%的氨基酸序列同一性，65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%，93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或以上的氨基酸序列同一性；(2)与针对含有本文描述的参比氨基酸序列、其免疫原性片段及其保守修饰变异体的免疫原产生的抗体、例如多克隆抗体，特异性结合；(3)在严紧杂交条件下，与编码本文描述的参比氨基酸序列及其保守修饰变异体的核酸特异性杂交；(4)具有的核酸序列，在至少大约25、50、100、150、200、250、500、1000、1500、2000个或以上核苷酸(最多为成熟蛋白的核苷酸全长序列)的区域内，与本文描述的参比核酸序列具有高于大约95 % 、高于大约96% 、97 % 、98% 、99 % ，或更高的核苷酸序列同一性。 多核苷酸或多肽序列典型情况下来自于哺乳动物，包括但不限于灵长动物例如人类，啮齿动物例如大鼠、小鼠、仓鼠，奶牛、猪、马、绵羊或任何其它哺乳动物。本发明的核酸和蛋白可以是重组分子(例如异源的和编码野生型序列或其变异体的，或非天然存在的)。对于人类PDGF的结构，参考由国家生物技术信息中心(National CenterforBiotechnology Information, NCBI)维护的Genbank数据库人类PDGF-A (Genbank登记号NP_002598， NM_002607. 4) ， PDGF-B (Genbank登记号NP_002599， NM_002608) 。 PDGF-AB和PDGF-BB是PDGF-A和PDGF-B序列的同源或异源二聚体。 PDGF的生产可以包括本技术领域中已知的任何用于下述方面的方法(i)通过遗传工程生产重组DNA，例如通过RNA的反转录和/或DNA的扩增，(ii)通过转染将重组DNA导入原核或真核细胞，例如通过电穿孔或微注射，(iii)以例如连续或分批方式培养所述转化细胞，(iv)表达PDGF，例如组成性地或在诱导后，以及(v)分离所述PDGF，例如从培养基或通过收获转化细胞，以便通过例如阴离子交换层析或亲和层析获得纯化的PDGF。
PDGF可以通过在适合的原核或真核宿主系统中进行表达来生产，这些宿主系统的特点是生产可药用的PDGF分子。常用的宿主细胞包括原核细胞例如革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌，即任何大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Str印tomyces)、酵母菌属(Saccharomyces)、沙门氏菌属(Salmonella)等的菌株。真核细胞的例子是昆虫细胞例如D. Mel-2、Sf4、Sf5、Sf9，以及Sf21和High 5 ;植物细胞和各种不同酵母细胞例如酵母菌属(Saccharomyces)和毕赤氏酵母属(Pichia);哺乳动物细胞例如CHO(中华仓鼠卵巢)细胞，幼仓鼠肾(朋K)细胞，人类肾293细胞，C0S-7细胞，HEK 293， SK-H印和H印G2，以及其它本技术领域已知的细胞。对用于生产或分离本发明的PDGF的试剂或条件没有限制，可以使用本技术领域已知的或可商购的任何系统。在本发明的优选实施方案中，PDGF通过在现有技术中描述的方法获得。 许许多多的载体可用于制备PDGF，它们可以从本技术领域众所周知的真核和原核表达载体中选择。用于原核表达的载体的例子包括但不限于质粒，例如pRSET、 pET、 pBAD等，其中在真核表达载体中使用的启动子包括lac、trc、trp、recA、araBAD等。用于真核表达的载体的例子包括但不限于(i)用于在酵母中表达的载体，例如pAO、pPIC、pYES、pMET，使用了启动子例如A0X1、GAP、GAL1、AUG1等；(ii)用于在昆虫细胞中表达的载体，例如pMT、pAc5、 pIB、 pMIB、 pBAC等，使用了启动子例如PH、 p10、 MT、 Ac5、 OpIE2、 gp64、 polh等，以及(iii)用于在哺乳动物细胞中表达的载体，例如pSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3、pBPV等，以及源自于病毒系统例如痘苗病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、反转录病毒等的载体，使用了启动子例如CMV、 SV40、 EF-1、 UbC、 RSV、 ADV、 BPV和P -肌动蛋白启动子。
16
含有编码多肽的DNA或RNA的宿主细胞，在适合于细胞生长并表达DNA或RNA的
条件下进行培养。表达多肽的那些细胞可以使用已知的方法鉴定，重组蛋白可以使用已知
的方法分离和纯化；对多肽生产可以扩增，也可以不扩增。鉴定可以通过例如筛选表现出指
示了编码蛋白的DNA或RNA存在的表型的遗传修饰的哺乳动物细胞来进行，例如PCR筛选，
通过Southern印迹分析进行筛选，或筛选蛋白的表达。可以通过在DNA构建物中包含选择
性标记物，并将含有选择性标记物基因的转染或感染细胞，在只适合于表达选择性标记物
基因的细胞存活的条件下进行培养，来实现已掺入编码蛋白的DNA的细胞的筛选。导入的
DNA构建物的进一步扩增，可以通过将遗传修饰的细胞在适合于扩增的条件下培养来进行
(例如，将含有可扩增标记物基因的遗传修饰细胞，在存在一定浓度的药物的情况下进行培
养，在该药物浓度下，只有含有可扩增标记物基因的多个拷贝的细胞能够存活)。 在本发明的一个实施方案中，测试了从纤维蛋白凝胶释放的PDGF的生物学活性。
人类间充质干细胞(HMSC)在来自添加有PDGF的凝胶的培养基上清液中(即在含有释放
的PDGF-BB的培养基中)培养成单层后，形态转变成更细长的形状，以及细胞增殖增加的趋
势，都指示了释放的生长因子的生物学活性。 确定样品中蛋白浓度的方法 治疗性蛋白，由于它们与内源产生的、天然存在的蛋白的相似性，通常难以在血清 样品中进行检测。但是，测定已经给药的治疗性多肽、其片段、变异体或类似物的量，以评估 治疗性蛋白是否显示出所需特征，例如较大的溶解性或稳定性、对酶消化的抗性、改善的生 物学半衰期、以及本技术领域的专业人员已知的其它特点，通常是有益的。方法还可以检测 可能受到知识产权保护的治疗性蛋白的授权使用。 本发明使用了方法来检测PDGF从含有PDGF的纤维蛋白凝胶的释放，并测定了蛋 白的释放动力学。这些来自用不同浓度的FC组分制造的纤维蛋白密封胶的释放动力学的 比较，有助于确定治疗性目的所需的释放速率。鉴定蛋白随时间从纤维蛋白密封胶中释放 的量的能力，帮助在半衰期、吸附性、稳定性等的基础上确定最适治疗剂。检测分析方法可 以是酶联免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、闪烁亲近分析(SPA)、表面等离子体 共振(SPR)，或其它本技术领域已知的结合分析方法。 —般来说，为了检测样品中PDGF的存在，将PDGF与PDGF结合剂进行结合，例如抗 体、可溶性受体或其它结合PDGF的蛋白或试剂。 对于生物学活性的检测步骤或测试来说，可以将PDGF蛋白与可检测部分或可检 测标记物连接。可检测的部分或标记物是指可以通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学 或化学手段检测的成分。可检测部分通常产生可测量的信号，例如放射活性、显色或荧光信 号，它们可用于对样品中结合的可检测部分的量进行定量。可检测部分可以共价地、或通过 离子键、范德华力或氢键掺入蛋白或与蛋白结合，例如掺入放射活性核苷酸，或链亲和素识 别的生物素化的核苷酸。可检测部分可以是可直接或间接检测的。间接检测可以包括将第 二个可直接或间接检测的部分与可检测的部分结合。例如，可检测部分可以是结合配偶体 的配体，例如生物素，它是链亲和素的结合配偶体。结合配偶体本身可以是可直接检测的， 例如，抗体可以用荧光分子进行标记。信号定量方法的选择可以通过例如闪烁计数、密度计 量、或流式细胞术来实现。 适合用于本发明的分析方法的标记物的例子包括放射活性标记物、荧光团、电子致密试剂、酶(例如在ELISA中常用的)、生物素、洋地黄毒甙，或半抗原以及蛋白，所述半抗 原以及蛋白可以例如通过将放射性标记物掺入半抗原或肽被制造成可检测的，或用于检测 与半抗原或肽特异性反应的抗体。还考虑到了其抗血清或单克隆抗体可以获得的蛋白，或 具有与靶互补的序列的核酸分子，纳米标签(nanotag)，分子量珠子，磁性试剂，含有荧光染 料的纳珠或微珠，量子点，量子珠，荧光蛋白，带有荧光标记物的树枝状聚合物，微转应答器 (micro-transponder)，电子供体分子或分子结构，或光反射颗粒。 考虑到的其它可用于本发明的标记物包括但不限于荧光染料(例如荧光素异硫 氰酸酯，德克萨斯红，罗丹明等)，放射性标记物(例如3H、125I、35S、14C或32P)，酶(例如辣 根过氧化物酶，以及其它在ELISA中常用的酶)，以及比色标记物例如胶体金、有色玻璃或 塑料珠(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)，和发光或化学发光标记物(例如铕(Eu)、MSD Sulfo-Tag)。 标记物可以按照本技术领域熟知的方法直接或间接与所需的分析组分偶联。在具 体实施方案中，标记物与组分共价结合，使用异氰酸酯或N-羟基琥珀酰亚胺酯试剂来结合 本发明的活性药剂。在本发明的一种情况下，使用双官能异氰酸酯试剂将标记物结合到生 物聚合物上，形成标记物生物聚合物结合物，其上没有结合活性药剂。标记物生物聚合物结 合物可以用作中间体，用于合成本发明的标记的结合物，或可用于检测生物聚合物结合物。 正如上面指出的，可以使用广泛的各种标记物，标记物的选择取决于所需的灵敏度，与所需 分析组分结合的容易性，稳定性要求，可用的仪器设备，以及废弃规定等。非放射活性标记 物通常通过间接方式结合。 一般来说，配体分子(例如生物素)被共价结合到分子上。然 后将配体与另一个分子(例如链亲和素)结合，该另一个分子或者是本身可检测的，或者与 信号系统共价结合，例如可检测的酶、荧光化合物或化学发光化合物。 可用于本发明的方法的化合物也可以直接与信号产生化合物结合，例如通过与酶 或荧光团结合。适合用作标记物的酶包括但不限于水解酶，特别是磷酸酶、酯酶和糖苷酶， 或氧化酶(oxidotase)，特别是过氧化物酶。适合用作标记物的荧光化合物包括但不限于 上面列出的，以及荧光素衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰、伞形酮、曙红、TRITC胺、奎宁、 荧光素W、吖啶黄、丽丝胺罗丹明、B磺酰氯erythroscein、钌(三、二吡啶鎗)、铕、德克萨 斯红、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、黄素腺嘌呤二核苷酸等。适合用作标记物的化学发光化合 物包括但不限于MSD Sulfa-TAG、铕(Eu)、钐(Sm)、萤光素和2， 3-二氢酞嗪二酮，例如鲁 米诺。对于可用于本发明方法的各种不同的标记和信号产生系统的综述，参见美国专利 No. 4， 391， 904。 用于检测标记物的手段对于本技术领域的专业人员来说是熟知的，取决于待检测 的标记物的类型。因此，例如，当标记物是放射活性时，检测手段包括闪烁计数器(例如放 射免疫分析，闪烁亲近分析)(Pitas等，Drug Metab Dispos. 34 :906-12,2006)或照相底 片，如同在放射自显影中那样。当标记物是荧光标记物时，它的检测可以通过用适当波长的 光激发荧光团，并检测产生的荧光(例如ELISA，流式细胞术，或本技术领域已知的其它技 术)。荧光可以通过使用电子检测器例如电荷耦含器件(CCDs)或光电倍增器等目测检测。 同样地，酶标记物可以通过提供适合的酶的底物，并检测得到的反应产物来检测。比色或化 学发光标记物可以简单地通过观察与标记物相关的颜色来检测。其它适合用于本发明的方 法的标记和检测系统，对于本技术领域的专业人员来说是显而易见的。如此标记的介导物
18和配体可用于疾病或健康状况的诊断中。 方法任选包括至少一个或多个清洗步骤，其中在测量蛋白结合之前对结合的PDGF组合物进行洗涤，以减少由未结合的多肽引起的背景测量值。在多肽组合物温育后以及检测PDGF前PDGF的洗涤，在适当的缓冲液加去污剂中进行。适合的去污剂包括但不限于烷基二甲基胺氧化物，烷基葡萄糖苷，烷基麦芽糖苷，烷基硫酸盐(例如十二烷基硫酸钠(SDS))， NP-40，烷基硫代葡萄糖苷，甜菜碱，胆汁酸，CHAP系列，毛地黄皂苷、葡萄糖酰胺，卵磷脂/溶血卵磷脂，非离子性基于聚氧乙烯的去污剂、包括TRITON-X，聚山梨酸酯
例如TWEEN⑧20和TWEEN⑧80、 BRIJ 、 GENAPOL⑧.和THESIT⑧，季铵化合物
等。也可以参见《蛋白质科学现代方法》附录IB的增补11 (Current Protocolsin ProteinScience, Appendix 1B， S聊l. 11,1998， John Wiley禾口 Sons, Hoboken， NJ)。合适的去污剂可以使用常规的实验方法来确定(参见Neugebauer， J.，《生物学和生物化学中去污剂的性质与应用指南》AGuide to the Properties and Use of Detergents in BiologyandBiochemistry， Calbiochem-Novabiochem Corp. ， La Jolla， Calif. ，1988)。
纤维蛋白密封胶的给药方法 考虑到了使用本技术领域熟知的技术，将可用于本发明的纤维蛋白密封胶给药到
对象，例如通过在所需位点注射或喷洒、使用内视镜、使用海绵状载体、预制的密封胶或本技术领域已知的其它方法。在一个实施方案中，密封胶被注射或喷洒，并使其在原位形成凝胶。 考虑到了将这些纤维蛋白密封胶给药于将得益于PDGF在体内持续/受控释放的对象，这对于本技术领域的普通专业人员来说是明显的，包括但不限于下面列出的病症。在一个实施方案中，患者患有肌肉骨骼疾病，包括但不限于骨骼和软骨、肌肉、相关韧带以及其它结缔组织的疾病；软组织疾病或病症，包括但不限于影响肌肉、纤维组织、脂肪、血管和滑液组织的病症；或血管疾病。 在一个实施方案中，纤维蛋白密封胶用于代替骨骼移植物，因此可以应用于许多相同的适应症中，包括但不限于脊柱融合器、不连缺损的愈合、骨骼增强、骨折修复加速、骨组织重建和牙齿再生。此外，在另一个实施方案中，密封胶可用于植入物整合。在植入物整合中，植入物可以用纤维蛋白密封胶包裹，诱导附近骨骼区域生长到植入物表面内，防止松散和其它相关问题。在另一个实施方案中，富含生长因子的基质可用于治愈皮肤中的慢性伤口。 其它的骨骼或软骨疾病或病症包括但不限于骨关节炎、骨质疏松、骨营养不良、软骨病、骨软化、McC騰-Albright综合征、Albers-Schonberg病、Paget' s病、类风湿关节炎、骨关节炎、软骨损伤、假体周围骨质溶解、成骨不全、转移性骨病、骨软骨瘤、骨生成、骨髓炎、骨病、骨骼石化症、骨硬化、多软骨炎、关节软骨损伤、软骨钙质沉着病、软骨发育不全、髌骨软化症、软骨肉瘤、肋软骨炎、内生软骨瘤、拇强直、半月板损伤、髋臼盂唇撕裂、剥脱性骨软骨炎(ocd)、复发性多软骨炎，或任何将得益于剌激骨骼或软骨形成的病症。
含有PDGF蛋白的纤维蛋白密封胶也可用于治疗将得益于增加的血管生成和血管生长的血管疾病或病症，包括但不限于局部缺血/再灌注、心肌梗塞、充血性心力衰竭、动脉粥样硬化、高血压、再狭窄、冠状动脉病(CAD)、中风、血管或心脏钙化、血栓形成、外周血管病、血管壁重塑、心室重塑、快速心室起搏、冠状动脉微栓塞、压力超负荷、主动脉弯曲、冠状动脉结扎、血管性心脏病、辨膜疾病，包括但不限于由钙化、风湿性心脏病、心内膜炎或人工瓣膜的并发症引起的瓣膜变性；心绞痛、心力衰竭、高血压、心房纤颤、心包疾病，包括但不限于心包积液和心包炎；心肌病、心脏肥大或心血管发育紊乱。
试剂盒 在本发明的范围内也考虑到了试剂盒。典型的试剂盒可以包括含有FC和凝血酶组分的纤维蛋白密封胶。在一个实施方案中，试剂盒还包括用于掺入到纤维蛋白密封胶中的PDGF蛋白。在一种情况下，每种组分可以包含在它自己的独立的储存容器、小瓶或器皿中。在相关情况下，PDGF可以与FC组分混合，而凝血酶组分可以在单独的储存容器中。在相关情况下，PDGF可以与凝血酶组分混合，而FC组分可以在单独的储存容器中。在相关实施方案中，储存容器是小瓶、瓶子、袋子、储液器、管子、泡罩、小袋、贴片等。配方的一种或多种成分可以是冻干的、冷冻干燥的、喷雾干燥的，或者采取任何其它可以复溶的形式。如果需要，也可以提供各种不同的复溶介质。 试剂盒的成分可以采取冷冻、液体或冻干的形式。进一步还考虑到了试剂盒含有适合于将纤维蛋白凝胶给药于对象的装置。在另一个实施方案中，试剂盒还含有用于制备和给药纤维蛋白密封胶的说明书。 从下面的实施例中，本发明的其它方面和详细情况将变得明显，这些实施例目的是说明而不是限制。
实施例 实施例1 :材料和方法
ff放动力学 使用单一 ([FC] = 20mg/ml ，[凝血酶]=2IU/ml)的纤维蛋白密封胶制剂(TISSEEL VH S/D， S/D是加入了病毒失活步骤以提供附加的安全性；Baxter AG， Vienna,Austria)，分析了重组(rh)-PDGF(R&DSystems)的浓度对释放动力学的影响。分析了不同量的重组人类PDGF-AB或BB (对于0. 3ml凝胶为5ng， 10ng， 20ng， 40ng和80ng)。在制备凝胶时，将PDGF重新悬浮在FC组分中。 分析了 FC浓度对最初悬浮在纤维蛋白的FC组分中的PDGF-AB和PDGF-BB (固定在15ng/0. 3ml凝胶)的释放动力学的影响。使用从5-40mg/ml (在凝胶中的终浓度)的不同浓度的FC，以及固定浓度的凝血酶(2IU/ml)，制备了四种不同的纤维蛋白凝胶制剂(TISSEELVH S/D)。 使用单一凝胶配方([FC] = 20mg/ml，[凝血酶]=2IU/ml，凝胶中的终浓度)，对三个不同产品批次的TISSEEL VH S/D纤维蛋白密封胶的PDGF-AB和BB(固定为15ng/0. 3ml凝胶，即50ng/ml凝胶)的释放动力学进行了比较，以分析释放动力学依赖于纤维蛋白密封胶产品批次的任何变化性。 分析了 PDGF-BB从TISSEEL VH的释放动力学(PDGF-BB浓度的影响，FC浓度的影响，以及依赖于纤维蛋白密封胶产品批次的变化性)，以观察使用TISSEEL VH和TISSEEL VHS/D时可能存在的差异。 对于所有使用TISSEEL VH S/D的实验来说，凝胶在聚丙烯E卯endorf管中制备，而对于使用TISSEEL VH的实验来说，凝胶在24孔聚苯乙烯培养板中制备。在所有情况下，将凝胶与标准的人类MSC(HMSC)生长培养基(Lonza Walkersville Inc. ， Walkersville， MD)在37°CT、5% C02中，温育最多10天。每天更换培养基，并将培养基样品冷冻直到通 过ELISA(R&D Systems,Minne即olis，MN)测试PDGF的量为止。对于评估FC浓度的影响和 TISSEEL VH S/D批与批之间变化的实验来说，在IO天的释放后，使用尿激酶(lU/ml)将凝 胶溶解在完全培养基中。测试获得的溶液中PDGF的量，以便证实最初添加到凝胶中的生长 因子的量的完全回收。
牛物学活件 释放的PDGF对HMSC单层的影响 使用了一种TISSEEL VH S/D纤维蛋白制剂(20mg/ml的FC以及2IU/ml凝血酶， 均为在凝胶中的终浓度)，来分析从凝胶释放的PDGF的生物学活性(将120ng PDGF-AB和 60ng PDGF-BB加入到FC组分中，然后将带有添加的PDGF的凝胶聚合)。将第3天时从凝 胶收集的培养基上清液(不每天更换培养基)，用作HMSC单层的培养基。首先，将HMSC以 2500个细胞/cm2预先接种在12孔培养板中(10， 000个细胞/孔)，在37°C 、5% C02中温育 4到5小时，以允许贴壁。然后，除去细胞培养基，用来自凝胶的培养基上清液替换。制备一 些不加PDGF的凝胶用作对照样品，以便确保使用来自于添加有PDGF的凝胶的培养基时观 察到的任何变化，确实是由释放的PDGF诱导的，而不是由可能从凝胶自身释放的某些其它 的潜在生物活性成分诱导的。含有新鲜制备的、添加有30ng(15ng/ml)rh-PDGF的培养基的 孔，被用作阳性对照。在阳性对照中添加30ng PDGF，是基于当在实验使用的凝胶制剂中添 加120ng PDGF-AB或60ng PDGF-BB时，在第3天时所发现的从凝胶释放的PDGF的大约量， 因此将很接近地模拟测试条件，即在第3天时来自凝胶的、含有释放的PDGF-AB或PDGF-BB 的培养基上清液。 细胞增殖和细胞形态学变化的分析在第1、4和7天时分析了细胞增殖 和形态学变化。将细胞培养基丢弃，将细胞用含有钙黄绿素-AM和溴乙锭同二聚 体-l(Sigma-Aldrich Inc. ， St. Louis，MO)的存活/死亡(Live/Dead)染料溶液染色。将与 来自添加有PDGF的凝胶的培养基上清液温育的细胞的增殖，同与来自未添加PDGF的凝胶 的上清液温育的细胞以的增殖及与添加有30ng PDGF的新鲜制备的培养基温育的细胞的增 殖(阳性对照)，进行了比较。细胞的增殖通过在50分钟染色后用多孔板读板器(Gemini, Molecular Devices, Sunnyvale, CA)测量荧光强度来监测。在增殖读数后，将板用基本培 养基洗涤一次以除去残留的染色剂，并使用装备有数字图像获取系统(带有用于图像捕获 的Spot软件V. 2. 1.的Spot数字相机，Nikon)的倒置荧光显微镜(NikonEclipse TE200, Nikon Instruments Inc. ， Melville, NY)，观察细胞形态学变4t。 细胞分化分析(软骨形成和骨形成)为了分析在存在从纤维蛋白凝胶释放的 PDGF的情况下，可能的HMSC软骨形成或骨形成分化，在培养1、4、7天后，将细胞用爱茜蓝 (Alcian Blue)(用于软骨形成)或茜素红(用于骨形成)染色。将与来自添加有PDGF的 凝胶的培养基温育的细胞的染色强度，同与来自未添加PDGF的凝胶的培养基温育的细胞 以及与添加有30ng PDGF的新鲜制备的培养基温育的细胞(阳性对照)的染色强度，进行 了比较。 为了进行爱茜蓝染色，将细胞用磷酸盐缓冲溶液(PBS) (Invitrogen Corporation, San Diego， CA)清洗两次，用聚甲醛(SigmaAldrich Inc.)固定IO分钟，用0. IN HC1中的1X爱茜蓝(Sigma Aldrichlnc.)染色30分钟。将细胞用PBS洗5次(每次2 分钟)，在装备有数字图像获取系统(前面描述的带有用于图像捕获的Spot软件V.2. 1.的 Spot数字相机，Nikon)的倒置光学显微镜(Nikon Eclipse TE200)下观察。为了进行茜素 红染色，首先将细胞用PBS洗两次，在冰冷的70%乙醇中固定10分钟，用PBS中的2%茜素 红(Sigma Aldrich Inc.)染色30分钟。然后将细胞用PBS洗5次(每次2分钟)，使用上 述的倒置光学显微镜观察。 除了用茜素红染色之外，在培养1、4和7天后测量了碱性磷酸酶(ALP)活性，作为 早期成骨分化的标志物。将12孔培养板中的细胞用HBSS(Lonza Walkersville, Inc.)洗 涤两次，用胰蛋白酶处理几分钟使它们分离。然后将细胞悬液转移到Eppendorf管中，将孔 用0. 5ml基本培养基洗涤，然后转移到相应的Eppendorf管中。然后将细胞离心5分钟，用 0. 5ml含有NaHC03的Tyrode's盐溶液(Sigma Aldrich， Inc.)洗一次。弃去上清液，将细 胞沉淀重新悬浮在50 ii 1 AMP缓冲液+MgCl2 (Sigma Aldrich， Inc.)中，转移到96孔板中。 将管用25 1 AMP缓冲液+MgCl2洗涤，将其转移到96孔板的相应孔中。在96孔板的3个 孔中加入75iU AMP缓冲液+MgCl2，用作空白。最后，在每个孔中加入75iU p-NPP(对硝 基苯基磷酸酯，Sigma Aldrich, Inc.)底物储液，然后将板在37。C放置30分钟。在30分钟 时，使用微孔板读板器(Thermomax， Molecular Devices Corp.)分析所形成的与ALP活性 成比例的对硝基酚产物在405nm处的吸光度。将首先以IU/L测量的结果，根据增殖进行归 一化。 PDGF-BB对接种在纤维蛋白凝胶中的HMSC的影响 为了分析添加在纤维蛋白凝胶中的PDGF-BB对接种在纤维蛋白凝胶中的HMSC和 接种在凝胶表面上的人脐带血管内皮细胞(HUVEC，Lonza Walkersville, Inc.)的行为的生 物学效应，使用单一培养细胞(HMSC或HUVEC)或HMSC : HUVEC比率为4 : 1的共培养的 细胞，制备了含有10mg/ml FC和2IU/ml凝血酶(凝胶中的终浓度)的TISSEEL VH S/D凝 胶。在凝胶制备时，在一半的共培养凝胶中，在FC中添加PDGF-BB (60ng/0. 3ml凝胶)，以便 比较在添加或未添加PDGF-BB的凝胶中细胞的行为。将制备在24孔培养板中的凝胶，使用 含有血清添加物的内皮细胞生长培养基(lml/凝胶)，在37°CT、5% C02中温育最多21天。 在第1、7、14和21天分析细胞的形态学和增殖，以及成骨分化。细胞形态学，包括HUVEC重 新组织成互相连接的细胞_细胞网络(血管形成分化的早期事件)，在用钙黄绿素染料染 色后通过荧光显微术观察。细胞增殖，在用钙黄绿素染料染色后，通过将凝胶在纯化的、浓 縮的牛胰蛋白酶溶液中溶解后，测量细胞悬液的总荧光强度来分析。最后，在将凝胶在纯化 的、浓縮的牛胰蛋白酶溶液中溶解、然后重新悬浮细胞后，测量ALP作为成骨分化的早期标 志物(方案如前所述)。 通过表面等离子体共振测定PDGF的结合: 表面等离子体共振(SPR)是一种实时测量生物分子相互作用的技术。分析可以 确定具体的分析物是否与给定配体结合，并确定分析物与配体结合的结合亲和性和化学计 量。基本的实验方法是首先将镀金的芯片与配体偶联。然后将在缓冲液(流动相)中制备 的分析物注射到流动池中，在那里它由缓冲液流运载通过镀层的芯片。如果分析物与配体 之间发生生物分子相互作用，表面上质量的局部增加导致金属表面上折射率单位(P RIU) 的增加。(yRIU)的变化可以作为时间的函数作图。
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在本研究中，重组人类PDGF-AB和重组人类PDGF-BB被用作分析物，TISSEEL VH S/D的FC组分被用作配体。磷酸盐缓冲液(PBS，即生理盐条件溶液)被用作缓冲液。将不 同浓度的每种PDGF同工型分别通过FC包被的传感器芯片的表面。对于每个实验和每种浓 度来说，测量结合和解离速率。
乡充i十，條: 释放动力学进行三份平行测试。增殖、ALP活性、爱茜蓝和茜素染色的结果代表了 三组实验。增殖和ALP活性进行了三份平行测试，染色实验进行了双份。每种PDGF浓度的 SPR分析进行了三分平行测试。统计学分析使用AN0VA检验进行，以5%作为显著性水平。
实施例2 :PDGF浓度对它从TISSEEL VH S/D释放的动力学的影响
使用由TISSEEL VH S/D制造的单一纤维蛋白凝胶制剂(FC浓度为20mg/ml，凝血 酶浓度为2IU/ml，均为凝胶中的终浓度)，分析了 PDGF浓度对它从纤维蛋白凝胶释放的动 力学的影响。释放动力学研究显示，PDGF-AB和BB的释放量，随着最初添加到TISSEEL VH S/D的FC组分中的生长因子的量而增加(图1和2)。 总体来说，累积释放结果显示，在IO天后，只有大约20 %到35%的最初添加的 PDGF-AB释放了 (图1)。如果考虑仅仅3天后的PDGF-AB累积释放，PDGF-AB的累积释放 是大约8-13% 。换句话说，这些结果显示，在第10天时保留了大约65-80% ，在第3天时保 留了大约87-92%。 使用PDGF-BB的结果也服从同样的趋势，但表现出较高的总释放，在10天后释放 了大约45%到70% (图2)。如果考虑仅仅3天后PDGF-BB的累积释放，累积释放是大约 20-35%。 这些结果表明，PDGF-AB和BB都与纤维蛋白具有强烈的结合相互作用。 实施例3 :FC浓度对PDGF从TISSEEL VH S/D释放的动力学的影响 为了确定当使用TISSEEL VH S/D纤维蛋白密封胶时FC浓度对PDGF释放动力学
的影响，使用具有固定的凝血酶浓度(2IU/ml)，对4种不同FC浓度(5、10、20和40mg/ml，
为在凝胶中的终浓度)的TISSEEL VH S/D凝胶的释放进行了分析。 ELISA结果显示，对于所有被分析的FC浓度来说，第1天时有峰值释放，随后释放 减少直到第10天(图3A)。当在凝胶中加入15ngPDGF-AB时，FC浓度(从5到40mg/ml) 对释放动力学没有显著影响。累积释放显示，在10天后释放起始量(15ng)的大约27%到 32% (图38)，而3天后仅释放10%到20%。换句话说，10天后的保留为大约70% ，而仅仅 3天后保留高达80-90X，并且不受FC浓度的影响，表明5mg/ml FC足够结合15ng PDGF-AB。
但是，使用PDGF-BB的结果显示出FC浓度对总释放百分率的影响(图4)。事实 上，第10天时，在较低FC浓度下PDGF-BB从TISSEELVH S/D的累积释放较高(使用5mg/ ml FC为65%，使用40mg/ml FC为25X)。第3天时的累积释放分析也显示出了对FC浓 度的依赖性，使用5mg/ml FC时释放为大约35X，使用40mg/ml FC时释放为大约10X。换 句话说，这些结果显示，10天后，最小保留为是大约35% (使用5mg/ml FC)，最大保留为大 约75% (使用40mg/ml FC)，而3天后，最小保留为大约65% ，最大保留为大约90% 。释放 动力学对FC浓度的依赖性，表明通过改变FC浓度，PDGF-BB有可能受控释放。
在将凝胶溶解以回收凝胶中残留的PDGF-AB后，ELISA结果显示，回收到了最初添 加的PDGF-AB量的至少85% 。在将凝胶溶解以回收凝胶中残留的PDGF-BB后，ELISA结果显示，回收到了最初添加的PDGF-BB量的65 %到75% 。因此，对于PDGF-BB来说回收不完
全，PDGF-BB的释放百分率可能被略微低估了。 实施例4 :使用TISSEEL VH S/D不同产品批次的影响 当观察使用具有单一凝胶配方(20mg/ml FC和2IU/ml凝血酶，均为凝胶中的终浓 度)的TISSEEL VH S/D的不同FC产品批次的影响时，结果显示，对于所有被分析的批次 来说，直到10天时具有恒定的释放。取决于FC批次，10天后PDGF-AB的累积释放在大约 23%到32%的范围内(图5)，因此对于3个批次来说是相似的。取决于FC批次，10天后 PDGF-BB的累积释放在大约38%到42%的范围内(图6)，因此对于3个批次来说也是相似 的。 这些结果显示，在纤维蛋白批次之间，PDGF的释放没有显著差别，因此在释放动力 学中不必担心批次之间的差异。 在将凝胶溶解以回收凝胶中残留的PDGF-AB后，ELISA结果显示了最初加入的 PDGF-AB量被完全回收。在将凝胶溶解以回收凝胶中残留的PDGF-BB后，ELISA结果显示回 收了最初加入的PDGF-BB量的大约65%。因此，对于PDGF-BB来说回收不完全，PDGF-BB的 总释放百分率可能被略微低估。 实施例5 :PDGF-BB从TISSEEL VH释放的动力学 分析了 PDGF-BB从TISSEEL VH释放的动力学，以观察在使用TISSEEL VH和 TISSEEL VH S/D时可能存在的差别。 测量了 PDGF-BB浓度对从TISSEEL VH释放的动力学的影响。结果显示，释放量随 着最初添加到FC组分中的生长因子的量而增加(图7)。总体来说，累积释放结果显示，10 天后，最初添加的PDGF-BB只有大约20%到40%被释放，即比使用VH S/D时观察到的释放 低大约2倍。在仅仅3天后，结果显示PDGF-BB的累积释放为大约15-20%。但是，应该指 出，这些值可能被低估了，这是因为对TISSEEL VH进行的实验使用的是聚苯乙烯板(与此 相比TISSEEL VH S/D使用的是聚丙烯管)，PDGF可能与聚苯乙烯板非特异性结合。没有测 量10天释放实验结束时凝胶中残留的生长因子的回收来证实这种可能的低估。
当观察FC浓度对每日PDGF-BB从TISSEEL VH释放的影响时，ELISA结果显示，对 于所有被分析的浓度来说，第1天表现出峰值释放，此后释放减少， 一直到第10天(图8A)。 结果还显示出，当在TISSEEL VH凝胶中加入15ng PDGF-BB时，FC浓度(从5到40mg/ml)不 影响释放动力学，累积释放显示出在10天后，释放了大约30 %到35 %的起始添加量(15ng) (图8B)。该结果表明，来自TISSEEL VH的5mg/ml FC足够结合15ng PDGF-BB。但是，至于 PDGF-BB浓度影响的结果，应该指出，使用TISSEEL VH时的这些值由于使用了聚苯乙烯板， 可能被低估了。 最后，当观察使用具有单一凝胶配方(20mg/ml FC和2IU/ml凝血酶，均为凝胶中 的终浓度)的TISSEEL VH的不同FC产品批次的影响时，结果显示，对于所有被分析的批次 来说，直到10天时具有恒定的释放。10天后PDGF-BB的累积释放在大约30%到60%的范 围内(图9)，因此依赖于FC批次号，这与使用TISSEEL VH S/D时的结果相反。被分析的3 个批次的TISSEEL VH的一种差异是因子XIII的含量(批次1可以忽略，批次2为33. 9U/ ml，批次3为42. 2IU/ml)，表明在因子XIII的量与PDGF-BB从TISSEEL的释放速率之间可 能存在关联。
实施例6 :释放的PDGF在体外对HMSC单层的生物学活性 人类间充质干细胞(HMSC)是多能祖细胞，可以分化成不同的特化组织细胞类 型，包括软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞和肌细胞(C即lan AI， J Orthop Res 9:641-650， 1991)。这些细胞的定向和分化由各种不同的因素介导，包括细胞相互作用，但是也包括特 异性生长因子。PDGF家族的成员已经被鉴定为MSC成熟的调节剂。 测量了释放的生长因子对HMSC的影响。正如在材料与方法部分中陈述的，在第3 天时(不每天更换培养基)，从纤维蛋白凝胶(将120ng PDGF-AB和60ng PDGF-BB添加到 FC组分中，然后对添加有PDGF的凝胶进行聚合)收集培养基上清液，并用作HMSC单层的培 养基。某些凝胶在制备时不加入PDGF，用作对照样品，以便确保使用来自于添加有PDGF的 凝胶的培养基时观察到的任何变化确实是由释放的PDGF诱导的，而不是由可能从凝胶自 身释放的某些其它的潜在生物活性成分诱导的。 用来自添加有PDGF-AB或PDGF-BB的TISSEEL VH S/D凝胶的培养基上清液、即含 有释放的PDGF的培养基(最初用20mg/ml FC、2IU/ml凝血酶制备的凝胶)培养的HMSC，早 在第4天就显示出细胞形态学的变化，在第7天时甚至更明显。它们与用来自未添加PDGF 的凝胶的培养基上清液培养的细胞相比，具有更细长的形状，与用含有新鲜添加的PDGF的 培养基培养的细胞更为类似。使用PDGF-BB时效果甚至更明显。 将第4和7天时细胞的增殖根据第l天时的增殖(基线)进行归一化。当用来自 添加有PDGF的TISSEEL VH S/D凝胶的培养基上清液(即含有释放的PDGF的培养基)培 养7天时，HMSC增殖趋于增加，但是差异不明显(p >0.05)(图IO和11)。用新鲜添加有 PDGF的培养基培养的细胞的增殖，明显较高。 用来自添加有PDGF的TISSEEL VH S/D凝胶的上清液培养的HMSC，与用来自未添 加PDGF的TISSEEL VH S/D凝胶的上清液和用含有新鲜添加的PDGF的培养基培养的HMSC 相比，其中的碱性磷酸酶(ALP)活性明显较低(图12和13)。 在直到7天时，所有时间点的爱茜蓝(软骨形成分化的指示剂)和茜素红(晚期 骨形成分化的指示剂)都为阴性。 总的来说，在存在来自于TISSEEL VH S/D纤维蛋白凝胶的释放的PDGF的情况下， 所有HMSC行为中观察到的变化在使用PDGF-BB时都更明显。总体上，结果显示，从TISSEEL VH S/D纤维蛋白凝胶释放的PDGF仍然是生物学活性的，主要诱导了 HMSC形态学的变化和 ALP活性的抑制。 实施例7 :PDGF-BB对接种在纤维蛋白凝胶中的HMSC和接种在纤维蛋白凝胶表面 上的HUVEC的影响 为了分析PDGF对接种在纤维蛋白凝胶中的HMSC和接种在凝胶表面上的人类脐带 血管内皮细胞(HUVEC， Lonza Walkersville Inc.)的行为的影响，按照在材料和方法中的 描述制备了含有细胞的凝胶。 简单来说，使用单一培养细胞(HMSC或HUVEC)或以4 : 1的HMSC : HUVEC比率共 培养的细胞，制备了含有10mg/ml FC和2IU/ml凝血酶(在凝胶中的终浓度)的凝胶。在 凝胶制备时，在一半的共培养凝胶中，在FC中添加了重组PDGF-BB (60ng/0. 3ml凝胶)。使 用含有血清补充的内皮细胞生长培养基(Lonza Walkersville Inc.)，在37°CT、5% C02中 将凝胶温育21天。在第1、7、14和21天时，分析细胞形态学和增殖，以及成骨分化。
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荧光显微术分析显示，随着时间，HMSC以较高的数量均匀地分散，当接种在单一 培养物凝胶中时，具有更细长的形状。它们在添加有PDGF-BB的共培养凝胶中也均匀地分 散和伸长，但是在未添加PDGF-BB的情况下，它们较小、数量较少，并倾向于朝向共培养凝 胶的底部迁移。在单一培养物凝胶和含有附加的PDGF-BB的共培养物凝胶中，与未添加 PDGF-BB的共培养凝胶相比，HUVEC重新组织成互相连接的细胞-细胞网络(血管形成的早 期事件)开始得较早，发生的程度更高。 细胞增殖随着时间而增加。在添加和未添加PDGF-BB的凝胶之间没有观察到明显 的差别，但是在第7天和14天时，在含有添加的PDGF-BB的凝胶中注意到了更高增殖的趋 势。ALP活性保持在低水平，表明添加到凝胶中的PDGF-BB没有诱导接种在凝胶中的HMSC 的成骨分化。 实施例8 :通过表面等离子体共振(SPR)测定的PDGF的结合
SPR被用于研究PDGF-AB和PDGF-BB与TISSEEL VH S/D的FC组分之间的相互作 用的性质。相互作用的传感图显示在图14A-14B中。对曲线的结合和解离部分进行了作 图，并使用非线性回归分析，分别拟合成单相指数结合和解离曲线(图14C)。如图14B所 示，PDGF-BB的解离曲线是双峰的。这使得不能精确地测定PDGF-BB与TISSEELVH S/D的 FC组分之间相互作用的KD值。但是，SPR被成功地用于计算PDGF-AB与TISSEEL VH S/D的 FC组分的相互作用的K。值(在存在缓冲液(PBS，pH 7.4)的情况下)。对传感图结合相的 分析，提供了速率常数(K。b》，将它对分析物浓度进行了作图(图14C)。通过线性回归对这 些图进行了分析，获得了斜率和截距，它们分别对应于结合速率常数(K。n)和解离速率常数 (K。ff)。平衡解离常数(KD)通过用解离速率常数除以结合速率常数来计算。
平衡解离常数(KD)也可以通过互补的方法(complementarymethod)来才确定，这 依赖于结合传感图的解离相。在这种方法中，PDGF-AB的解离速率常数(K。ff)从传感图的解 离相的非线性回归分析计算。解离平衡常数(KD)通过用解离速率常数(K。ff)除以结合速率 常数(K。n)(它从传感图的结合相的分析获得)来计算。 使用这两种方法，PDGF-AB与TISSEEL VH S/D的FC组分结合的K。值为342±41nM。
归纳 上面测量的释放动力学显示，在纤维蛋白凝胶中添加的重组PDGF逐渐从凝胶释 放，表明了PDGF与纤维蛋白(原)的结合相互作用。这种结合相互作用得到了 IO天后 累积释放低于最初添加的PDGF量的进一步证实。PDGF-BB表现出比PDGF-AB释放得更快 (PDGF-BB的持留更低)，FC浓度表现出影响了 PDGF-BB从TISSEEL VH S/D纤维蛋白凝胶 的释放速率，表明不同的FC浓度可用于控制PDGF-BB的释放速率。总的来说，这些结果表 明了这两种形式的PDGF、特别是PDGF-AB，与纤维蛋白的结合相互作用。使用SPR时，结果 显示PDGF-AB和PDGF-BB 二者都与TISSEEL的FC组分结合。最后，生物活性结果证实，释 放的PDGF仍然是生物学活性的，主要诱导了 HMSC形态学的变化，但是不诱导骨形成和/或 软骨形成的分化。 总的来说，本研究表明，纤维蛋白凝胶是用于投送生物活性PDGF的潜在载体系 统，并证明了 TISSEEL纤维蛋白密封胶的FC组分结合PDGF-AB和BB的内在性质。
对于本技术领域的专业人员来说，预计可以对上面的说明性实施例中提出的本发 明进行大量改变和改变。因此，只有在随附的权利要求书中出现的那些限制才对本发明生效c
权利要求
用于改变血小板衍生生长因子(PDGF)蛋白从纤维蛋白密封胶的释放的方法，所述血小板衍生生长因子(PDGF)蛋白选自PDGF-AB和PDGF-BB，其中纤维蛋白密封胶通过将纤维蛋白原复合物(FC)组分、凝血酶组分和PDGF组分相混合而产生，该方法包括，a)确定从具有已知PDGF起始量和已知FC终浓度的第一种纤维蛋白密封胶中释放的PDGF的量，以及b)改变在步骤(a)的第一种纤维蛋白密封胶中使用的FC的已知终浓度以产生第二种纤维蛋白密封胶，其中第二种密封胶中FC的浓度与第一种密封胶中FC的已知终浓度相比的增加，使从第二种密封胶释放PDGF的速率与从步骤(a)的第一种密封胶释放PDGF相比降低，并且其中第二种密封胶具有与步骤(a)的第一种密封胶相同的PDGF起始量。
2. 用于改变血小板衍生生长因子(PDGF)从纤维蛋白密封胶的释放的方法，所述血小 板衍生生长因子蛋白选自PDGF-AB和PDGF-BB，其中纤维蛋白密封胶通过将FC组分、凝血酶 组分和PDGF组分相混合而产生，该方法包括，a) 确定从具有已知PDGF起始量和已知FC终浓度的第一种纤维蛋白密封胶中释放的 PDGF的量，b) 改变在步骤(a)的第一种纤维蛋白密封胶中使用的FC的已知终浓度以产生第二种 纤维蛋白密封胶，其中第二种密封胶中FC的浓度与第一种密封胶中FC的已知终浓度相比 的降低，使从第二种密封胶释放PDGF的速率与从步骤(a)的第一种密封胶释放PDGF相比 增加，并且其中第二种密封胶具有与步骤(a)的第一种密封胶相同的PDGF起始量。
3. 权利要求1或2的方法，其中第一或第二种密封胶中FC的终浓度在大约lmg/ml到 大约150mg/ml的范围内。
4. 权利要求3的方法，其中第一或第二种密封胶中FC的浓度在大约5mg/ml到大约 75mg/ml的范围内。
5. 权利要求1或2的方法，其中第一种纤维蛋白密封胶中FC的终浓度与第二种密封胶 中FC的终浓度的差别为大约lmg/ml到大约149mg/ml。
6. 权利要求1或2的方法，其中第一种纤维蛋白密封胶中FC的终浓度与第二种密封胶 中FC的浓度的差别为大约5mg/ml到大约75mg/ml。
7. 权利要求1或2的方法，其中第一种纤维蛋白密封胶中FC的终浓度与第二种密封胶 中FC的浓度的差别为大约10mg/ml到大约60mg/ml。
8. 权利要求1或2的方法，其中第一或第二种密封胶中凝血酶组分的终浓度在大约 1IU/ml到250IU/ml的范围内。
9. 权利要求1或2的方法，其中PDGF的终浓度在大约lng/ml到大约lmg/ml的范围内。
10. 在需要的患者中受控释放血小板衍生生长因子(PDGF)蛋白的方法，所述蛋白选自 PDGF-AB和PDGF-BB，该方法包括给所述患者施用含有PDGF的纤维蛋白密封胶，其中至少 25%的PDGF在纤维蛋白密封胶中保留至少3天。
11. 权利要求IO的方法，其中纤维蛋白密封胶通过将FC组分与凝血酶组分在混合物中 混合而产生。
12. 权利要求11的方法，其中在将FC组分与凝血酶组分混合之前，将PDGF加入到FC 组分中。
13. 权利要求10或11的方法，其中至少35%到90%的PDGF保留至少3天。
14. 权利要求10或11的方法，其中至少45X到75X的PDGF在纤维蛋白密封胶中保留 至少3天。
15. 权利要求10或11的方法，其中至少60%的PDGF在纤维蛋白密封胶中保留至少3天。
16. 权利要求10或11的方法，其中释放的PDGF是有生物活性的。
17. 在需要的患者中受控释放血小板衍生生长因子(PDGF)蛋白的方法，所述蛋白选自 PDGF-AB和PDGF-BB，该方法包括给所述患者施用含有PDGF的纤维蛋白密封胶，其中至少 20%的PDGF在纤维蛋白密封胶中保留至少10天。
18. 权利要求17的方法，其中纤维蛋白密封胶通过将纤维蛋白原复合物(FC)组分与凝 血酶组分在混合物中混合而产生。
19. 权利要求18的方法，其中在将FC组分与凝血酶组分混合之前，将PDGF加入到FC 组分中。
20. 权利要求17或18的方法，其中至少25%到75X的PDGF保留至少10天。
21. 权利要求17或18的方法，其中至少45%到55X的所述PDGF在纤维蛋白密封胶中 保留至少10天。
22. 权利要求17或18的方法，其中释放的PDGF是有生物活性的。
23. 权利要求11或18的方法，其中密封胶中纤维蛋白原复合物的终浓度在大约lmg/ ml到大约150mg/ml的范围内。
24. 权利要求11或18的方法，其中密封胶中凝血酶的终浓度在大约1IU/ml到250IU/ ml的范围内。
25. 权利要求11或18的方法，其中纤维蛋白原复合物的终浓度是40mg/ml，和凝血酶 的终浓度是大约2IU/ml。
26. 权利要求10或17的方法，其中密封胶中PDGF的终浓度是大约lng/ml到大约lmg/ml。
27. 权利要求10或17的方法，其中PDGF是PDGF-AB。
28. 权利要求27的方法，其中至少60%的所述PDGF-AB在所述纤维蛋白密封胶中保留 至少3天，并且其中至少40%的所述PDGF-AB在所述纤维蛋白密封胶保留至少10天。
29. 权利要求10或17的方法，其中PDGF是PDGF-BB 。
30. 权利要求29的方法，其中至少55%的所述PDGF-BB在所述纤维蛋白密封胶中保留 至少3天，并且其中至少25%的所述PDGF-BB在所述纤维蛋白密封胶中保留至少10天。
31. 权利要求10或17的方法，其中患者患有选自肌肉骨骼疾病或病症、软组织疾病或 病症和心血管疾病的疾病。
32. 权利要求31的方法，其中肌肉骨骼病症是骨疾病或骨病症。
33. 权利要求32的方法，其中患者患有心血管疾病。
34. 用于治疗患者的方法，该患者患有将得益于血小板衍生生长因子(PDGF)蛋白的原 位受控释放的病症或疾病，所述蛋白选自PDGF-AB和PDGF-BB，所述方法包括给所述患者施 用含有PDGF蛋白的纤维蛋白密封胶，其中纤维蛋白密封胶提供了 PDGF的受控释放，其中至少25%的PDGF在纤维蛋白密封胶中保留至少3天，或其中至少20%的PDGF在纤维蛋白密封胶中保留至少10天，并且所述 PDGF以有效治疗所述病症或疾病的速率释放。
35. 权利要求34的方法，其中纤维蛋白密封胶通过将纤维蛋白原复合物(FC)组分与凝 血酶组分在混合物中混合而产生。
36. 权利要求34的方法，其中在将FC组分与凝血酶组分混合之前，将PDGF加入到FC 组分中。
37. 权利要求34或35的方法，其中至少35%到90%的PDGF在纤维蛋白密封胶中保留 至少3天。
38. 权利要求34或35的方法，其中至少45%到75%的PDGF在纤维蛋白密封胶中保留 至少3天。
39. 权利要求34或35的方法，其中至少60%的PDGF在纤维蛋白密封胶中保留至少3天。
40. 权利要求34或35的方法，其中至少20X的所述PDGF在纤维蛋白密封胶中保留至 少10天。
41. 权利要求34或35的方法，其中至少25X到75X的PDGF保留至少10天。
42. 权利要求34或35的方法，其中至少45 %到55 %的所述PDGF在纤维蛋白密封胶中 保留至少10天。
43. 权利要求34或35的方法，其中释放的PDGF是有生物活性的。
44. 权利要求34的方法，其中密封胶中FC的终浓度在大约lmg/ml到大约150mg/ml的 范围内。
45. 权利要求34的方法，其中密封胶中凝血酶的终浓度在大约1IU/ml到250IU/ml的 范围内。
46. 权利要求34的方法，其中纤维蛋白原复合物的终浓度是大约40mg/ml，和凝血酶的 终浓度是大约2IU/ml。
47. 权利要求34的方法，其中密封胶中PDGF的终浓度是大约lng/ml到大约lmg/ml。
48. 权利要求34的方法，其中PDGF是PDGF-AB。
49. 权利要求48的方法，其中至少80X的所述PDGF-AB在所述纤维蛋白密封胶中保留 至少3天，并且其中至少60%的所述PDGF-AB在所述纤维蛋白密封胶中保留至少10天。
50. 权利要求34的方法，其中PDGF是PDGF-BB。
51. 权利要求50的方法，其中至少55X的所述PDGF-BB在所述纤维蛋白密封胶中保留 至少3天，并且其中至少25%的所述PDGF-BB在所述纤维蛋白密封胶中保留至少10天。
52. 权利要求34的方法，其中患者患有选自肌肉骨骼疾病或病症、软组织疾病或病症 和心血管疾病的疾病。
53. 权利要求52的方法，其中骨骼肌肉病症是骨疾病或骨病症。
54. 权利要求52的方法，其中患者患有血管疾病。
55. 用于制备含有血小板衍生生长因子(PDGF)蛋白的纤维蛋白密封胶的试剂盒，所述 血小板衍生生长因子(PDGF)蛋白选自PDGF-AB和PDGF-BB，并且所述纤维蛋白密封胶具有 所需的PDGF释放速率，该试剂盒包含，a)含有纤维蛋白原复合物组分的第一个小瓶或第一个储存容器，其中小瓶任选含有PDGF组分，以及b)具有凝血酶组分的第二个小瓶或第二个储存容器，当所述第一个小瓶或 第一个储存容器不包含PDGF组分时，所述试剂盒任选包含具有PDGF组分的第三个小瓶或 第三个储存容器，所述试剂盒还包含其使用说明书。
56. 用于制备含有血小板衍生生长因子(PDGF)蛋白的纤维蛋白密封胶的试剂盒，所述 血小板衍生生长因子(PDGF)蛋白选自PDGF-AB和PDGF-BB，并且所述纤维蛋白密封胶具有 所需的PDGF释放速率，该试剂盒包含，a)含有纤维蛋白原复合物组分的第一个小瓶或第一个储存容器，以及b)具有凝血酶 组分的第二个小瓶或第二个储存容器，其中小瓶任选包含PDGF组分，当所述第二个小瓶或 第二个储存容器不包含PDGF组分时，所述试剂盒任选包含具有PDGF组分的第三个小瓶或 第三个储存容器，所述试剂盒还包含其使用说明书。
57. 含有血小板衍生生长因子(PDGF)蛋白的纤维蛋白密封胶在制造用于治疗患有将 得益于血小板衍生生长因子(PDGF)蛋白原位受控释放的病症或疾病的患者的药物中的应 用，所述血小板衍生生长因子(PDGF)蛋白选自PDGF-AB和PDGF-BB，并且所述纤维蛋白密封 胶具有所需的PDGF释放速率。
全文摘要
总的来说，本发明涉及含有血小板衍生生长因子(PDGF)的纤维蛋白密封胶，通过原位受控释放用于治疗性应用，包括肌肉骨骼病症、软组织病症和血管疾病。
文档编号A61K38/18GK101772350SQ200880102160
公开日2010年7月7日 申请日期2008年6月19日 优先权日2007年6月19日
发明者万达·塞顿, 伊莎贝尔·卡特拉斯, 约瑟夫·德怀尔, 萨姆·L·海尔格森, 谢恩·多诺万 申请人:巴克斯特国际公司;巴克斯特医疗保健股份有限公司