专利名称：一种质粒dna/纤维蛋白凝胶/聚合物三元复合支架的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种体内软骨组织再生支架的制备方法，尤其是质粒DNA/纤维蛋白 凝胶/聚合物三元复合支架的制备方法。
背景技术：
关节炎是临床上常见的疾病，由于关节炎或运动创伤所造成的关节软骨损伤给许 多病人带来痛苦。软骨的代谢活跃而修复能力有限，没有血管，在损伤之后不能形成纤维凝 块，没有炎性细胞迁移进入，也没有血管未分化细胞进入损伤的部位，所以不易自行进行修 复。迄今为止，临床上仍然缺少有效的方法修复受损的软骨组织。应用再生医学的方法和 原理来进行软骨组织的修复是目前的一个重要手段，且取得了良好的效果。其中，软骨修复 支架在软骨再生中起着十分重要的作用。 人体的软骨属于结缔组织，其中含有少量的软骨细胞和大量的细胞间质。软骨细 胞散在于软骨基质内的软骨陷窝内，陷窝周围的基质染色较深称为软骨囊。幼稚的软骨细 胞较小，常单个分布于关节软骨的边缘区，呈扁圆形。由边缘向中央软骨细胞的体积逐渐增 大，呈椭圆形或圆形，具有较明显的软骨囊。幼小的软骨细胞可分裂，深部成熟的软骨细胞 常2 8个成群分布。软骨细胞间质的化学成分主要包括胶原蛋白、蛋白多糖和少量的非 胶原蛋白。软骨组织中的胶原主要为11型胶原，占胶原总量的90%以上。II型胶原纤维 在软骨内呈三维网状分布，为关节软骨提供抗张强度。蛋白多糖通过连接蛋白以非共价键 形式与透明质酸结合形成巨大的蛋白多糖聚合体。蛋白多糖聚合体分子链上含有丰富的负 酸根离子，可以结合大量的水形成水凝胶，为软骨提供抗压强度和弹性。水分占软骨组织全 重的75%，其中含有大量正离子以平衡蛋白多糖分子中的负电荷，并含有许多软骨细胞所 需的营养物质和细胞代谢产物。软骨组织内无血管，但由于软骨基质富含水分，营养物质易 于渗透，故软骨细胞仍能获得必要的营养。 关节软骨具有极特殊的力学性能。例如关节软骨具有很好的弹性和韧性，可承受 较大的负荷，同时具有光滑的表面，使关节活动时的摩擦力极小。软骨组织一旦缺损，将给 患者带来巨大的痛苦和不便。在正常的关节中，关节软骨紧紧与软骨下骨结合起来而不会 剥离下来；当关节软骨受到压力时候，通过软骨下骨将所承受的应力传递到骨，实际上是软 骨下骨支撑关节软骨。研究表明，关节炎常常会造成关节软骨和软骨下骨的同时病变，如果 仅仅修复关节软骨，而忽视软骨下骨的修复，常常会使得新生的关节软骨由于缺乏支撑而 褪变。 软骨本身在损伤部位缺乏未分化的细胞，损伤之后没有软骨细胞迁移生长到损伤 的软骨之中。而且，随着年龄的增长，软骨细胞的分裂能力逐渐降低，产生细胞外基质的能 力也随之降低。自体软骨细胞来源有限而且在体外培养增殖过程中易去分化，而且仅仅只 能在一定程度上修复软骨损伤，无法应用于骨关节炎造成的骨软骨损伤。目前，来源于骨髓 的间充质干细胞受到越来越多的研究者和医生的重视。骨髓间充质干细胞容易获得，在一定的条件下能够向软骨细胞和成骨细胞分化，不仅能够修复软骨损伤，而且能够同时修复 骨软骨损伤，因而被广泛地应用于临床前期的实验中。但是，干细胞的分化受到周围环境和 生长因子的调控，目前大多数的支架设计都是将生长因子负载于支架中，希望负载的生长 因子能够促进干细胞的定向分化；但生长因子价格昂贵，而且易于失活，大量多次使用生长 因子也会给宿主带来不良反应。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够模拟软骨的结构组成、促进骨髓间充质干细胞向软 骨细胞和成骨细胞分化进而促进骨、软骨组织修复和再生的质粒DNA/纤维蛋白凝胶/聚合 物三元复合支架及其制备方法。 本发明的质粒DNA/纤维蛋白凝胶/聚合物三元复合支架的制备方法，其步骤如 下 1)将季铵化的壳聚糖溶解在磷酸盐缓冲液中，配制成l-10mg/mL的季铵化壳聚糖溶 液，经0. 22 ii m滤膜过滤除菌；质粒DNA配成100-1000 y g/mL的水溶液；将质粒DNA水溶液与 季铵化壳聚糖溶液等体积混合，剧烈震荡混合均匀，静置，制备得到质粒DNA复合粒子；
2)将纤维蛋白原粉末溶解于生理盐水中，配制成浓度为10-80mg/mL的纤维蛋白 原溶液；将凝血酶溶解于氯化钙溶液中，配制成浓度为10-20U/mL的凝血酶氯化钙溶液；
3)将聚合物多孔支架浸入到乙醇中，采用先抽真空，后恢复压力的方法，将乙醇导 入到聚合物多孔支架中；将导入乙醇的支架浸入到三次蒸馏水中，反复进行先抽真空，后恢 复压力的方法，将乙醇置换成水，直至无乙醇残留； 4)将等体积的质粒DNA复合粒子、纤维蛋白原溶液和凝血酶氯化钙溶液利用负压 同时填充到聚合物多孔支架中，将支架置于恒温烘箱中孵育，使纤维蛋白原完全凝固形成 水凝胶，即获得质粒DNA/纤维蛋白凝胶/聚合物三元复合支架。 上述的聚合物多孔支架可以是聚乳酸、聚乳酸_乙醇酸共聚物、聚氨酯或胶原多 孔支架。所说的质粒DNA是能够表达转化生长因子P1(TGF-I3 1)、骨形成蛋白(BMP)或 胰岛素样生长因子(IGF-1)的质粒DNA，可以按照《精编分子生物学实验指南》(Ausubel， Frederick M. ， Kingston Robert E. ， Seidman， J. G.，马学军，舒跃龙等主编，科学出版社， 2005) —书中介绍的方法制备得到或市售。
本发明的有益效果在于 本发明制备的质粒DNA/纤维蛋白凝胶/聚合物三元复合支架，其中聚合物多孔支 架可以提供一定的力学强度和细胞生长的空间；而纤维蛋白凝胶是来源于血液的制品，具 有良好的生物相容性、生物活性和降解性能，能够促进骨髓间充质干细胞的生长；负载的质 粒DNA能够转染骨髓间充质干细胞，原位将干细胞转变成为生长因子的"工厂"，促进干细 胞向软骨细胞和成骨细胞分化，加速骨组织、软骨组织的修复。采用基因治疗可以克服目前 使用生长因子的缺点，有望能够从源头上抑制新生的骨、软骨的褪变。该复合体系具有很强 的修复组织缺损的应用价值。本发明制备方法简单、材料来源广泛、生产效率高。
图1是质粒DNA复合粒子的扫描电镜4
图2是质粒DNA复合粒子粒径分布图； 图3是纤维蛋白原凝胶填充的聚乳酸多孔支架的荧光显微镜图；其中纤维蛋白原
和异硫氰酸荧光素混合，为较亮区域；较暗的区域为聚乳酸多孔支架； 图4是纤维蛋白原凝胶填充的聚乳酸多孔支架的扫描电镜图； 图5是质粒DNA复合粒子在复合支架中的分布；其中较亮点为复合粒子的富集
区； 图6是质粒DNA/纤维蛋白凝胶/聚乳酸_乙醇酸共聚物复合支架的应力应变曲 线图； 图7是将负载质粒DNA的纤维蛋白原凝胶填充的聚乳酸_乙醇酸共聚物支架结 合兔骨髓间充质干细胞用于兔关节软骨再生的动物模型；a)创伤模型；b)填充支架后的结 果； 图8是用western-blot检测得到的TGF-13 l在兔关节缺损处的表达图；其中甘油 醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内标。 图9是兔关节植入12周后缺损处填充新生组织的大体观察图；
图10是兔关节植入12周后新生组织的苏木精_伊红染色图；
图11是兔关节植入12周后新生组织的番红染色粘多糖图；
图12是兔关节植入12周后新生组织的II型胶原免疫组化染色图；
具体实施方法 以下结合实例进一步说明本发明，但这些实例并不用来限制本发明。
实例1 : 1)将季铵化的壳聚糖溶解在pH 7. 4的磷酸盐缓冲液中，配制成lmg/ml溶液，经 0. 22 ii m滤膜过滤除菌；将能够表达BMP的质粒DNA配制成500 y g/mL的水溶液；将质粒 DNA与季铵化的壳聚糖溶液等体积混合，剧烈震荡混合均匀，静置，制备得到质粒DNA复合 粒子；质粒DNA复合粒子的形貌和粒径分布分别如图1和图2。 2)将纤维蛋白原粉末溶于生理盐水中，配制成浓度为40mg/mL的纤维蛋白原溶 液；将凝血酶溶解于40mM氯化钙溶液中，配制成浓度为10U/mL的凝血酶氯化钙溶液；
3)将聚乳酸多孔支架浸入到乙醇中，采用先抽真空，后恢复压力的方法，将乙醇导 入到聚乳酸多孔支架中，直到支架完全地浸入到乙醇中；将导入乙醇的支架浸入到三次蒸 馏水中，采用先抽真空，后恢复压力的方法，将乙醇置换成水，反复进行置换IO次，每次IO 分钟，至无乙醇残留； 4)按等体积取上述制备的质粒DNA复合粒子、纤维蛋白原溶液以及凝血酶溶液利 用负压同时填充到聚乳酸多孔支架中，将支架置于37t:恒温烘箱中孵育10分钟，使纤维蛋 白原完全凝胶，即获得质粒DNA/纤维蛋白凝胶/聚乳酸三元复合支架。凝胶在聚乳酸支架 中的分布见图3、图4，可见纤维蛋白凝胶可以均匀地填充到聚乳酸多孔支架中。质粒DNA 复合粒子也能够均匀分散在复合支架中(如图5)。
实例2 : 1)将季铵化的壳聚糖溶解在pH 7. 4的磷酸盐缓冲液中，配制成2. 5mg/mL溶液，经 0. 22 ii m滤膜过滤除菌；将能够表达TGF- P 1的质粒DNA配制成1000 y g/mL的水溶液；将 质粒DNA与季铵化的壳聚糖溶液等比混合，剧烈震荡混合均匀，静置，制备得到质粒DNA复合粒子； 2)将纤维蛋白原粉末溶于生理盐水中，配制成浓度为80mg/mL的纤维蛋白原溶 液；将凝血酶溶解于40mM氯化钙溶液中，配制成浓度为20U/mL的凝血酶氯化钙溶液；
3)将聚乳酸-乙醇酸共聚物多孔支架浸入到乙醇中，采用先抽真空，后恢复压力 的方法，将乙醇导入到聚乳酸-乙醇酸共聚物多孔支架中，直到支架完全地浸入到乙醇中； 将导入乙醇的支架浸入到三次蒸馏水中，采用先抽真空，后恢复压力的方法，将乙醇置换成 水，反复进行置换10次，每次10分钟，至无乙醇残留； 4)按等体积取上述制备的质粒DNA复合粒子、新西兰大白兔骨髓间充质干细胞、 纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液一起利用负压同时填充到聚乳酸_乙醇酸共聚物多孔支架 中，将支架置于37t:恒温烘箱中孵育10分钟，使纤维蛋白原完全凝胶，制备得到骨髓间充 质干细胞/质粒DNA/纤维蛋白凝胶/聚乳酸_乙醇酸共聚物的复合支架。该复合支架的 应力应变曲线如图6所示，可见该复合支架具有较好的压縮强度。 5)将步骤4)得到的复合支架种植到新西兰大白兔膝关节骨软骨缺损处(图7)， 2周和4周取样用western-blot检测其中TGF-P 1表达情况，可以看到TGF-P 1在兔关节 缺损处在移植2周和4周后有明显的表达(图8) ;12周后取样大体观察如图，可见缺损处 平整光滑，新生组织填满整个缺损且与宿主组织结合良好(图9);将体内12周样品，分别 进行苏木精-伊红染色(图10)、番红染色(图11)、II型胶原免疫组化染色(图12)，可以 看到新生软骨富含粘多糖和II型胶原，厚度和自体软骨厚度基本一致，且与新生的软骨下 骨结合良好。
实例3 : 1)将季铵化的壳聚糖溶解在pH 7. 4的磷酸盐缓冲液中，配制成10mg/mL溶液，经 0. 22 ii m滤膜过滤除菌；将能够表达IGF-1的质粒DNA配制成100 y g/mL的水溶液；将质粒 DNA与季铵化的壳聚糖溶液等比混合，剧烈震荡混合均匀，静置，制备得到质粒DNA复合粒 子； 2)将纤维蛋白原粉末溶于生理盐水中，配制成浓度为10mg/mL的纤维蛋白原溶 液；将凝血酶溶解于40mM氯化钙溶液中，配制成浓度为15U/mL的凝血酶氯化钙溶液；
3)将聚氨酯多孔支架浸入到乙醇中，采用先抽真空，后恢复压力的方法，将乙醇导 入到聚氨酯多孔支架中，直到支架完全地浸入到乙醇中；将导入乙醇的支架浸入到三次蒸 馏水中，采用先抽真空，后恢复压力的方法，将乙醇置换成水，反复进行置换IO次，每次IO 分钟，至无乙醇残留； 4)按等体积取上述制备的质粒DNA复合粒子、纤维蛋白原溶液以及凝血酶溶液利
用负压同时填充到聚氨酯多孔支架中，将支架置于37t:恒温烘箱中孵育10分钟，使纤维蛋
白原完全凝胶，即获得质粒DNA/纤维蛋白凝胶/聚氨酯三元复合支架。
实例7 : 1)用实例1步骤1); 2)用实例1步骤2); 3)用实例1步骤3)，但使用的是胶原多孔支架； 4)用实例1步骤4)，获得质粒DNA/纤维蛋白凝胶/胶原三元复合支架。
权利要求
一种质粒DNA/纤维蛋白凝胶/聚合物三元复合支架的制备方法，其步骤如下1)将季铵化的壳聚糖溶解在磷酸盐缓冲液中，配制成1-10mg/mL的季铵化壳聚糖溶液，经0.22μm滤膜过滤除菌；质粒DNA配成100-1000μg/mL的水溶液；将质粒DNA水溶液与季铵化壳聚糖溶液等体积混合，剧烈震荡混合均匀，静置，制备得到质粒DNA复合粒子；2)将纤维蛋白原溶解于生理盐水中，配制成浓度为10-80mg/mL的纤维蛋白原溶液；将凝血酶溶解于氯化钙溶液中，配制成浓度为10-20U/mL的凝血酶氯化钙溶液；3)将聚合物多孔支架浸入到乙醇中，采用先抽真空，后恢复压力的方法，将乙醇导入到聚合物多孔支架中；将导入乙醇的支架浸入到三次蒸馏水中，反复进行先抽真空，后恢复压力的方法，将乙醇置换成水，直至无乙醇残留；4)将等体积的质粒DNA复合粒子、纤维蛋白原溶液和凝血酶氯化钙溶液利用负压同时填充到聚合物多孔支架中，将支架置于恒温烘箱中孵育，使纤维蛋白原完全凝固形成水凝胶，即获得质粒DNA/纤维蛋白凝胶/聚合物三元复合支架。
2. 按权利要求1所述的质粒DNA/纤维蛋白凝胶/聚合物三元复合支架的制备方法，其 特征在于所说的聚合物多孔支架是聚乳酸、聚乳酸_乙醇酸共聚物、聚氨酯或胶原多孔支 架。
3. 按权利要求1所述的质粒DNA/纤维蛋白凝胶/聚合物三元复合支架的制备方法，其 特征在于所说的质粒DNA是能够表达转化生长因子13 1、骨形成蛋白或胰岛素样生长因子 的质粒DNA。
全文摘要
本发明公开的质粒DNA/纤维蛋白凝胶/聚合物三元复合支架的制备方法，步骤如下将季铵化壳聚糖溶液与质粒DNA溶液等比混合均匀，制备得到质粒DNA复合粒子；将纤维蛋白原溶解于生理盐水中配制成纤维蛋白原溶液；将凝血酶溶解于氯化钙溶液中配制成凝血酶氯化钙溶液；将聚合物多孔支架用乙醇灭菌处理；将等体积的质粒DNA复合粒子、纤维蛋白原溶液和凝血酶氯化钙溶液利用负压同时填充到聚合物多孔支架中，置于恒温烘箱，使纤维蛋白原完全凝胶，即可。本发明制备方法简便、材料来源广泛，能够模拟人体天然软骨的组成和结构，本发明的复合支架具有良好的力学性能和生物活性，能加速软骨、骨组织的修复，具有很强的软骨、骨修复的应用价值。
文档编号A61L27/00GK101716382SQ20091015511
公开日2010年6月2日 申请日期2009年12月2日 优先权日2009年12月2日
发明者李博, 毛峥伟, 王玮, 赵海光, 高长有 申请人:浙江大学