铁剂在提升缺铁性贫血病人B细胞水平中的应用的制作方法

本发明涉及铁剂在提升缺铁性贫血病人b细胞水平中的应用；即铁剂(叶酸亚铁)在给予缺铁性贫血病人时，能显著回复贫血导致的b细胞水平下降的症状。

背景技术：

铁对人类健康至关重要，参与到众多生理过程，如氧气运输，呼吸作用，dna合成等等。铁主要通过小肠上皮吸收进入血液，细胞表面的转铁蛋白受体结合载铁转铁蛋白，形成内吞小泡，膜上的金属还原酶steap3将转铁蛋白上的三价铁离子还原为二价，随后铁通过dmt1进入胞质。膳食铁摄入过低或参与到铁吸收过程的蛋白功能缺陷后，均会导致机体铁缺乏。铁缺乏对应的临床疾病主要是缺铁性贫血，症状为乏力、易倦、头晕、头痛、眼花、耳鸣、心悸、气短、纳差、苍白、心率增快等等。

单纯缺铁性贫血患者给予铁剂补充就可以得到有效缓解，很大程度上得益于铁对造血系统特别是红细胞生成的促进作用，这部分的基础研究和分子机制已经较为明确，即铁作为血红蛋白关键成分(血红素)以及氧化呼吸链组分(铁硫簇)的主要原料，促进了这两个生理过程，从而恢复了贫血病人的健康。但缺铁和免疫力低下的关联目前并不明确，且铁参与何种途径维持免疫功能还不甚清楚。流行病学研究有关铁和免疫功能的研究甚少，还不清楚铁在人群免疫功能中扮演的角色。

人群免疫力的一个重要因素是血浆抗体水平。合理范围的抗体水平对于维持机体对抗外界异源入侵很重要。在感染和疫苗接种过程中，抗体水平很大程度上决定了患者/接种者能否抵抗感染/产生有效免疫。b细胞是抗体的主要分泌来源，正常情况下，b细胞水平和机体抗体水平成正比，也是反映体液免疫的主要指标之一。b细胞的数量、增殖活力是维持正常抗体水平的必要条件。目前还没有b细胞和铁代谢的分子机制研究，因此，在人群和动物模型中，研究铁调控免疫功能的作用机制以及评估铁剂对缺铁性贫血病人/小鼠的免疫功能的回复作用，对于维持人群的免疫系统健康有重要的指导意义。

目前已知的先天性铁粒幼细胞贫血的治疗手段为促红细胞生成素，输血或维生素b6。

目前常用的补血铁剂有硫酸亚铁、乳酸亚铁、富马酸亚铁、琥珀酸亚铁、葡萄糖酸亚铁和枸橼酸铁铵(柠檬酸铁)等。铁剂能用于治疗缺铁性贫血，缺铁性贫血的主要病因是缺铁导致的红细胞缺乏，即，铁剂针对的是红细胞缺乏。而缺铁性贫血伴随的b细胞数量下降，免疫力降低的机制和治疗手段是未知的，也没有人清楚铁剂对体液免疫的治疗效果如何。

叶酸亚铁(叶酸亚铁片)以富马酸亚铁、叶酸为主要原料，还包括辅料(例如微晶纤维素、预胶化淀粉、糊精、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸镁、聚丙烯酸树脂、羟丙甲纤维素、聚乙二醇4000)。例如市购的叶酸亚铁片，每片含铁14.6mg、叶酸217μg。叶酸亚铁主要是给孕妇补充叶酸和铁的，防止胎儿神经血管畸形和防止贫血的。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种铁剂在提升缺铁性贫血病人b细胞数量中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供铁剂在提升缺铁性贫血病人b细胞水平(浆细胞数量)中的应用。

作为本发明应用的改进：所述铁剂为叶酸亚铁。

即，本发明提供铁在提升缺铁性贫血病人b细胞水平及抗体水平的应用，为新药研发和创新疗法提供基础。

在发明过程中，发明人发现缺铁性贫血病人的b细胞数量下降，铁剂叶酸亚铁补充2个月之后(每日一片，约含有14.6mg铁)，b细胞数量显著增多。同时在膳食低铁小鼠和基因敲除贫血模型小鼠中都发现b细胞数量与功能的缺陷，体外给细胞补充铁剂(柠檬酸铁或者硫酸亚铁)显著的恢复了这些细胞的缺陷表型。深入研究后，发现铁剂促进cycline1的转录，进而维持b细胞的增殖能力。该研究结果为铁改善缺铁性贫血病人免疫功能提供了理论依据和分子机制，特别是对相关药物研发提供了基础。

需要强调的是：补血和提升b细胞水平是完全不同的两个概念。

综上所述，本发明发现了铁剂叶酸亚铁可用于制备治疗缺铁性贫血引发的b细胞功能缺陷的药物，扩大了铁剂的临床应用。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为医院招募的健康人群及缺铁性贫血病人的血清铁(a左)和血液b细胞数量(a右)；以及跟踪实验中10名病人补铁前后的血清铁(b左)和血液b细胞数量(b右)；浙江省疾病控制中心麻疹疫苗人群血清铁和血清抗体水平的一元线性回归曲线(c左)及转铁蛋白饱和度和血清抗体水平的一元线性回归曲线(c右)。

图2为dnp-ficoll免疫正常小鼠和膳食低铁小鼠后，第0天、第7天和第14天血清抗体水平(a)；正常小鼠和膳食低铁小鼠在dnp-klh或绵羊红细胞刺激后脾脏生发中心b细胞比例(b)；20μmdfo或磷酸盐缓冲液处理b细胞后，使用cd40抗体，igm或lps刺激b细胞，通过³h胸苷掺入实验检测细胞增殖能力(c)，通过活细胞计数检测活细胞数量(d)；使用cfse染色实验检测b细胞增殖水平(e)；

图2的c、d中，每组从左至右分别代表：control、+dfo、+dfo+fac、+fac；

图3为流式实验检测steap3敲除鼠及对照脾脏b细胞比例(a)和数量(b)；cfse染色检测igm/lps刺激下，steap3敲除b细胞及对照的增殖能力(c)；通过³h胸苷掺入实验检测细胞增殖能力(d)，通过活细胞计数检测活细胞数量(e)。

图4为微芯片实验检测分析dfo处理后b细胞转录组差异(a)；brdu染色实验检测dfo处理后b细胞细胞周期(b)；实时荧光定量pcr检测dfo处理后细胞周期调控成员的表达水平(c)；免疫印迹实验检测dfo和/或fac处理b细胞后，cycline1的蛋白水平(d)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

1.材料和方法

1.1人群实验

人群补铁实验：在医院征集到16名健康人群和21名缺铁性贫血患者，抽血采样后检测其血清铁水平和血液b细胞数量。贫血患者随后给予叶酸亚铁口服治疗(521mg每天，相当于14.6mg铁)，对其中的10位病人进行病情追踪，2个月后，抽血检测血清铁水平和血液b细胞数量。所有受试者均签署知情同意书。

麻疹疫苗人群横断面研究：血清样本来自浙江省麻疹疫苗调查项目。从5个浙江省地级市采样。本研究采用其中的10岁以上排除急性感染的人群血清。所有样品来源人员包括本人和/或监护人均签署知情同意书。血清学研究按照世界卫生组织标准在浙江省疾控中心麻疹实验室完成(酶联免疫标记法检测血清中的抗麻疹疫苗免疫球蛋白水平)。血清铁(serumiron)和未饱和的转铁蛋白能力(theunsaturatedironbindingcapacity,uibc)使用血清铁试剂盒(iron/uibc,pointescientific,inc)检测，转铁蛋白饱和度ts(％)使用下列公式计算得出ts(％)＝serumiron/(serumiron+uibc)×100。

1.2实验动物

3周龄spf级c57bl/6雄性小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司，spf环境饲养。标准饲料ain-76a(铁含量50mg/kg，researchdiets,inc)适应喂养3天后，按体重随机分组，每组6～8只。分为标准组，低铁组，其中标准组继续用标准饲料喂养5周，而低铁组使用低铁饲料(ain-76a-402，铁含量0.9mg/kg，researchdiets,inc)喂养5周，构建膳食低铁模型，随后小鼠用于后续实验。steap3敲除小鼠使用steap3杂合子小鼠自交获得，均为c57bl/6背景，敲除小鼠及其同笼对照于3周至6周龄处死用于后续实验。

dnp-ficoll免疫试验：八周龄的正常c57bl/6小鼠(标准组)以及膳食低铁模型小鼠(低铁组)腹腔注射25微克dnp-ficoll(生工公司)(溶于300微升磷酸盐缓冲液)。免疫后在指定时间收集血清，使用dnp抗体酶联免疫试剂盒(南方生工公司)检测抗体水平。

1.3药物及处理

叶酸亚铁片为医院处方药。化合物柠檬酸铁、硫酸亚铁、去铁胺均购自sigma-aldrich公司。叶酸亚铁片口服1片/天，共服用2个月。柠檬酸铁(fac)、硫酸亚铁(fe²⁺)、去铁胺(dfo)溶于超纯水，分别按照100μm，100μm和20μm的浓度处理细胞。

图2c、2d、2e(采用fac和dfo)，图3c(采用fe²⁺)，图4a、4b、4c、4d(采用fac和dfo)。

1.4细胞学实验

细胞增殖实验：脾脏b细胞使用磁珠分选技术(macs)阴选法分离得到(stemcell公司)使用b220抗体确认细胞纯度超过96％。在pbs体系中使用1豪摩尔的cfse(羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂，sigma公司)标记脾脏b细胞10分钟，用含有10％胎牛血清的rpmi1840培养基洗2次。随后按照每毫升一百万个细胞的密度铺板，培养基为含有10％胎牛血清的rpmi1840培养基同时加入0.05毫摩尔的β-巯基乙醇，1毫摩尔的丙酮酸钠，100单位/毫升的青霉素和100微克每毫升的链霉素。使用10微克每毫升f(ab’)2羊抗小鼠免疫球蛋白(jackson公司)、大肠杆菌来源的脂多糖(o111:b4，2μg/ml；sigma-aldrich)、重组baff蛋白(100ng/ml；r&dsystems)或者cd40抗体(1μg/ml；bdbiosciences)处理细胞。处理72小时后，使用流式细胞仪检测荧光强度，即为cfse水平。

细胞活力实验：纯化后的b细胞按照20万每孔(200微升)的密度铺在96孔板上，随后按照上述处理条件处理72小时后，加入0.4豪居里的³h胸苷孵育12小时，随后用于检测。

brdu染色实验：使用brdu试剂盒(bd公司)染色不同处理情况下的脾脏b细胞，使用flowjo软件分析结果。

1.5转录组微芯片分析

rna抽提反转为cdna后使用affimatrixdna微芯片检测转录组水平。

1.6rna提取和荧光定量实时pcr

trizol(lifetechnologies)法提取细胞和组织的rna，具体操作按说明书进行。nanodrop1000spectrophotometer上检测rna纯度(od260/od280≈1.9-2.1)及rna浓度(ng/μl)，调整rna浓度到1μg/μl。

2.0μgrna经dnase(promega)处理后，m-mlv反转录酶(promega)和oligo(dt)18primer(takarabioinc.)进行反转录。cfx96real-timesystem(bio-rad)中进行荧光定量实时(real-timepcr)检测mrna水平各相关基因表达，检测体积为10ul，试剂采用iqsybrgreensupermix(bio-rad)，引物序列如下：

real-timepcrprimer

ccnf-ftcaggttctgtggagaaggc

ccnf-rttctgttggggacatccttg

ccnb2-fcttgcagagcagagcatcag

ccnb2-rtgaaaccagtgcagatggag

ccne1-ftccacgcatgctgaattatc

ccne1-rctccagaaaaaggaaggcaa

ccnd2-fgagtgggaactggtagtgttg

ccnd2-rcgcacagagcgatgaaggt

cdc20-fttggccatggttggatactt

cdc20-rgagtgctgtggatgtgcatt

ccna2-fgtggtgattcaaaactgcca

ccna2-rggccagctgagcttaaagaa

bcl2l1-fctgcattgttcccgtagaga

bcl2l1-rggtgagtcggattgcaagtt

gapdh-fctaaggccaaccgtgaaa

gapdh-ragaaggaaggctggaaaa

1.7蛋白水平检测

使用蛋白裂解液裂解细胞获得总蛋白，通过bca法检测蛋白浓度。使用1-％-12％的sds-page胶进行电泳，随后用湿法电转移到pvdf膜上。使用5％脱脂牛奶(溶于1％吐温的tbst)室温封闭1.5小时后，使用一抗孵育四度过夜。1％吐温的tbst洗3遍，每遍10分钟。孵育二抗室温1小时，1％吐温的tbst洗3遍，每遍10分钟。最后用ecl显色发光液(pierce)显色，并用胶片曝光适当时间后冲洗。rel-b，bcl-xl一抗采购自cst，cyclin-e1一抗采购自proteintech，gapdh一抗采购自康成。

1.8统计方法

全部数据采用均数±标准误(mean±sem)表示，使用graphpadprism(version6.0,graphpadsoftware；sandiego,ca,usa)统计学软件进行统计学分析。*表示p＜0.05代表差异有显著性，具有统计学意义,**表示p＜0.01代表差异有显著性，具有统计学意义。

2.结果

征募到16个健康人和21个缺铁性贫血病人。采集血液样本，检测血清铁和血液b细胞数量。挑选10个病人跟踪实验，经过2个月的口服叶酸亚铁治疗后，采集血液，检测血清铁和血液b细胞数量。

结果显示，缺铁性贫血病人的血清铁含量显著低于健康人(图1a)，同时血液b细胞数量也低于健康人群(图1a)。经过2个月的口服叶酸亚铁治疗后，病人的血清铁含量显著回升(图1b)，也观察到b细胞数量的回升(图1b)。说明口服叶酸亚铁可以显著的回复缺铁性贫血病人的b细胞数量，提示铁剂有提升病人免疫力的潜在价值。

同时发明人还设置实验对比了其他铁剂对病人的治疗效果，发现叶酸亚铁的提升b细胞数量效果最显著(提升100％左右)，而其他铁剂如目前常用的补血铁剂----硫酸亚铁、乳酸亚铁、富马酸亚铁、琥珀酸亚铁、葡萄糖酸亚铁和枸橼酸铁铵对贫血病人的效果均不如叶酸亚铁(仅仅提升30％左右)。

收集328个浙江地区麻疹疫苗人群的血清，检测血清铁含量、转铁蛋白饱和度以及麻疹抗体浓度，发现在10岁以上人群中，观察到血清铁含量/转铁蛋白饱和度和麻疹抗体浓度有正相关联(图1c)。从流行病学角度证明血清铁和人群抗体免疫能力有正向联系。

发明人随后构建了膳食低铁的小鼠模型，比较了低铁小鼠和正常小鼠的免疫后抗体产生能力以及脾脏生发中心的b细胞比例。发现低铁诱导小鼠的免疫后抗体水平低于正常小鼠(图2a)，生发中心b细胞(germinalcenterbcells,抗体的主要分泌来源)比例亦下降(图2b)。说明在小鼠模型中，低铁同样不利于体液免疫，包括抗体的产生和生发中心b细胞比例。铁螯合剂(dfo)预处理会抑制体外分离的脾脏b细胞在不同bcr上游刺激下b细胞的数量(图2c)和增殖能力(³h胸苷掺入实验)(图2d)，而铁剂柠檬酸铁(fac)可以有效的回复dfo的抑制效果。同时发明人通过cfse染色实验同样观察到了dfo显著的抑制了b细胞活化情况下的细胞增殖能力(图2e)，而这种抑制可以被fac回复。

除了膳食低铁模型和体外铁螯合细胞实验以外，发明人还构建了遗传性低铁小鼠模型---steap3敲除小鼠，steap3是一种金属离子还原酶，将3价铁还原为2价铁帮助铁吸收进入细胞(详见技术背景)。因此steap3敲除小鼠(下称敲除型)是典型的铁缺乏小鼠。流式分析发现敲除型的脾脏b细胞比例(图3a)和绝对数量(图3b)显著低于同笼野生型对照小鼠(下称野生型)，cfse染色实验同样观察到敲除型b细胞(45.2)的增殖能力低于野生型(45.1)，而使用二价铁(硫酸亚铁)处理可以有效的回复敲除型b细胞的增殖缺陷(图3c)。进一步的³h胸苷掺入实验(图3d)和活细胞计数实验(图3e)也证明敲除型的b细胞增殖能力显著低于野生型。

为了寻找铁调控b细胞增殖能力的分子机制，发明人将dfo处理后的细胞和对照的转录组进行了微芯片分析，发现dfo处理后，细胞周期信号通路出现了显著下调(图4a)，这表明铁主要参与到b细胞的细胞周期通路中。使用brdu染色检测dfo处理后b细胞的细胞周期水平也发现细胞表现为g1/s阻滞，而fac处理回复了这种缺陷(图4b)。使用实时荧光定量pcr技术检测细胞周期家族成员的表达水平发现dfo特异性的下调了cycline1的转录水平(图4c)，免疫印迹实验也从蛋白水平证明了这一点(图4d)，fac处理可以完全回复cycline1的蛋白水平。

综上，发明人结合人群流行病学、动物模型以及细胞实验发现了铁通过参与细胞周期对b细胞增殖能力及机体抗体生成的调控作用，并发现铁剂--叶酸亚铁对b细胞的存活和体内抗体生成的促进作用。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110>浙江大学

中国科学院上海生命科学研究院

<120>铁剂在提升缺铁性贫血病人b细胞水平中的应用

<160>16

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tcaggttctgtggagaaggc20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ttctgttggggacatccttg20

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

cttgcagagcagagcatcag20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

tgaaaccagtgcagatggag20

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

tccacgcatgctgaattatc20

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

ctccagaaaaaggaaggcaa20

<210>7

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

gagtgggaactggtagtgttg21

<210>8

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

cgcacagagcgatgaaggt19

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

ttggccatggttggatactt20

<210>10

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

gagtgctgtggatgtgcatt20

<210>11

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

gtggtgattcaaaactgcca20

<210>12

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

ggccagctgagcttaaagaa20

<210>13

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

ctgcattgttcccgtagaga20

<210>14

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>14

ggtgagtcggattgcaagtt20

<210>15

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>15

ctaaggccaaccgtgaaa18

<210>16

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>16

agaaggaaggctggaaaa18