5-甲氧基黄酮在制备无义突变通读药物中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药领域，具体涉及5-甲氧基黄酮在制备无义突变通读药物中的应用以及一种无义突变通读药物。

背景技术：

研究发现，30％的人类致病基因突变属于无义突变，无义突变与肿瘤和遗传病在内的许多疾病发生有关。无义突变可导致编码氨基酸的密码子突变为终止密码子，提前终止密码子的出现会引起肽链合成终止，生成无功能或或功能不全的截短蛋白；还会使mrna滞留在细胞核内的时间延长，甚至通过无义介导mrna衰减(nonsense-mediatedmrnadecay)途径使mrna被选择性降解，造成编码蛋白缺失。

研究表明，某些化合物具有无义突变通读活性，在类同功trna作用下，可诱使核糖体跨过无义突变位点，诱导提前终止密码子位点通读，使全长蛋白继续翻译而恢复其功能；另有一些通读化合物还可抑制nmd途径，增加mrna稳定性，提高蛋白表达水平。因此，这些无义突变通读化合物可能具有潜在的药物价值。越来越多的证据也表明，通读化合物的发现为众多无义突变所致的稀有疾病带来了希望，具有重大的临床意义。

虽然已经开展了大量基于通读活性的药物开发实验，但目前显示出明确临床疗效的化合物少之又少。因此，急需筛选出具有低毒性、广谱和高通读效率特点的化合物，并使其能够广泛应用于临床。有关通读活性的检测原理基本建立在报告基因检测上，通过对细胞内通读活性的检测，可以极大提高实验结果的准确性。

5-甲氧基黄酮(5-methoxyflavone)，分子式为c16h12o3，分子量为252.26。该化合物是一种天然存在的低分子量黄酮类化合物，与多种生物活性有关。目前尚无公开文献报道其无义突变通读活性的用途。

技术实现要素：

本发明所针对现有无义突变通读剂种类少、通读效率低等问题，提供了5-甲氧基黄酮作为无义突变通读剂在制备无义突变通读药物中的应用。

本发明还提供了一种无义突变通读药物，包括5-甲氧基黄酮。

进一步，所述无义突变通读药物还包含药学可接受的载剂、赋形剂、稀释剂、佐剂中的一种或多种。

本发明检测了5-甲氧基黄酮的无义突变通读活性，作为一种新的无义突变通读剂，其通读效率高，毒性低，可以应用于制备无义突变通读药物，制备的无义突变通读药物通读效率高。

附图说明

图1为本发明含有无义突变的荧光素酶基因的hek293mut细胞分别经5-甲氧基黄酮和g418处理后的荧光素酶的相对发光值图；

图2为本发明含有无义突变的荧光素酶基因的hek293mut细胞分别经5-甲氧基黄酮和g418处理以及对照组(control)的荧光素酶蛋白的western图；

图3为本发明含有无义突变apc基因的ht29细胞分别经5-甲氧基黄酮和g418处理、对照组(control)以及含有野生型apc基因的hct116细胞的荧光素酶蛋白的western图；

图4为人肺上皮细胞16hbe细胞在不同浓度的5-甲氧基黄酮和g418下细胞的存活率。

具体实施方式

以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

5-甲氧基黄酮(5-methoxyflavone)分子式为分子式为c16h12o3，分子量为252.26，结构式为

该化合物是一种天然存在的低分子量黄酮类化合物，与多种生物活性有关。发明人意外发现该化合物具有无义突变通读活性。

实施例15-甲氧基黄酮在荧光素酶细胞模型中的无义突变通读活性检测

(1)5-甲氧基黄酮处理对无义突变荧光素酶活性恢复的检测

将本实验室制备的含无义突变荧光素酶基因的hek293mut细胞(谢骁祥,袁辉,王震宇,程静,吴磊,杜柳涛,江高峰*.无义突变型荧光素酶稳定表达细胞株的建立.药物分析杂志2017；34(4):583-588)接种于24孔培养板上，并分为三组，无药物处理组(阴性对照组)、已知通读剂g418(终浓度10μmol/l)处理组(阳性对照组)和5-甲氧基黄酮(终浓度10μmol/l)处理组，培养48h后，破碎细胞，按照荧光素酶报告基因检测试剂盒说明操作，检测各组细胞中荧光素酶活性，以不含有无义突变荧光素酶基因的hek293mut细胞的荧光素酶的发光值作为检测本底，每个实验样本均独立操作，实验重复三次以上，结果如图1所示，5-甲氧基黄酮处理后，相对发光值显著升高到到61044.75±13210.501(p<0.05)，而阳性对照组g418处理后，相对发光值升高到11120±3401.818(p<0.05)，从药物处理后荧光素酶活性检测结果可以看出，5-甲氧基黄酮具有无义突变通读活性，且强于g418(p<0.05)。

(2)5-甲氧基黄酮对无义突变荧光素酶蛋白表达恢复的检测

将含有无义突变荧光素酶基因的hek293mut细胞接种于24孔细胞培养板上，并分为三组：无药物处理组(control)、已知通读剂g418(终浓度10μmol/l)处理组(阳性对照组)和5-甲氧基黄酮(终浓度10μmol/l)处理组，培养48h后，提取总蛋白，利用western检测突变型荧光素酶基因的蛋白表达变化，以gapdh作为内参对照，结果如图2所示，结果表明hek293mut细胞无药物处理时，不表达荧光素酶蛋白；经g418和5-甲氧基黄酮处理后，均表达荧光素酶蛋白，且5-甲氧基黄酮组的荧光素酶蛋白表达水平略高于g418组，说明5-甲氧基黄酮与g418一样具有通读无义突变荧光素酶基因的作用，且对无义突变荧光素酶蛋白的表达恢复强于g418。

实施例25-甲氧基黄酮对ht29细胞无义突变apc基因通读活性检测

将无义突变的apc基因与质粒连接，转化ht29细胞得到含有无义突变apc基因的ht29细胞，将含有无义突变apc基因的ht29细胞接种于24孔细胞培养板上，并分为三组：无药物处理的ht29细胞组(control)、已知已知通读剂g418(终浓度10μmol/l)处理的ht29细胞组(阳性对照组)和5-甲氧基黄酮(终浓度10μmol/l)处理的ht29细胞组，将含有正常apc基因的hct116细胞接种于24孔培养板上，不进行药物处理，培养48h后，提取总蛋白，利用western检测apc蛋白的表达变化，以gapdh作为内参对照，结果如图3所示，结果表明，作为阴性对照的无药物处理ht29细胞，不表达apc蛋白；无药物处理的hct116细胞与g418处理的ht29细胞均表达apc蛋白，且前者的蛋白表达水平略高于后者；用5-甲氧基黄酮处理的ht29细胞表达apc蛋白，其表达水平高于g418处理的ht29细胞。这说明5-甲氧基黄酮对ht29细胞无义突变apc基因的通读活性强于g418，可能通过抑制nmd途径，增加mrna稳定性，提高了蛋白表达水平。

实施例35-甲氧基黄酮对正常细胞活性的毒性分析

以商用人肺上皮细胞16hbe细胞为模型，以g418作为对照，用梯度浓度的5-甲氧基黄酮进行处理(0、6.25、12.5、25、50、100μmol/l)，培养48h后，按cck8细胞活性检测试剂盒说明操作，检测各处理中细胞的存活率：

(1)接种细胞悬液于96孔板中，100μl/孔，每孔细胞数量>1000。将培养板在培养箱预培养，于37℃，5％co2的条件下稳定过夜。

(2)做细胞数目测定实验时，向每孔加入10μlcck8溶液，注意不要生成气泡。

(3)将培养板在37℃，5％co2的培养箱内孵育2小时。

(4)用酶标仪测定在450nm处的吸光度(od值)。

每个实验样本均独立操作，实验重复三次以上，数据经统计学分析。结果如图4所示，实验结果表明，0～50μmol/l的药物浓度处理中细胞存活率均大于80％，整体上5-甲氧基黄酮对正常细胞的毒性略小于g418，提示在选择和应用药物时需注意把控浓度。

上述实施例中，用5-甲氧基黄酮直接处理具有无义突变基因的细胞，无义突变基因能够通读，证明5-甲氧基黄酮具有较好的无义突变通读活性，其无义突变通读效率高，毒性低，能够单独作为无义突变通读药物使用，也可以与药学可接受的载剂、赋形剂、稀释剂和佐剂中的一种或多种组合，用于制备无义突变通读药物。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。