本发明涉及生物医药
技术领域：
，具体涉及一种猪用疫苗稀释液的制备方法。
背景技术：
疫苗是指用各类病原微生物制作的用于预防接种的生物制品，免疫接种的目的是诱发机体产生对接种抗原强大的免疫反应，以保护机体免受相应病原体的侵袭。当今疫苗的使用是非常普及的，不论是人还是畜禽都需要接种疫苗，来预防某些疾病。目前，市面上的疫苗虽有使用转移因子稀释液进行疫苗的稀释，但是在一些猪疫苗用转移因子稀释液稀释后，却不能做到完全无菌。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种猪用疫苗稀释液的制备方法，采用本发明提供的制备方法制备得到的稀释液，稀释疫苗后，使得完全无菌。本发明提供了一种猪用疫苗稀释液的制备方法，包括以下步骤：1)将猪脾脏、猪小肠和水混合后进行匀浆，得到匀浆液；2)将步骤1)所述的匀浆液反复冻融6～8次，得到冻融液；3)将步骤2)所述的冻融液与乙酸混合后依次进行搅拌、离心，将得到的离心清液与β-丙内酯混合后灭活，得到灭活液；4)将步骤3)所述的灭活液在35～42℃下进行水解1～3h，得到水解液；5)将步骤4)所述的水解液进行切向流微滤，调节得到的微滤液的ph值为6.5～7.5，得到调节液；6)将步骤5)所述的调节液进行切向流超滤，将得到的超滤液除菌，得到猪用疫苗稀释液。优选的，所述步骤1)猪脾脏的质量与猪小肠的质量、水的体积比为(0.5～1.5):(0.1～0.3):(0.8～1.5)。优选的，所述步骤1)匀浆的速度为8000～12000rpm，所述匀浆的时间为10～20min。优选的，所述步骤3)冻融液与乙酸混合后，乙酸的终浓度为1～3％。优选的，所述步骤3)搅拌的温度为0～10℃，所述搅拌的时间为10～14h，所述搅拌的速度为30～50rpm。优选的，所述步骤3)离心的温度为0～4℃，所述离心的时间为10～20min，所述离心的速度为5000～10000rpm。优选的，所述步骤3)离心清液与β-丙内酯混合后，β-丙内酯的终浓度为0.010～0.015％。优选的，所述步骤3)灭活的温度为5～15℃，所述灭活的时间为24～30h。优选的，所述步骤5)切向流微滤使用的滤膜的孔径为0.22μm。优选的，所述步骤6)切向流超滤使用的超滤膜的分子量为4～8kd。本发明提供的猪用疫苗稀释液的制备方法制备得到的稀释液中含有猪小肠抗菌肽和转移因子，猪小肠抗菌肽结合转移因子，能够完全杀灭疫苗内的无特定病原菌，从而保证疫苗使用的安全。本发明实施例的结果显示：本发明提供的制备方法制备得到的猪用疫苗稀释液能够完全杀灭猪用疫苗的无特定病原菌，能够保证疫苗的使用安全。具体实施方式本发明提供了一种猪用疫苗稀释液的制备方法，包括以下步骤：1)将猪脾脏、猪小肠和水混合后进行匀浆，得到匀浆液；2)将步骤1)所述的匀浆液反复冻融6～8次，得到冻融液；3)将步骤2)所述的冻融液与乙酸混合后依次进行搅拌、离心，将得到的离心清液与β-丙内酯混合后灭活，得到灭活液；4)将步骤3)所述的灭活液在35～42℃下进行水解1～3h，得到水解液；5)将步骤4)所述的水解液进行切向流微滤，调节得到的微滤液的ph值为6.5～7.5，得到调节液；6)将步骤5)所述的调节液进行切向流超滤，将得到的超滤液除菌，得到猪用疫苗稀释液。本发明将猪脾脏、猪小肠和水混合后进行匀浆，得到匀浆液。本发明优选将猪脾脏和猪小肠用水洗净、去皮去脂去筋后再用绞肉机绞碎后再与水混合匀浆，所述猪脾脏和猪小肠均来自新鲜的健康动物物体。在本发明中，猪脾脏的质量与猪小肠的质量、水的体积比为(0.5～1.5):(0.1～0.3):(0.8～1.5)，优选为(0.8～1.2):(0.15～0.25):(1～1.3)，更优选为1:0.2:1.2。本发明能够从猪脾脏中分离得到转移因子，本发明能够从猪小肠中分离得到抗菌肽。在本发明中，所述水优选为注射用水。在本发明中，所述匀浆的速度优选为8000～12000rpm，更优选为9000～11000rpm，最优选为10000rpm；所述匀浆的时间优选为10～20min，更优选为12～18min，最优选为15min。本发明将所述匀浆液反复冻融6～8次，得到冻融液，优选反复冻融7次。在本发明中，所述反复冻融是为了使细胞破碎。本发明将所述冻融液与乙酸混合后依次进行搅拌、离心，将得到的离心清液与β-丙内酯混合后灭活，得到灭活液。在本发明中，所述冻融液与乙酸混合后，乙酸的终浓度优选为1～3％，更优选为2％。在本发明中，所述乙酸能够使猪小肠中的抗菌肽更好的分离出来。在本发明中，所述搅拌的温度优选为0～10℃，更优选为2～8℃，最优选为4～6℃；所述搅拌的时间优选为10～14h，更优选为11～13h，最优选为12h；所述搅拌的速度优选为30～50rpm，更优选为35～45rpm，最优选为40rpm。在本发明中，所述离心的温度优选为0～4℃；所述离心的时间优选为10～20min，更优选为12～18min，最优选为15min；所述离心的速度优选为5000～10000rpm，更优选为6000～9000rpm，最优选为8000rpm。在本发明中，所述离心清液与β-丙内酯混合后，β-丙内酯的终浓度优选为0.010～0.015％，更优选为0.012％。在本发明中，所述β-丙内酯对离心清液进行灭活。在本发明中，所述灭活的时间优选为24～30h，更优选为26～28h，最优选为27h；所述灭活的温度优选为5～15℃，更优选为8～12℃，最优选为10℃。本发明将所述灭活液在35～42℃下进行水解1～3h，得到水解液，优选在37℃下水解1.5～2.5h，所述水解的时间最优选为2h。在本发明中，所述β-丙内酯经37℃可自动水解为无毒的β羟基丙酸。本发明将水解液进行切向流微滤，调节得到的微滤液的ph值为6.5～7.5，得到调节液。在本发明中，所述切向流微滤使用的滤膜的孔径优选为0.22μm。在本发明中，所述调节微滤液的ph值优选为6.8～7.2，更优选为7。本发明将所述调节液进行切向流超滤，将得到的超滤液除菌，得到猪用疫苗稀释液。在本发明中，所述切向流超滤使用的超滤膜的分子量优选为4～8kd，更优选为5～7kd，最优选为6kd。在本发明中，所述除菌优选使用除菌过滤器进行除菌，所述除菌过滤器的滤膜孔径优选为0.1μm。本发明对所述超滤的条件参数无特殊限定，采用常规超滤的条件参数即可。在本发明中，所述猪用疫苗稀释液中含有猪脾转移因子和猪小肠抗菌肽分别具有增强免疫和杀菌的作用。本发明对所述猪用疫苗稀释液的使用方法和使用剂量没有特殊限定，根据所稀释的疫苗进行常规选择。下面结合具体实施例对本发明所述的一种猪用疫苗稀释液的制备方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。实施例1(1)将猪脾脏与猪小肠清洗干净，去皮去脂去筋，用注射用水洗净备用，猪脾脏和猪小肠都均来自新鲜的健康动物体；(2)将处理好的猪脾脏10l和猪小肠2l放入绞肉机绞碎，然后将得到的绞碎物按体积比1:1加注射用水，置于捣碎机在转速为10000rpm下匀浆15min，得匀浆液；(3)将匀浆液反复冻融7次，得到冻融液；(4)将冻融液加入终浓度为1％的乙酸后，在10℃内搅拌10小时，再置于4℃，以8000rpm离心15min，取离心清液于无菌罐中，将离心清液混合加入终浓度为0.012％的β-丙内酯，于10℃以内灭活24小时，将得到的灭活液置于37℃水解2小时，得到水解液；(5)将水解液经0.22μm滤膜进行切向流微滤，收集滤透液，并调节ph值至7.5，得到调节液。(6)将调节液经4kd超滤膜进行切向流超滤，收集超滤透过液，再用0.1μm除菌过滤器除菌，收集滤液，无菌分装即为猪用疫苗稀释液成品。实施例2(1)将猪脾脏与猪小肠清洗干净，去皮去脂去筋，用注射用水洗净备用，猪脾脏和猪小肠都均来自新鲜的健康动物体；(2)将处理好的猪脾脏10l和猪小肠2l放入绞肉机绞碎，然后将得到的绞碎物按体积比为1:1加注射用水，置于捣碎机在转速为10000rpm下匀浆15min，得匀浆液；(3)将匀浆液反复冻融7次，得到冻融液；(4)将冻融液加入终浓度为2％的乙酸，在10℃内搅拌10小时，再置于4℃，以8000rpm离心15min，取上清液于无菌罐中，将离心清液混合加入终浓度为0.012％的β-丙内酯，于10℃以内灭活24小时，将得到的灭活液置于37℃水解2小时，得到水解液；(5)将水解液经0.22μm滤膜进行切向流微滤，收集滤透液，并调节ph值至7.5，得到调节液。(6)将调节液经4kd超滤膜进行切向流超滤，收集超滤透过液，再用0.1μm除菌过滤器除菌，收集滤液，无菌分装即为猪用疫苗稀释液成品。实施例3(1)将猪脾脏与猪小肠清洗干净，去皮去脂去筋，用注射用水洗净备用，猪脾脏和猪小肠都均来自新鲜的健康动物体；(2)将处理好的猪脾脏10l和猪小肠2l放入绞肉机绞碎，然后将得到的绞碎物按体积比为1:1加注射用水，置于捣碎机在10000rpm下匀浆15min，得匀浆液；(3)将匀浆液反复冻融7次，得到冻融液；(4)将冻融液加入终浓度为3％的乙酸，在10℃内搅拌10小时，再置于4℃，以8000rpm离心15min，取离心清液于无菌罐中，将离心清液混合加入终浓度为0.012％的β-丙内酯，于10℃以内灭活24小时，将得到的灭活液置于37℃水解2小时，得到水解液；(5)将水解液经0.22μm滤膜进行切向流微滤，收集滤透液，并调节ph值至7.5，得到调节液；(6)将调节液经4kd超滤膜进行切向流超滤，收集超滤透过液，再用0.1μm除菌过滤器除菌，收集滤液，无菌分装即为猪用疫苗稀释液成品。试验例1猪疫苗稀释液配合猪瘟耐热保护剂疫苗(兔源)使用前后，无特定病原菌数量对比试验将6瓶编号为p881-1、p881-2、p882-1、p882-2、p883-1、p883-2不同批次的猪瘟耐热保护剂冻干疫苗(兔源)由福州大北农生物技术有限公司提供，其中p881-1与p881-2为同一批次，p882-1与p882-2为同一个批次，p883-1与p883-2为同一批次，将p881-1、p882-1和p883-1用2ml转移因子稀释液稀释(购买于山东信得科技股份有限公司)，p881-2、p882-2、p883-2用2ml实施例1制备的猪用疫苗稀释液进行稀释，分别取100μl接于6个tsa平板进行铺板，整个过程应无菌操作，将铺板后的平皿置于37℃恒温箱过夜培养，次日观察，结果如表1。表1无菌检验结果编号菌落数p881-18p882-17p883-13p881-20p882-20p883-20由试验例1可以得出，采用本发明制备的猪用疫苗稀释液组的3个平皿都没有长菌，而单独采用转移因子稀释液稀释的3平皿分别长了不同数量的细菌。由此可见，本发明制备的猪用疫苗稀释液确实可以完全杀灭猪用疫苗尤其是猪瘟耐热保护剂疫苗(兔源)的无特定病原菌，从而保障疫苗使用的安全，提高动物免疫水面，值得推广。由以上实施例可以得出，本发明提供的制备方法制备得到的猪用疫苗稀释液能够完全杀灭猪用疫苗的无特定病原菌，能够保证疫苗的使用安全。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12