一种基于干细胞分泌素的生物敷料的制作方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体为一种基于干细胞分泌素的生物敷料的制作方法。

背景技术：

生物敷料可分为人造生物敷料和异体组织创面覆盖物两大类。常见的人造生物敷料是由胶原、壳聚糖、透明质酸等材料制备,它具有止血促凝作用,可诱导多种细胞增殖分化,缺点在于稳定性较差和吸收渗液能力不强等。现有的生物敷料所能达到的效果很有限，其修复和治疗效果并不是很理想，无论是对于抗衰老美容治疗还是皮肤及骨骼肌肉修复再生治疗的治疗效果均不够理想，修复治疗性不足。为此，我们提出一种基于干细胞分泌素的生物敷料的制作方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于干细胞分泌素的生物敷料的制作方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于干细胞分泌素的生物敷料的制作方法，所述制作方法包括以下几个步骤：

步骤1：将人的成纤维细胞使用完全培养基接种至培养瓶中，并使成纤维细胞密度达到90％，得到原代成纤维细胞；

步骤2：将得到的原代成纤维细胞接种至覆有三维胶原凝胶培养皿中培养，获得真皮层；

步骤3：将所获得的细胞层置于聚己内酯高分子膜上，进行冷冻和干燥，获得失活的真皮细胞层与聚己内酯高分子膜的复合层；

步骤4：将所获得的失活的真皮细胞层、聚己内酯高分子膜复合层表面涂覆一层干细胞分泌素和一层水凝胶溶液后静置，等待凝固后获得生物敷料。

优选的，所述步骤1中：完全培养基包括dmem培养基、f12培养基和胎牛血清，所述dmem培养基、f12培养基和胎牛血清的体积比为8:4:3。

优选的，所述步骤2中：培养皿中添加了10％fcsmem的细胞培养液,培养的具体方法：将培养皿放置于37℃添加了5％浓度的二氧化碳的培养箱中培养10天，每24h更换培养液一次。

优选的，所述步骤3中的冷冻和干燥具体方法包括：首先，将置于聚己内酯高分子膜上的真皮层放置于冷却设备中冷却至2℃左右，保温1～2h，在冷却过程中真皮层将与聚己内酯高分子膜逐渐贴合，然后，将真皮层置于在温度为-40℃(13.33pa)的冻干箱内冻结3～5h，将真皮层内的水分将冻结成冰，之后，关闭冻干箱，迅速通入制冷剂(氟里昂、氨)，使真皮层冷冻，并保捧攀邸h或更长时间，以克服溶液的过冷现象，使真皮层完全冻结，再后，在真空1.3～13pa，在1h内将温度升至-10℃，保温6小时，在30min内将温度升至0℃，保温6小时，在1min内将温度升至10℃，保温2小时，将真皮层内的冰升华除去大部分水分，最后，将温度在1min内升至25℃，保温3小时，能够除去真皮层中细胞内的结合水。

优选的，所述步骤4中干细胞分泌素为脂肪间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞或牙龈间充质干细胞内提取的干细胞分泌素。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：该种基于干细胞分泌素的生物敷料的制作方法，通过培养人的原代成纤维细胞制作真皮层，再通过冷冻干燥获得原代成纤维细胞分泌的源性胶原、氨基多糖等多种生物活性因子，将其与高分子膜和丝素海绵层复合的制作生物敷料的方法，使得生物敷料的韧性和渗透能力大大增加了，并且通过在失活的真皮层、高分子膜和丝素海绵层的复合层表面涂覆一层干细胞分泌素的制作方法，能够大大提升生物敷料对于抗衰老美容、皮肤及骨骼肌肉修复再生治疗的治疗修复效果，达到提升生物敷料治疗修复性能的效果。

附图说明

图1为本发明结构示意图；

图2为本发明实验组和对照组的细胞活力检测数据统计图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1，本发明提供一种技术方案：一种基于干细胞分泌素的生物敷料的制作方法，所述制作方法包括以下几个步骤：

步骤1：将人的成纤维细胞使用完全培养基接种至培养瓶中，并使成纤维细胞密度达到90％，得到原代成纤维细胞；完全培养基包括dmem培养基、f12培养基和胎牛血清，所述dmem培养基、f12培养基和胎牛血清的体积比为8:4:3。

步骤2：将得到的原代成纤维细胞接种至覆有三维胶原凝胶培养皿中培养，获得真皮层；培养皿中添加了10％fcsmem的细胞培养液,培养的具体方法：将培养皿放置于37℃添加了5％浓度的二氧化碳的培养箱中培养10天，每24h更换培养液一次。

步骤3：将所获得的细胞层置于聚己内酯高分子膜上，进行冷冻和干燥，获得失活的真皮细胞层与聚己内酯高分子膜的复合层；冷冻和干燥具体方法包括：首先，将置于聚己内酯高分子膜上的真皮层放置于冷却设备中冷却至2℃左右，保温1～2h，在冷却过程中真皮层将与聚己内酯高分子膜逐渐贴合，然后，将真皮层置于在温度为-40℃(13.33pa)的冻干箱内冻结3～5h，将真皮层内的水分将冻结成冰，之后，关闭冻干箱，迅速通入制冷剂(氟里昂、氨)，使真皮层冷冻，并保捧攀邸h或更长时间，以克服溶液的过冷现象，使真皮层完全冻结，再后，在真空1.3～13pa，在1h内将温度升至-10℃，保温6小时，在30min内将温度升至0℃，保温6小时，在1min内将温度升至10℃，保温2小时，将真皮层内的冰升华除去大部分水分，最后，将温度在1min内升至25℃，保温3小时，能够除去真皮层中细胞内的结合水。

步骤4：将所获得的失活的真皮细胞层、聚己内酯高分子膜复合层表面涂覆一层干细胞分泌素和一层水凝胶溶液后静置，等待凝固后获得生物敷料，所述步骤4中干细胞分泌素为脂肪间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞或牙龈间充质干细胞内提取的干细胞分泌素。

实施例：首先，将dmem培养基、f12培养基和胎牛血清按照8:4:3的体积比配比成为完全培养基，将人的成纤维细胞使用完全培养基接种至培养瓶中，并使得纤维细胞密度达到90％，将得到原代成纤维细胞；之后，在培养皿底部覆盖三维胶原凝胶层，将得到的原代限位细胞接种至三维胶原凝胶层上，并向培养皿中添加10％fcsmem的细胞培养液，将培养皿放置于37℃充斥了5％浓度的二氧化碳的培养箱中培养10天，每24h更换培养液一次，将能够获得真皮层；然后，将的真皮层置于表面聚己内酯高分子膜上，放置于冷却设备中冷却至2℃左右，保温1～2h，在冷却过程中真皮层将与聚己内酯高分子膜逐渐贴合，再将真皮层置于在温度为-40℃(13.33pa)的冻干箱内冻结3～5h，将真皮层内的水分将冻结成冰，然后关闭冻干箱，迅速通入制冷剂(氟里昂、氨)，使真皮层冷冻，并保温2h或更长时间，以克服溶液的过冷现象，使真皮层完全冻结，在真空1.3～13pa的环境下，先是在1h内将温度升至-10℃，保温6小时，再在30min内将温度升至0℃，保温6小时，然后在1min内将温度升至10℃，保温2小时，将真皮层内的冰升华除去大部分水分，最后，将温度在1min内升至25℃，保温3小时，能够除去真皮层中细胞内的结合水，实现对真皮层的冷冻干燥，获得失活的真皮层、高分子膜和丝素海绵层的复合层；最后，将所获得的失活的真皮层、高分子膜和丝素海绵层的复合层表面涂覆一层从脂肪间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞或牙龈间充质干细胞内提取的干细胞分泌素和一层硅酸凝胶溶液，经过6～10h的静置凝固，即可生物敷料。

生物敷料内所用分泌素应已被证明可以促进人皮肤细胞增殖和迁移。数据见图2，图2：a.细胞划痕实验证明分泌素可以促进细胞迁移从而促进伤口愈合。

通过对比对照组和分泌素，经过24小时处理后可以观察到无论是人成纤维细胞还是人角质细胞，分泌素组细胞划痕宽度明显小于对照组。b.细胞增殖试验，使用alamarblue试剂测得细胞代谢活性在分泌素浓度为10ng/ml的条件下有明显提高。而在高浓度情况下，细胞的活性并没有增高。虚线代表对照组细胞活性。

试验方法：

划痕试验:人成纤维细胞和角质细胞分别以5000细胞/cm²种植于6孔板。使用含10％胎牛血清以及1％抗生素的mem培养基进行培养。待细胞密度达到100％，使用枪头于培养孔中部划线造成细胞层划痕以模仿皮肤缺损的情况。同时加入不同浓度的分泌素进行处理。并于不同时间点拍照观察划痕愈合情况。

细胞增殖试验：使用alamarblue(lifetechnology，usa)试剂进行测试。实验时，人成纤维细胞和角质细胞以5000细胞/cm²分别接种于96孔板。同时以不同的分泌素浓度处理细胞。并于加药处理24小时后开始测试。将alarmablue试剂以1/10的体积比加入到培养基内，在37℃培养箱内孵育4小时后测试对照组和处理组培养基在570nm和600nm波长处的吸光度以计算细胞活性。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。