一种花椒叶总黄酮提取物的用途的制作方法

本发明具体涉及一种花椒叶总黄酮提取物的用途。

背景技术：

花椒叶为芸香科植物花椒（zanthoxylumbungeanum）的干燥成熟叶子。《本草纲目》记载“花椒叶性味辛、无毒、热，能够治寒积、疥疮、脚气、防腐、杀菌、霍乱转筋、漆疮、杀虫等”。花椒广泛使用于日常生活。作为花椒的副产物，花椒叶资源丰富，但开发利用程度不足，造成资源浪费。开发利用花椒叶资源，提升其在制药、保健品、功能食品、食品添加剂、化妆品、农药、洗涤用品等领域的使用价值，有利于农民增收，是“精准扶贫”国家战略的重要举措。

阿尔茨海默病（ad）是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病，又称为老年痴呆症，英文名称为alzheimerdisease，简称ad。该病可能是一组异质性疾病，在多种因素（包括生物和社会心理因素）的作用下才发病。从目前研究来看，该病的可能因素和假说多达30余种，如家族史、女性、头部外伤、低教育水平、甲状腺病、母育龄过高或过低、病毒感染等。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种花椒叶总黄酮提取物的用途。

为了满足上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种花椒叶总黄酮提取物的用途，所述该花椒叶总黄酮提取物具有改善转基因果蝇阿尔茨海默病模型学习记忆的作用。

优选的，所述花椒叶总黄酮提取物在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用。

优选的，所述花椒叶总黄酮提取物的应用包括以下操作步骤：

1）ad果蝇模型建立：

w¹¹¹⁸（isocj1）作实验的对照组背景果蝇，为方便起见在报告中用“2u”代表，致病性aβ42蛋白uas-aβ42即h29.3通过杂交在全脑表达的启动子gal4lineelav-gal4^c155即p35与携带aβ42的uas品系获得，本研究所用果蝇均为雄性，在分析前1小时，苍蝇被移到黑暗的房间里，以便苍蝇能够熟悉环境；

2）分组

①遗传背景对照组：2u×h29.3；

②aβ42疾病对照组：p35×h29.3；

③阳性药物对照组：美金刚100μm，pc；

④样品组；

3）给药

所有果蝇在24℃和42％相对湿度（rh）下饲养，在第1天，选择新孵出的2u×h29.3雄果蝇和p35×h29.3果蝇即ad果蝇并放入小瓶，每小瓶含有120只果蝇，在喂药过程中将这些果蝇放置在28℃和42％rh，将果蝇从第2天至第8天喂药4小时后转移到新的小瓶中，将所有果蝇放置在28℃和42％rh直到巴甫洛夫嗅觉学习测定前1小时；

4）巴甫洛夫嗅觉学习测试

实验在25℃和70％相对湿度，避光的行为房中进行，在训练期间，将约100只苍蝇组装入安置有铜网交叉电极的训练管，先后通入两种气味气体，所述气体为3-辛醇即3-oct和4-甲基环己醇即4-mch，所述两种气体各通入60秒，中间间隔45秒的新鲜空气，在通入第一种气味3-oct（cs+）的过程中给予苍蝇60v的脉冲电击刺激，脉冲时长1.5s，间隔3.5s；通入第二种气味4-mch（cs-）时不给于电击，如此完成一个训练周期，将苍蝇在完成一个训练周期后立即转移到t-maze的选择点，同时从相对的两个方向分别通入上述两种气味，经过2分钟的选择后两侧的果蝇被分别收集，麻醉或处死后进行计数，分别使用oct和mch作为cs+进行训练和测试，得到的两个行为指数即pi的平均值作为一次实验的pi使用，pi=0表示测试中果蝇对于两种气味的选择为1:1，即没有形成记忆；pi=100表示测试中果蝇全部逃避伴随点击的气味，即完美记忆；行为指数的计算公式为：pi=[(cs-)－(cs+)]/[(cs-)+(cs+)]×100。

本发明的有益效果为：花椒叶为花椒生产的副产物，廉价易得，而目前花椒叶都是弃置在野外，对环境造成了污染，因此，本发明以花椒叶为原料制备的总黄酮提取物，其使用方便，且无药渣，而且保护环境免受污染；其花椒叶中总黄铜提取物具有改善转基因果蝇阿尔茨海默病模型学习记忆的作用，花椒叶总黄酮具有显著的抗阿尔茨海默病的药理作用，具有很大程度的药用价值，其次由于花椒叶在农户手中基本没有什么利用价值，本发明提供的该用途很好的提高了花椒叶的利用价值，将花椒叶变废为宝，增加椒农收入，推动区域经济发展等方面具有重要的意义。

附图说明

图1为提取物hjy-c1和hjy-c2改善转基因果蝇ad模型的短期记忆增强能力与阳性对照药的对比图。

具体实施方式

下面结合附图和工作原理对本发明作进一步描述：

实施例1：

首先按照以下步骤制备花椒叶总黄酮提取物：

（1）将花椒叶洗净，阴干，再进行粉碎，粉碎细度为0.1mm；

（2）将粉碎后的花椒叶用水进行加热回流提取，加热温度为100℃，提取3次，每次提取2.0小时，花椒叶和水的质量比为1:10，提取完过滤，合并滤液，再进行浓缩，得到总黄酮粗提物a；

（3）将花椒叶总黄酮粗提物用水充分溶解，过d-101大孔吸附树脂柱。分别用水、粗提物全部加入柱中后，静置吸附24h，之后按顺序分别用3.5倍bv的纯水、30%甲醇、60%甲醇、85%甲醇和甲醇洗脱，各段洗脱液分别浓缩至稠膏，转移至烧杯中，贴上标签，备用，各段分别编号为：a（纯水）、b（30%甲醇）、c（60%甲醇）、d（85%甲醇）、e（甲醇）。

（4）使用亚硝酸钠-硝酸铝法测定花椒叶提取液中的总黄酮化合物含量。

经检测，c部分浸膏中黄酮含量最高，为45.8%。

实施例2

首先按照以下步骤制备花椒叶总黄酮提取物：

（1）将花椒叶洗净，阴干，再进行粉碎，粉碎细度为0.2mm；

（2）将粉碎后的花椒叶，用提取溶剂体积百分数为80%的甲醇/水的混合溶液进行室温冷浸提取，将粉碎后的花椒叶在提取溶剂中浸泡7天，花椒叶和体积百分数为80%的甲醇/水的混合溶液的质量比为1:5，提取3次，提取完过滤，合并滤液，再进行浓缩，得到总黄酮粗提物a；

（3）按照实施例1中的步骤（3）的操作，得到浸膏a（纯水）、b（30%甲醇）、c（60%甲醇）、d（85%甲醇）、e（甲醇）；

（4）使用亚硝酸钠-硝酸铝法测定花椒叶提取液中的总黄酮化合物含量。

经检测，c部分浸膏中黄酮含量最高，为50.2%。

实施例3

首先按照以下步骤制备花椒叶总黄酮提取物：

（1）将花椒叶洗净，阴干，再进行粉碎，粉碎细度为0.3mm；

（2）将粉碎后的花椒叶用提取溶剂体积百分数为80%的乙醇/水的混合溶液进行渗漏提取，将粉碎后的花椒叶置于渗漏装置，在75%的乙醇/水的混合溶液中浸泡20h，然后进行渗漏提取，花椒叶与体积百分数为75%的乙醇/水的混合溶液的质量比为1:15，提取完过滤，合并滤液，再进行浓缩，得到总黄酮粗提物a；

（3）按照实施例1中的步骤（3）的操作，得到浸膏a（纯水）、b（30%甲醇）、c（60%甲醇）、d（85%甲醇）、e（甲醇）；

（4）使用亚硝酸钠-硝酸铝法测定花椒叶提取液中的总黄酮化合物含量。

经检测，c部分浸膏中黄酮含量最高，为50.5%。

实施例4

首先按照以下步骤制备花椒叶总黄酮提取物：

（1）将花椒叶洗净，阴干，再进行粉碎，粉碎细度为5mm；

（2）将粉碎后的花椒叶，用体积百分数为60%的乙醇/水的混合溶液进行超声提取，提取温度为50℃，频率为40hz，功率为500w，提取2次，每次提取1.0小时，花椒叶和体积百分数为60%的乙醇/水的混合溶液的质量比为1:15，合并提取液，再进行浓缩，干燥，得到提取物a；提取完过滤，合并滤液，再进行浓缩，得到总黄酮粗提物a；

（3）按照实施例1中的步骤（3）的操作，得到浸膏a（纯水）、b（30%甲醇）、c（60%甲醇）、d（85%甲醇）、e（甲醇）；

（4）使用亚硝酸钠-硝酸铝法测定花椒叶提取液中的总黄酮化合物含量。

经检测，c部分浸膏中黄酮含量最高，为56.6%。

实施例5

根据实施例4制备的花椒叶总黄酮提取物，其改善转基因果蝇阿尔茨海默病模型学习记忆的作用实验如下：

1）对果蝇进行分组，分为以下四组：

①遗传背景对照组：(2u×h29.3)；

②aβ42疾病对照组：(p35×h29.3)；

③阳性药物对照组：(美金刚100μm，pc)；

④样品组：(花椒叶总黄酮提取物高剂量组hjy-c1，花椒叶总黄酮提取物低剂量组hjy-c2)。

2）给药

阳性对照药美金刚的浓度为100μm；hjy-c1的母液浓度是由100%dmso配置浸膏200mg/ml，而hjy-c2是用100%dmso再稀释hjy-c110倍。在配制工作液时，利用含有4%的蔗糖水将各个母液稀释100倍。因此，hjy-c1的喂养液浓度是2.0mg/ml，hjy-c2的工作液浓度是0.2mg/ml。

所有果蝇在24℃和42％相对湿度（rh）下饲养。在第1天，选择新孵出的2u×h29.3雄果蝇和p35×h29.3雄果蝇（ad果蝇）放入小瓶（每小瓶含有大约120只果蝇）。将果蝇从第2天至第8天喂药，喂药结束4小时后转移到新的小瓶中，在喂药过程中将所有果蝇放置在28℃和42％rh，直到巴甫洛夫嗅觉学习测定前1小时。

3）巴甫洛夫嗅觉学习测试

实验在25℃和70％相对湿度，避光的行为房中进行。在训练期间，将约100只苍蝇组装入安置有铜网交叉电极的训练管，先后通入两种气味[3-辛醇（3-oct）或4-甲基环己醇（4-mch）]60秒，中间间隔45秒的新鲜空气。在通入第一种气味（cs+）的过程中给予苍蝇60v的脉冲电击刺激（脉冲时长1.5s，间隔3.5s）。通入第二种气味（cs-）时不给于点击，如此完成一个训练周期。将苍蝇在完成一个训练周期后立即转移到t-maze的选择点，同时从相对的两个方向分别通入两种气味，经过2分钟的选择后两侧的果蝇被分别收集，麻醉或处死后进行计数。

计算行为指数：pi=[(cs-)－(cs+)]/[(cs-)+(cs+)]×100

4）结果：

使用美金刚作为阳性对照的转基因果蝇ad模型评估hjy-c1和hjy-c2的短期记忆增强活性。图1显示了三个给药组阳性对照药、hjy-c1和hjy-c2的性能指数对比图，与疾病对照组相比，差异有明显的统计学意义（p＜0.001），说明花椒叶总黄酮提取物表现出良好的抗ad活性。