本发明涉及一种肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂及制备方法，属于生物医药工程技术领域。
背景技术：
冬凌草甲素(oridonin)是从唇形科香茶菜属植物中分离出的一种贝壳杉烯二萜类天然有机化合物，占冬凌草有效成分的90％以上，是抗肿瘤的活性成分，临床上多用于原发性肝癌、乳腺癌、胃癌及食道癌等实体肿瘤的治疗。
由于其良好的抗肿瘤效果和较小的毒副作用，近年来得到广泛关注，已有β-环糊精包合物、固态类脂纳米粒、pcl-peo-pcl载药纳米粒、聚乳酸纳米粒及脂质体等新型剂型的研究报道。目前临床用药及处于研究阶段的冬凌草甲素各主要剂型中，冬凌草甲素容易氧化、稳定性差、生物半衰期短、靶向性低及生物利用度低，限制其使用。
近年来研究结果表明，叶酸受体在某些实体瘤上有高表达，如卵巢癌、子宫内膜癌、直肠癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、神经内分泌癌和脑转移癌等，而在正常组织低表达，这种性质为利用叶酸受体作为药物靶点提供了契机。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂及制备方法，一方面提高冬凌草甲素的肿瘤靶向性，另一方面提高冬凌草甲素的稳定性。
实现本发明目的的技术方案如下：
肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂，按重量百分数计，包含如下组份：冬凌草甲素5％～40％，2-氨-4-羟-7,8-二氢蝶酸偶联石墨烯复合物40％～60％，润湿剂0.1％～30％，助悬剂1％～40％。
优选地，所述的肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂，按重量百分数计，包含如下组份：冬凌草甲素5％～40％，2-氨-4-羟-7,8-二氢蝶酸偶联石墨烯复合物40％～60％，润湿剂5％～10％，助悬剂10％～35％。
进一步优选地，按重量百分数计，所述的冬凌草甲素20％～40％，2-氨-4-羟-7,8-二氢蝶酸偶联石墨烯复合物40％～50％。
所述的润湿剂为常规使用的润湿剂，可以是泊洛沙姆188、237、338或407。
所述的助悬剂为常规使用的助悬剂，可以是甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮k15，聚乙烯吡咯烷酮k30或聚乙烯吡咯烷酮k90。
所述的2-氨-4-羟-7,8-二氢蝶酸偶联石墨烯复合物的结构式如式(i)所示，
其制备方法如下：将2-氨-4-羟-7,8-二氢蝶酸加入氧化石墨烯分散液中，超声及搅拌至混合均匀，加入n,n-二环己基碳酰亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺，在5℃～50℃条件下搅拌反应，离心，过滤，干燥得到2-氨-4-羟-7,8-二氢蝶酸偶联石墨烯复合物。
优选地，上述2-氨-4-羟-7,8-二氢蝶酸偶联石墨烯复合物的制备方法中，所述的超声及搅拌时间为0.5h～5h。
优选地，上述2-氨-4-羟-7,8-二氢蝶酸偶联石墨烯复合物的制备方法中，所述的搅拌反应0.5h～24h。
优选地，上述2-氨-4-羟-7,8-二氢蝶酸偶联石墨烯复合物的制备方法中，所述的离心时间为10min～120min，转速500rpm～15000rpm。
优选地，上述2-氨-4-羟-7,8-二氢蝶酸偶联石墨烯复合物的制备方法中，所述的干燥为真空干燥，真空度为-0.05mpa～-0.1mpa，温度为30℃～100℃，干燥时间为0.5h～24h。
本发明还提供上述肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂的制备方法，包括如下步骤：
按比例将冬凌草甲素、2-氨-4-羟-7,8-二氢蝶酸偶联石墨烯复合物、润湿剂、助悬剂研磨混合均匀后过120目～200目筛，真空度低于10pa以下分装于西林瓶中，并密封，制得肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明的肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂，通过控制各组分的含量，一方面显著提高冬凌草甲素肿瘤靶向性和抗肿瘤效果，另一方面明显提高冬凌草甲素的稳定性。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面通过实施例，对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。以下实施例中润湿剂以泊洛沙姆188为例，助悬剂以甲基纤维素为例对本发明进行详细说明，应该理解的是，其他润湿剂如泊洛沙姆237、338或407，其他助悬剂如羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮k15，聚乙烯吡咯烷酮k30或聚乙烯吡咯烷酮k90同样可以实现本发明。
对比例冬凌草甲素注射液的制备
冬凌草甲素注射液的制备，按以下步骤进行：称取40mg冬凌草甲素和40mg表没食子儿茶素没食子酸酯溶于30ml的0.5％吐温-80生理盐水溶液中即得。
实施例1
1.2-氨-4-羟-7,8-二氢蝶酸偶联石墨烯复合物的制备步骤如下：
(1)将氧化石墨烯(长度：0.5μm-3μm；厚度：0.55nm-1.2nm)加入至蒸馏水，在5℃下超声及搅拌(转速为：50rpm/min)0.5h，得分散液。
(2)将分散液置于胶体磨中分散研磨，得分散均匀的氧化石墨烯分散液。
(3)将2-氨-4-羟-7,8-二氢蝶酸加入氧化石墨烯分散液中超声及搅拌0.5h，得2-氨-4-羟-7,8-二氢蝶酸和氧化石墨烯混合的分散液。
(4)向步骤(3)所得的分散液中加入n,n-二环己基碳酰亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺，在5℃下搅拌反应0.5h，得反应液。
(5)向步骤(4)所得的反应液500rpm离心10min，离心结束后，弃去上清液，得沉淀物。
(6)向步骤(5)所得的沉淀物中加入蒸馏水搅拌均匀后，用微孔滤膜(孔径：0.45μm)过滤，弃去滤液，得滤饼。
(7)将步骤(6)所得的滤饼置于真空干燥箱中(真空度:-0.05mpa；温度：30℃)干燥0.5h，得2-氨-4-羟-7,8-二氢蝶酸偶联石墨烯复合物。
2.肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂，按重量百分数计，包含如下组份：
冬凌草甲素5％，2-氨-4-羟-7,8-二氢蝶酸偶联石墨烯复合物60％，润湿剂泊洛沙姆18810％，助悬剂甲基纤维素25％。
3.肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)称取上述肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂中处方量的各组份，研磨混合均匀后过120目筛，备用。
(2)将步骤(1)所得物料在真空度低于10pa以下分装于西林瓶中，并密封，即得所述的肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂。
将肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂在60℃条件下放置6个月，肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂中冬凌草甲素的含量基本没有变化(偏差范围≤2％)。将60℃条件下放置6个月的肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂分散于灭菌注射用水中在48h内保持稳定。将hepg-2细胞接种于昆明小鼠皮下，建立小鼠肝脏肿瘤模型，分别将肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂(用前分散于灭菌注射用水中)和冬凌草甲素注射液小鼠尾静脉给药后，不同时间点(0.05h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h)将小鼠处死，取肿瘤块，用hplc分析肿瘤组织中冬凌草甲素含量。结果表明，肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂在肿瘤组织中的相对靶向率为7.18。
将hepg-2细胞接种于昆明小鼠皮下，建立小鼠肝脏肿瘤模型，分别将肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂(用前分散于灭菌注射用水中)和冬凌草甲素注射液经小鼠尾静脉给药，每天治疗一次，连续治疗10天后处死裸鼠，剥离肿瘤计算荷人肝癌裸鼠的抑瘤率。结果表明，给药剂量为1.68×10－2g·kg－1·d－1(以冬凌草甲素计算)时二者抑瘤率分别为89.3％和39.6％。
实施例2
1.2-氨-4-羟-7,8-二氢蝶酸偶联石墨烯复合物的制备步骤如下：
(1)将氧化石墨烯(长度：0.5μm-3μm；厚度：0.55nm-1.2nm)，加入至蒸馏水，在50℃下超声及搅拌(转速为：500rpm)5h，得分散液。
(2)将(1)所得的分散液置于胶体磨中分散研磨，得分散均匀的氧化石墨烯分散液。
(3)将2-氨-4-羟-7,8-二氢蝶酸加入至(2)所得的氧化石墨烯分散液中超声及搅拌5h，得2-氨-4-羟-7,8-二氢蝶酸和氧化石墨烯混合的分散液。
(4)向步骤(3)所得的分散液中加入n,n-二环己基碳酰亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺，在50℃下搅拌反应24h，得反应液。
(5)向步骤(4)所得的反应液15000rpm下离心120min，离心结束后，弃去上清液，得沉淀物。
(6)向步骤(5)所得的沉淀物中加入蒸馏水搅拌均匀后，用微孔滤膜(孔径：0.45μm)过滤，弃去滤液，得滤饼。
(7)将步骤(6)所得的滤饼置于真空干燥箱中(真空度：-0.1mpa；温度：100℃)干燥24h，得2-氨-4-羟-7,8-二氢蝶酸偶联石墨烯复合物。
2.肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂按重量百分数计，包含如下组份：
冬凌草甲素10％，2-氨-4-羟-7,8-二氢蝶酸偶联石墨烯复合物50％，润湿剂泊洛沙姆18810％，助悬剂甲基纤维素30％。
3.肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)称取上述的肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂中处方量的各组份，研磨混合均匀后过200目筛，备用。
(2)将步骤(1)所得物料在真空度低于10pa以下分装于西林瓶中，并密封，即得所述的肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂。
将肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂在60℃条件下放置6个月，肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂中冬凌草甲素的含量基本没有变化(偏差范围≤2％)。将60℃条件下放置6个月的肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂分散于灭菌注射用水中在48h内保持稳定。将hepg-2细胞接种于昆明小鼠皮下，建立小鼠肝脏肿瘤模型，分别将肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂(用前分散于灭菌注射用水中)和冬凌草甲素注射液小鼠尾静脉给药后，不同时间点(0.05h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h)将小鼠处死，取肿瘤块，用hplc分析肿瘤组织中冬凌草甲素含量。结果表明，肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂在肿瘤组织中的相对靶向率为7.28。
将hepg-2细胞接种于昆明小鼠皮下，建立小鼠肝脏肿瘤模型，分别将肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂(用前分散于灭菌注射用水中)和冬凌草甲素注射液经小鼠尾静脉给药，每天治疗一次，连续治疗10天后处死裸鼠，剥离肿瘤计算荷人肝癌裸鼠的抑瘤率。结果表明，给药剂量为1.68×10－2g·kg－1·d－1(以冬凌草甲素计算)时二者抑瘤率分别为90.8％和39.6％。
实施例3
1.2-氨-4-羟-7,8-二氢蝶酸偶联石墨烯复合物的制备步骤如下：
(1)将氧化石墨烯(长度：0.5μm-3μm；厚度：0.55nm-1.2nm)，加入至蒸馏水，在20℃下超声及搅拌(转速为：300rpm)2h，得分散液。
(2)将(1)所得的分散液置于胶体磨中进一步分散研磨，得分散均匀的氧化石墨烯分散液。
(3)将2-氨-4-羟-7,8-二氢蝶酸加入至(2)所得的氧化石墨烯分散液中超声及搅拌2h，得2-氨-4-羟-7,8-二氢蝶酸和氧化石墨烯混合的分散液。
(4)向步骤(3)所得的分散液中加入n,n-二环己基碳酰亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺，在20℃条件下搅拌反应10h，得反应液。
(5)向步骤(4)所得的反应液置于高速离心机中离心60min，转速2000rpm/min，离心结束后，弃去上清液，得沉淀物。
(6)向步骤(5)所得的沉淀物中加入蒸馏水搅拌均匀后，用微孔滤膜(孔径：0.45μm)过滤，弃去滤液，得滤饼。
(7)将步骤(6)所得的滤饼置于真空干燥箱中(真空度:-0.08mpa；温度：60℃)干燥12h，得2-氨-4-羟-7,8-二氢蝶酸偶联石墨烯复合物。
2.肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂按重量百分数计，包含如下组份：
冬凌草甲素20％，2-氨-4-羟-7,8-二氢蝶酸偶联石墨烯复合物40％，润湿剂泊洛沙姆1885％，助悬剂甲基纤维素35％。
3.肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)称取上述的肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂中处方量的各组份，研磨混合均匀后过160目筛，备用。
(2)将步骤(1)所得物料在真空度低于10pa以下分装于西林瓶中，并密封，即得所述的肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂。
将肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂在60℃条件下放置6个月，肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂中冬凌草甲素的含量基本没有变化(偏差范围≤2％)。将60℃条件下放置6个月的肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂分散于灭菌注射用水中在48h内保持稳定。将hepg-2细胞接种于昆明小鼠皮下，建立小鼠肝脏肿瘤模型，分别将肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂(用前分散于灭菌注射用水中)和冬凌草甲素注射液小鼠尾静脉给药后，不同时间点(0.05h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h)将小鼠处死，取肿瘤块，用hplc分析肿瘤组织中冬凌草甲素含量。结果表明，肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂在肿瘤组织中的相对靶向率为7.82。
将hepg-2细胞接种于昆明小鼠皮下，建立小鼠肝脏肿瘤模型，分别将肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂(用前分散于灭菌注射用水中)和冬凌草甲素注射液经小鼠尾静脉给药，每天治疗一次，连续治疗10天后处死裸鼠，剥离肿瘤计算荷人肝癌裸鼠的抑瘤率。结果表明，给药剂量为1.68×10－2g·kg－1·d－1(以冬凌草甲素计算)时二者抑瘤率分别为91.6％和39.6％。
实施例4
1.2-氨-4-羟-7,8-二氢蝶酸偶联石墨烯复合物的制备步骤如下：
(1)将氧化石墨烯(长度：0.5μm-3μm；厚度：0.55nm-1.2nm)，加入至蒸馏水，在25℃下超声及搅拌(转速为：500rpm)5h，得分散液。
(2)将(1)所得的分散液置于胶体磨中进一步分散研磨，得分散均匀的氧化石墨烯分散液。
(3)将2-氨-4-羟-7,8-二氢蝶酸加入至(2)所得的氧化石墨烯分散液中超声及搅拌2h，得2-氨-4-羟-7,8-二氢蝶酸和氧化石墨烯混合的分散液。
(4)向步骤(3)所得的分散液中加入n,n-二环己基碳酰亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺，在30℃条件下搅拌反应5h，得反应液。
(5)向步骤(4)所得的反应液置于高速离心机中离心30min，转速2000rpm/min，离心结束后，弃去上清液，得沉淀物。
(6)向步骤(5)所得的沉淀物中加入蒸馏水搅拌均匀后，用微孔滤膜(孔径：0.45μm)过滤，弃去滤液，得滤饼。
(7)将步骤(6)所得的滤饼置于真空干燥箱中(真空度:-0.08mpa；温度：50℃)干燥10h，得2-氨-4-羟-7,8-二氢蝶酸偶联石墨烯复合物。
2.肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂按重量百分数计，包含如下组份：
冬凌草甲素40％，2-氨-4-羟-7,8-二氢蝶酸偶联石墨烯复合物40％，润湿剂泊洛沙姆18810％，助悬剂甲基纤维素10％。
3.肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂的方法，包括如下步骤：
(1)称取上述肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂中处方量的各组份，研磨混合均匀后过160目筛，备用。
(2)将步骤(1)所得物料在真空度低于10pa以下分装于西林瓶中，并密封，即得所述的肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂。
将肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂在60℃条件下放置6个月，肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂中冬凌草甲素的含量基本没有变化(偏差范围≤2％)。将60℃条件下放置6个月的肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂分散于灭菌注射用水中在48h内保持稳定。将hepg-2细胞接种于昆明小鼠皮下，建立小鼠肝脏肿瘤模型，分别将肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂(用前分散于灭菌注射用水中)和冬凌草甲素注射液小鼠尾静脉给药后，不同时间点(0.05h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h)将小鼠处死，取肿瘤块，用hplc分析肿瘤组织中冬凌草甲素含量。结果表明，肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂在肿瘤组织中的相对靶向率为8.31。
将hepg-2细胞接种于昆明小鼠皮下，建立小鼠肝脏肿瘤模型，分别将肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂(用前分散于灭菌注射用水中)和冬凌草甲素注射液经小鼠尾静脉给药，每天治疗一次，连续治疗10天后处死裸鼠，剥离肿瘤计算荷人肝癌裸鼠的抑瘤率。结果表明，给药剂量为1.68×10－2g·kg－1·d－1(以冬凌草甲素计算)时二者抑瘤率分别为92.5％和39.6％。
对比例1
本对比例与实施例4基本相同，不同的是肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂按重量百分数计，包含如下组份：
冬凌草甲素3％，2-氨-4-羟-7,8-二氢蝶酸偶联石墨烯复合物30％，润湿剂泊洛沙姆18817％，助悬剂甲基纤维素50％。
将肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂在60℃条件下放置6个月，肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂中冬凌草甲素的含量基本没有变化(偏差范围≤2％)。将60℃条件下放置6个月的肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂分散于灭菌注射用水中在48h内保持稳定。将hepg-2细胞接种于昆明小鼠皮下，建立小鼠肝脏肿瘤模型，分别将肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂(用前分散于灭菌注射用水中)和冬凌草甲素注射液小鼠尾静脉给药后，不同时间点(0.05h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h)将小鼠处死，取肿瘤块，用hplc分析肿瘤组织中冬凌草甲素含量。结果表明，肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂在肿瘤组织中的相对靶向率为3.56。
将hepg-2细胞接种于昆明小鼠皮下，建立小鼠肝脏肿瘤模型，分别将肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂(用前分散于灭菌注射用水中)和冬凌草甲素注射液经小鼠尾静脉给药，每天治疗一次，连续治疗10天后处死裸鼠，剥离肿瘤计算荷人肝癌裸鼠的抑瘤率。结果表明，给药剂量为1.68×10－2g·kg－1·d－1(以冬凌草甲素计算)时二者抑瘤率分别为60.1％和39.6％。
对比例2
本对比例与实施例4基本相同，不同的是肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂按重量百分数计，包含如下组份：
冬凌草甲素50％，2-氨-4-羟-7,8-二氢蝶酸偶联石墨烯复合物30％，润湿剂泊洛沙姆18810％，助悬剂甲基纤维素10％。
将肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂在60℃条件下放置6个月，肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂中冬凌草甲素的含量基本没有变化(偏差范围≤2％)。将60℃条件下放置6个月的肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂分散于灭菌注射用水中在48h内保持稳定。将hepg-2细胞接种于昆明小鼠皮下，建立小鼠肝脏肿瘤模型，分别将肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂(用前分散于灭菌注射用水中)和冬凌草甲素注射液小鼠尾静脉给药后，不同时间点(0.05h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h)将小鼠处死，取肿瘤块，用hplc分析肿瘤组织中冬凌草甲素含量。结果表明，肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂在肿瘤组织中的相对靶向率为4.21。
将hepg-2细胞接种于昆明小鼠皮下，建立小鼠肝脏肿瘤模型，分别将肿瘤靶向型注射用冬凌草甲素干混悬剂(用前分散于灭菌注射用水中)和冬凌草甲素注射液经小鼠尾静脉给药，每天治疗一次，连续治疗10天后处死裸鼠，剥离肿瘤计算荷人肝癌裸鼠的抑瘤率。结果表明，给药剂量为1.68×10－2g·kg－1·d－1(以冬凌草甲素计算)时二者抑瘤率分别为64.3％和39.6％。