一种miRNA在制备抑制新生血管生成和抑制VEGF-A因子表达的试剂中的应用的制作方法

本发明属于生物医学领域，尤其涉及一种mirna在制备抑制新生血管生成和抑制vegf-a因子表达的试剂中的应用。

背景技术：

正常角膜的无血管化对于免疫赦免和屈光非常重要，一些病理情况下，如眼外伤、感染、炎症、角膜缘干细胞缺乏等，角膜中各种炎症细胞和免疫细胞浸润、基质水肿、角膜上皮持续缺损，角膜透明性降低，引起角膜新生血管生长，导致视力下降甚至致盲。

经典的血管生成理论认为，损伤或肿瘤肉芽组织的血管是通过下述三种方式生成的：从先前存在的血管中发出新的分支；内皮细胞出芽生长；微血管的套叠式生长。但是，在2009年，kilarski等提出一种全新的血管生成理论，他们认为新生血管可以不依赖于已经存在的血管的扩展而生成，组织张力能介导血管的生成。

在正常血管发育和病理性血管形成过程中，血管内皮生长因子(vegf)家族发挥着必不可少的作用，vegf是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有增加血管通透性和血管形成等作用，其中vegf-a是最重要的血管调控因子，在机体中广泛存在，在角膜中，其主要表达于上皮细胞层，vegf-a通过与其受体vegfr-1和vegfr-2结合而促进血管内皮细胞增殖、迁移。

目前尚没有一种有效抑制角膜血管生长的试剂和方法。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种mirna在制备抑制新生血管生成和抑制vegf-a因子表达的试剂中的应用，以及一种非疾病诊断和治疗目的的有效抑制由组织张应力引起的角膜血管生长的方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种mirna在制备抑制新生血管生成的试剂中的应用，所述mirna为mir-204，所述mir-204的核苷酸序列如seqidno.1所示。

优选的，所述mir-204抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和成管。

本发明提供了所述的mirna在制备抑制vegf-a因子表达的试剂中的应用。

优选的，所述mir-204抑制由组织张应力诱导的vegf-a因子的表达。

优选的，所述mir-204包括mir-204agomir；所述mir-204agomir在所述试剂中的浓度为150～250nmol/l。

本发明还提供了一种诱导的vegf-a因子表达的方法，包括以下步骤：将机械力间歇性作用于角膜上皮细胞，所述机械力作用于角膜上皮细胞的拉伸度为4～6％，所述机械力作用于角膜上皮细胞的频率为0.8～1.2hz，所述机械力作用于角膜上皮细胞的时间为5.5～6.5h。

优选的，所述机械力作用于角膜上皮细胞的拉伸度为5％，所述机械力作用于角膜上皮细胞的频率为1.9～1.1hz，所述机械力作用于角膜上皮细胞的时间为5.8～6.3h。

优选的，所述机械力为组织张应力。

本发明的有益效果：本发明提供了mirna在制备抑制新生血管生成的试剂中的应用，本发明提供的mir204能够显著抑制vegf-a因子表达，从而抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和成管，抑制新生血管的生成。

本发明还提供了组织张应力诱导的vegf-a因子表达的方法，利用本发明所述的方法，将组织张应力间歇性作用于角膜上皮细胞，能够引起vegf-a因子表达量的显著提高。

附图说明

图1为角膜新生血管生长及mir-204表达情况，其中a，正常角膜及缝线后10天、20天角膜新生血管生长情况，以cd31标记血管；b，原位杂交检测mir-204主要表达于角膜上皮；c，pcr检测角膜中mir-204的表达，ctrl，正常对照；*p<0.05；

图2为mir-204agomir抑制角膜新生血管形成，其中左，缝线后10天角膜新生血管分布；中，注射ntc后角膜新生血管分布；右，注射mir-204agomir后角膜血管分布；

图3为mir-204抑制角膜vegf-a和vegfr2的表达，其中a，免疫组化法检测vegf-a和vegfr2表达；b，westernblot方法分析vegf-a和vegfr2表达；

图4为周期性张应力刺激引起人角膜上皮细胞高表达vegf、低表达mir-204，其中a，pcr检测vegf-a表达；b，pcr检测mir-204表达；c，westernblot检测vegf-a蛋白表达；d，vegf-a蛋白表达统计图，*p<0.05)；

图5为mir-204抑制人微血管内皮细胞的迁移和成管，其中a，细胞迁移图；b，细胞迁移面积统计图；c，细胞成管图；d，细胞成管统计图，*p<0.05。

具体实施方式

本发明提供了一种mirna在制备抑制新生血管生成的试剂中的应用，所述mirna为mir-204，所述mir-204的核苷酸序列如seqidno.1所示，具体为uucccuuugucauccuaugccu。本发明中所述mir-204位于人染色体9q21.12；所述mir-204能够抑制新生血管的生成，所述mir-204能够抑制机械力引起的新生血管的生成，还能够抑制碱烧伤诱导的新生血管生成；所述机械力优选为组织张应力。本发明中，所述mir-204能够显著抑制vegf-a和vegfr2因子表达，从而抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和成管，抑制新生血管的生成。

在本发明中，所述mir-204优选的包括mir-204agomir；所述mir-204agomir在所述试剂中的浓度优选为150～250nmol/l，更优选为180～220nmol/l，最优选为200nmol/l。本发明中，所述mir-204agomir优选的购自广州锐博公司，为粉末状物。所述mir-204agomir在使用时，优选的用无rna酶去离子水溶解稀释，配制成上述优选浓度。

本发明还提供了一种诱导的vegf-a因子表达的方法，包括以下步骤：将机械力间歇性作用于角膜上皮细胞，所述机械力作用于角膜上皮细胞的拉伸度为4～6％，所述机械力作用于角膜上皮细胞的频率为0.8～1.2hz，所述机械力作用于角膜上皮细胞的时间为5.5～6.5h。在本发明中，所述机械力作用于角膜上皮细胞的拉伸度优选为5％，所述机械力作用于角膜上皮细胞的频率优选为1.0hz；所述机械力作用于角膜上皮细胞的时间优选为6h。本发明中，所述机械力优选为组织张应力，所述组织张应力优选的通过加力仪提供，更优选为周期性张应力加载装置，所述周期性张应力加载装置由计算机控制的应力加载系统和圆形应力加载平台构成，所述加载平台上的橡胶密封垫使平台基座与细胞培养板之间行成密封腔，对此密封腔进行真空抽吸时，产生负压，弹性膜被拉伸，从而为细胞提供双轴向应力。在本发明具体实施过程中，优选的包括以下步骤：1)将角膜上皮细胞，用0.25wt％胰酶-0.02wt％edta消化后接种于细胞培养板中，贴壁培养，2)将所述细胞培养板安置于加力仪的加载平台上，设定加力参数进行拉伸后收集细胞。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

组织张应力对小鼠角膜新生血管的影响

1.小鼠角膜新生血管模型的建立及组织张应力对角膜新生血管的影响

将12只成年balb/c小鼠全身麻醉成功后，固定小鼠右眼球，用直径1.5mm的角膜环钻在角膜中央轻压作角膜压痕，将11-0线垂直于压痕放射状缝入角膜基质层，打结，线结暴露，缝合2针。角膜新生血管生长情况及mir-204表达情况如图1所示，mir-204表达明显降低，新生血管旺盛生长。将小鼠随机分为治疗组和对照组，手术当日、术后3、6天分别结膜下注射mir-204为治疗组(pbs、ntc为对照组)，治疗后观察角膜新生血管生长情况，结果如图2所示建模后10天角膜出现旺盛的新生血管，结膜下注射mir-204后角膜新生血管明显减少。

2.mir-204对小鼠角膜缝线新生血管模型vegf-a、vegfr2表达的影响

取治疗后的balb/c小鼠眼球，制作石蜡样本，石蜡切片机切取6μm厚度石蜡组织切片，以免疫组织化学方法检测mir-204对vegf-a、vegfr2的影响。具体包括以下步骤：

1)石蜡切片烤片、脱蜡、乙醇梯度脱水；

2)抗原修复：切片置于抗原修复液(1:100)中，煮3分钟，室温冷却；pbs洗5分钟，晾干；

3)玻片上滴3％h2o2，20分钟；pbs洗3次，5分钟/次；

4)5％bsa封闭1小时；

5)滴加一抗，4℃，过夜；pbs洗3次，5分钟/次；

6)滴一滴增强剂，37℃水浴锅，15分钟；pbs洗3次，5分钟/次；

7)加二抗，37℃，37℃，1小时；pbs洗3次，5分钟/次；

8)dab显色(1mlh2o+1滴a+1滴b+1滴c)，苏木素复染20秒；自来水冲洗30秒；吹干，中性树胶封片；光学显微镜下观察照相。

结果如图3a所示，mir-204治疗组能明显减少角膜中vegf-a、vegfr2的表达。另外收集治疗组和对照组的角膜，提取蛋白，以westernblot方法分析vegf-a、vegfr2表达情况，具体包括以下步骤：

westernblot方法：

1)蛋白样本提取：2个角膜+60μlripa(含1％pmsf)，冰上超声粉碎组织；离心，12000转，5分钟；取上清，加4×loadingbuffer，95℃，5分钟；-80℃冰箱保存。

2)配胶：取分离胶缓冲液和分离胶溶液各2.7ml混匀，加60μl的改良型过硫酸铵溶液，混匀；将溶液注入制胶玻璃板中；待分离胶凝固后，取浓缩胶缓冲液和浓缩胶溶液各0.75ml混匀，加入15μl的改良型过硫酸铵溶液，混匀；注入制胶玻璃板中，插入梳齿；

3)电泳：加样10μl/孔；80v，0.5小时；120v，1.5小时。

4)转膜：100ma，冰上2～3小时。

5)封闭，加抗体：5％脱脂奶粉封闭1小时；加一抗+1％脱脂奶粉(1:1000)，4℃轻摇过夜；tbst洗膜，加二抗(1:2000～1:3000)+2.5％脱脂奶粉，室温平摇1小时；tbst洗膜；

6)化学发光：吸取适量的发光液滴至膜上，置于仪器中进行显影。

结果如图3b，mir-204治疗组vegf-a、vegfr2表达明显降低，表明mir-204能抑制角膜新生血管。

实施例2

研究组织张应力对人角膜上皮细胞vegf表达的影响

以2.4u/mldispase(溶于dmem培养基中)消化角膜环，37℃，2小时；取角膜上皮层，用0.25wt％胰酶+0.02wt％edta消化，37℃，15分钟；将原代人角膜上皮细胞用条件培养基重悬，接种于培养板中，为p0代，将p2-p4代细胞接种于flexcell细胞培养板中(1×10⁵细胞/孔)，所述flexcell细胞培养板为弹性6孔细胞培养板，底部的弹性硅胶膜柔韧性好、透明度高；硅胶表面由i型胶原包被，以增加细胞的贴壁能力。

分组：空白对照组，加力+200nmol/l阴性对照(ntc)组，加力+200nmol/lmir-204agomir组；将flexcell细胞培养板安置于加力仪的加载平台上，设定加力参数(拉伸度5％，频率为1hz)，6小时后收集细胞以pcr、westernblot方法检测vegf-a表达结果见图4，如图4所示，周期性张应力刺激引起人角膜上皮细胞中的vegf表达上升、mir-204低表达，而外源性增加mir-204后，这种高表达明显被抑制。外源性mir-204对人微血管内皮细胞的迁移和成管的影响结果如图5所示，增加mir-204后细胞的迁移和成管能力都明显下降。

由上述实施例可知，本发明提供的mir204能够显著抑制vegf-a因子表达，从而抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和成管，抑制新生血管的生成。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>青岛大学附属医院

<120>一种mirna在制备抑制新生血管生成和抑制vegf-a因子表达的试剂中的应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

uucccuuugucauccuaugccu22