一种3D打印构建的多孔级复合医用凝胶支架及其制备方法与流程

本发明属于生物医用工程材料领域，具体涉及一种3d打印构建的多孔级复合医用凝胶支架及其制备方法。

背景技术：

在生物医疗领域，器官与组织的移植及修复仍面临巨大的困难与挑战。而近年来出现的3d打印组织工程支架技术在解决这类问题上发挥着越来越重要的作用。3d打印组织工程支架技术是把三维快速成型技术与组织工程技术相结合，打印出具有良好生物相容性、优异力学性能、理想三维微观结构及可控宏观外形的支架的一种新兴技术。通过这种技术打印出的支架可用于进行细胞培养，使细胞在其中生长、增殖与分化，形成具有特定形状结构的组织或器官，从而用于作为人体组织或器官的替代物，以解决器官或组织供体不足的问题。由于天然或合成聚合物水凝胶具有良好的生物相容性，因此在细胞培养上有着极大的应用价值。在过去的十几年里，这类水凝胶作为一系列组织或器官修复与再生的基板，已经引起了研究人员对它们的特别关注。

海藻酸钠(sodiumalginate，sa)是从褐藻或细菌中提取出的天然多糖，由古洛糖醛酸(g段)和其立体异构体甘露糖醛酸(m段)两种结构单元构成，这两种结构单元通过-1,4糖苷键链接，形成一种无支链的线性嵌段共聚物。海藻酸具有良好的生物相容性，无毒，很容易与二价阳离子结合，形成凝胶。由于凝胶过程无需使用任何有害的交联剂，所以它是绿色反应。在生物医学领域，海藻酸盐凝胶常被用于细胞培养，组织移植和药物释放等领域。另一方面，羟基磷灰石(ca10(po4)6(oh)2简称hap)的化学组成和结构与人体和动物的骨骼、牙齿的相似。hap材料对动物无毒、无害、无致癌作用，生物相容性和生物活性很好，其与原骨相结合时在界面处无纤维状的组织，它的表面可与生理环境发生选择性的化学反应，所形成的界面能保护移植物而防止降解，在人体内具有良好的骨传导性、生物相容性和生物活性，因此适宜做骨取代物，是一种典型的生物材料。将羟基磷灰石与海藻酸盐溶液结合，通过复合凝胶途径制备海藻酸盐/羟基磷灰石水凝胶材料可以获得良好生物活性、相容性以及可降解性的医学材料。

水凝胶生物医用支架，一般需要具有无毒性、一定的力学强度、生物可降解，最好还具有一定的抑菌作用。而采用3d打印技术制备水凝胶支架，对所需打印的原料也有一定的要求：首先，水凝胶原料需要一定的粘度，否则难以成型；然后，固化时间不宜太长也不宜过短，固化时间过短，3d打印过程不好控制；固化时间过长，3d打印过程不易成型，塑形困难，尺寸难以保持，容易发生坍塌。目前，3d打印制备海藻酸水凝胶，一般是采用海藻酸钠溶胶混合cacl2溶液进行喷射，通过层层叠加的方法打印制备得到。然而，这种方法仅仅是通过初步物理交联来制备水凝胶，这种全离子交联的水凝胶往往脆性较大，在后续使用过程中结构容易破坏，并且当其接触人体组织液时，会发生ca²⁺-na⁺离子交换而溶解，结构无法保持。在专利cn104628936a“一种利用3d打印制备高强度双网络水凝胶支架的方法”中，公开了3d打印海藻酸水凝胶的制备方法，该方法采用将海藻酸钠、n,n-二甲基丙烯酰胺单体预混，先后采用打印-光照-浸泡的步骤进行二次交联，得到双网络水凝胶。这种方法虽然提高了3d打印海藻酸水凝胶的强度，但是，由于第一次化学交联时间过长，打印出来的溶胶塑形困难、尺寸难以保持，容易发生坍塌，该过程中操作繁琐，大大降低3d打印的效率。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种强度较好，具有长效抑菌性的3d打印构建的多孔级复合医用凝胶支架及其制备方法。

本发明这种的3d打印构建的多孔级复合医用凝胶支架，按照质量百分比组成，由以下原料组成：羟基磷灰石7-30％，载药的介孔二氧化硅0.7-2％，葡萄糖酸内酯11-16％，余量为海藻酸钠。

作为优选，本发明这种多孔级复合医用凝胶支架，按照质量百分比组成，由以下原料组成：羟基磷灰石10-20％，载药的介孔二氧化硅0.1-0.15％，葡萄糖酸内酯12-14％，余量为海藻酸钠。

所述的载药的介孔二氧化硅的药物负载率为85％-95％；所述的药物为姜黄素、布洛芬、庆大霉素中的一种。

所述的3d打印构建的多孔级复合医用凝胶支架的制备方法，包括以下步骤：

(1)将羟基磷灰石(hap)分散到去离子水中，常温下搅拌分散均匀后，加入海藻酸钠，常温下进行搅拌反应，得到预交联溶液；

(2)向步骤(1)中的预交联溶液中加入载药的介孔二氧化硅和葡萄糖酸内酯，搅拌反应后，得到轻度交联的水凝胶溶液；

(3)将步骤(2)中轻度交联的水凝胶溶液，导入到3d打印机的注射器中，按照设定的模型开始打印，打印完毕后，得到初级多孔级复合医用凝胶支架；然后将初级多孔级复合医用凝胶支架放入到氯化钙溶液中进行交联，交联完毕后，进行冷冻干燥处理，即得多孔级复合医用凝胶支架。

所述步骤(1)中，羟基磷灰石与去离子水的质量体积比为(1～7):100；羟基磷灰石与海藻酸钠的质量比为(7～30):(52～81)，搅拌分散时间30min，搅拌反应时间为2h。

所述步骤(2)中，载药的介孔二氧化硅与葡萄糖酸内酯的质量比为(0.7～2):(12～16)，葡萄糖酸内酯与预交联溶液的质量体积比为1:(50～60)。

所述步骤(3)中，3d打印的具体操作步骤为：通过气体压力将注射器中的轻度交联的水凝胶溶液挤出到打印平台上，按照设定的打印模型层层叠加成型。

所述步骤(3)中，氯化钙溶液的浓度为5％～10％；交联时间为1～15h；冷冻干燥时间为12～36h。

所述的多孔级复合医用凝胶支架在生物催化、分离、组织工程及载药等方面的应用。

本发明的有益效果：(1)本发明采用3d打印技术来制造水凝胶支架。3d打印技术成型过程中，不需要高温、激光等环境条件，对原材料性能不产生不良影响，最大限度保持原材料的性能，而且，3d打印技术成型结构可控，可以根据需要打印出不同结构、不同形状的水凝胶支架。(2)本发明所用的海藻酸钠是一种天然多糖，具有良好的生物相容性，无毒，很容易与二价阳离子结合，形成凝胶；而且凝胶过程无需使用任何有害的交联剂，所以它是绿色反应。本发明所用的羟基磷灰石材料对动物无毒、无害、无致癌作用，生物相容性和生物活性很好，其与原骨相结合时在界面处无纤维状的组织，它的表面可与生理环境发生选择性的化学反应，所形成的界面能保护移植物而防止降解，在人体内具有良好的骨传导性、生物相容性和生物活性。(3)本发明将羟基磷灰石与海藻酸盐溶液结合，通过简单的复合凝胶途径制备海藻酸盐/羟基磷灰石水凝胶材料，可以获得良好生物活性、相容性以及可药物装载和缓释的医学材料。

(4)本发明中的3d打印的凝胶溶液中添加了负载了药物介孔二氧化硅，可以起到增稠的作用，调节配方粘稠度，使得预交联的水凝胶在3d打印条件下打印凝胶支架成型较好；另外药物的负载，可实现药物的缓慢释放，可防止3d支架的被细菌污染，起到抗菌杀菌的作用。(5)本发明的制备方法中，首先,利用羟基磷灰石与葡萄糖酸内酯作用释放出部分钙离子，使其与海藻酸钠反生部分交联，增加3d打印的凝胶的粘度，并使用了纳米二氧化硅进行增稠，使3d打印过程中更易成型，同时避免传统方法使得其过度交联，导致凝胶粘度过高，难以进行3d打印；3d打印成型后的支架置于氯化钙溶液中进行进一步交联，进一步增加支架的强度。

附图说明

图1为实施例1所得的3d打印构建的海藻酸盐/羟基磷灰石水凝胶支架图。

图2为实施例2和实施例3所得的海藻酸盐/羟基磷灰石水凝胶支架的sem。

图3为实施例3所得的装载药物姜黄素不同含量的海藻酸盐/羟基磷灰石水凝胶支架的体外累积缓释实验曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

本实施例的3d打印构建的多孔级复合医用凝胶支架，按照质量百分比组成，由以下原料组成：羟基磷灰石7.6％，药物姜黄素负载量为90％的介孔二氧化硅0.76％，葡萄糖酸内酯15.3％，余量为海藻酸钠。

一种3d打印构建的多孔级复合医用凝胶支架的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取0.3g羟基磷灰石(hap)加入到30ml去离子水中，常温搅拌30min，使得hap均匀分散，然后加入3g海藻酸钠(sa)继续常温搅拌2h后，得到预交联溶液；

(2)向上述得到的预交联溶液中分别加入0.03g载药介孔二氧化硅和0.6g葡萄萄酸内酯(gdl)，用玻璃棒快速搅拌均匀，得到轻度交联的水凝胶溶液，并将其装进注射器中，准备进行打印；

(3)将上述装有轻度交联的水凝胶溶液的注射器安装在三轴点胶机上，启动点胶机，调出预先设置好的打印文件，进行打印，得到初级多孔级复合医用凝胶支架；

(4)将上述得到的初级多孔级复合医用凝胶支架浸泡在浓度为8％的氯化钙溶液中交联8h，取出后放进冷冻干燥机进行冷冻干燥处理，24h后取出即得到成品。本实施例制备的成品，如图1所示，从图1可以看出，本实施例制备的成品为多孔的白色的凝胶支架。

实施例2

本实施例的3d打印构建的多孔级复合医用凝胶支架，按照质量百分比组成，由以下原料组成：羟基磷灰石19.6％，药物姜黄素负载量为90％的介孔二氧化硅1.96％，葡萄糖酸内酯13.1％，余量为海藻酸钠。

3d打印构建的多孔级复合医用凝胶支架的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取0.9g羟基磷灰石(hap)加入到30ml去离子水中，常温搅拌30min，使得hap均匀分散，然后加入3g海藻酸钠(sa)继续常温搅拌反应2h后，得到预交联溶液；

(2)向上述得到的预交联溶液中分别加入0.09g载药介孔二氧化硅和0.6g葡萄萄酸内酯(gdl)，用玻璃棒快速搅拌均匀，得到轻度交联的水凝胶溶液，并将其装进注射器中，准备进行打印；

(3)将上述装有轻度交联的水凝胶溶液注射器安装在三轴点胶机上，启动点胶机，调出预先设置好的打印文件，进行打印，得到初级多孔级复合医用凝胶支架；

(4)将上述得到的初级多孔级复合医用凝胶支架浸泡在浓度为8％氯化钙溶液中交联5h，取出后放进冷冻干燥机进行冷冻干燥处理，24h后取出即得到成品。

实施例3

本实施例的3d打印构建的多孔级复合医用凝胶支架，按照质量百分比组成，由以下原料组成：羟基磷灰石28.9％，药物姜黄素负载量为90％的介孔二氧化硅1.73％，葡萄糖酸内酯11.6％，余量为海藻酸钠。

本实施例3d打印构建的多孔级复合医用凝胶支架的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取1.5g羟基磷灰石(hap)加入到30ml的去离子水中，常温搅拌30min,使得hap均匀分散，然后加入3g海藻酸钠(sa)继续常温搅拌反应2h后，得到预交联溶液；

(2)向上述得到的预交联溶液中分别加入0.03g载药介孔二氧化硅和0.6g葡萄萄酸内酯(gdl)，用玻璃棒快速搅拌均匀，得到轻度交联的水凝胶溶液，并将其装进注射器中，准备进行打印；

(3)将上述装有轻度交联的水凝胶溶液的注射器安装在三轴点胶机上，启动点胶机，调出预先设置好的打印文件，进行打印，得到初级多孔级复合医用凝胶支架；

(4)将上述得到的初级多孔级复合医用凝胶支架浸泡在浓度为8％氯化钙溶液中交联5h，取出后放进冷冻干燥机进行冷冻干燥处理，24h后取出即得到成品。

实施例4

其他条件与实施例3相同，载药介孔二氧化硅的加入量为0.09g。

实施例5

其他条件与实施例3相同，载药介孔二氧化硅的加入量为0.18g。

实施例6

其他条件与实施例3相同，载药介孔二氧化硅的加入量为0.27g。

实施例7测试与表征

(1)支架的孔隙率测试方法采用液体置换法：本测试所使用的替换液体为无水乙醇。首先测量支架(实施例1、2和3制备的成品支架)样品的质量(干质量，ws)。将支架样品浸泡在含无水乙醇的小瓶中，然后置于减压抽滤装置中反复抽真空直到没有气泡产生，这样使乙醇浸满多孔支架的孔隙，称量小瓶的总质量(wa)。慢慢地将浸满乙醇的多孔支架取出，称量支架取出后小瓶的质量(wb)。将一个比重瓶中装满乙醇，称其质量(w1)。将浸满乙醇的多孔支架快速放入上述比重瓶中，称其质量(w2)。支架样品的孔隙率(ε)根据以下公式计算得到。每个实验重复三次，结果取其平均值。

实施例1、2、和3制备的成品支架的孔隙率分别为：90.7％,89.3％和85.6％，因为随着羟基磷灰石(hap)的量增加，多孔支架的交联度增加，孔结构更致密，孔隙率降低。

(2)支架的截面微观结构检测：将样品(实施例2和实施例3制得的支架成品)浸在液氮中，使其迅速变脆，取出后立即脆断，选取包含自然断裂面的部分样品，固定在样品台上，保持断面平整，用于sem观察。

其结果如图2所示，从图2可以看出，实施例3制备的支架微观形貌实施例2更为粗糙，这是因为羟基磷灰石(hap)的量增加，支架表面更粗糙。

(3)药物缓释性能测试：选择0.5w/v％吐温80溶液作为缓释条件。实验方案如下，准确称取5mg载药样品(实施例3-6制得的支架成品)，分别在2ml0.5w/v％吐温80溶液的分散下装入透析袋中，然后把透析袋放进装有100ml0.5w/v％吐温80溶液的200ml棕色锥形瓶中，在缓慢磁力搅拌和37℃水浴中进行药物缓释实验，然后在特定时间点抽取溶液，以同样温度下的0.5w/v％吐温80溶液作为空白，在427nm下使用紫外可见分光光度计测定吸光度，并计算累积缓释率，绘制相应的缓释曲线。其结果如图3示：由图3可知，不同的姜黄素(cur)含量的载药支架均呈现了类似的药物释放行为，即初期的快速释放和后期的缓慢持续释放。在前300h内，载药介孔二氧化硅的量为0.03g，0.09g，0.18g和0.27g对应的姜黄素累计释放率分别为71.3％，76.5％，81.1％,和90.3％；在565h时，载药介孔二氧化硅的量为0.03g，0.09g，0.18g和0.27g对应的姜黄素累计释放率分别为83.4％，86.3％，88.9％和94.1％。本实施例中制备的载药复合支架对姜黄素释放时间较长，表现出了缓释作用，因此当载姜黄素复合支架用于组织工程的修复及再生时可以达到长期的抗炎效果。