ECM1在预防和/或治疗肝纤维化相关疾病中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉ecm1在预防和/或治疗肝纤维化相关疾病中的应用。

背景技术：

肝纤维化是一个动态的肝脏受损修复过程，类似于伤口修复反应，主要表现肝内胶原蛋白异常增生，细胞外基质过度沉积，是发展至肝硬化、肝癌的前期疾病。任何一种导致肝脏长期，慢性损伤的因素都会诱导出这种修复反应。中国是肝病大国，有约1亿人被乙肝病毒(hepatitisbvirus)慢性感染，1500万人被丙肝病毒(hepatitiscvirus)慢性感染。同时还有大量的病人遭受酒精肝和非酒精性脂肪肝引起的肝纤维化和肝硬化困扰。肝纤维化的发生不仅有可能导致肝癌，也会导致门静脉高压、腹水、脑病等一系列疾病。尽管肝纤维化影响巨大，但对肝纤维化的研究却进展缓慢。

肝脏主要由肝实质细胞(hepatocyte)，星状细胞(hepaticstellatecell，hsc)，肝巨噬细胞(kupffer)和肝窦状内皮细胞(liversinusoidalendothelialcell，lsec)构成。而肝脏的胞外基质(extracellularmatrix,ecm)不仅为这些细胞提供了支架来组成肝脏，更对维持肝脏的生理稳态有着重要的意义。它是肝脏内不同细胞信号交流的中介，也是各种细胞因子的储存库，调节着肝脏内不同细胞的功能。在病理状态下，胞外基质在肝脏中的过度沉积，导致肝纤维化。对胞外基质蛋白的功能进行研究，可以使我们深入了解胞外基质的在生理状态下如何维持稳态，抑制纤维化的发生。

然而，目前没有有效的治疗肝纤维化的药物进入临床，也没有药物被正式批准用于临床使用治疗肝纤维化。

因此本领域迫切需要深入研究肝纤维化的发病机制，探索有效的预防和/或治疗肝纤维化相关疾病的药物。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种有效的预防和/或治疗肝纤维化相关疾病的药物。

本发明第一方面提供了一种ecm1基因、或其蛋白或其促进剂的用途，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于(a)预防和/或治疗肝纤维化相关疾病；和/或(b)维持肝脏稳态。

在另一优选例中，所述组合物或制剂还用于(i)抑制肝纤维化相关疾病的发生；和/或(ii)抑制星状细胞(hsc)的激活。

在另一优选例中，所述星状细胞为肝窦内的星状细胞。

在另一优选例中，所述促进剂是指能够在体内或体外提高ecm1基因或其蛋白的活性和/或含量的物质；所述物质可以为人工合成的或天然的化合物、蛋白、核苷酸等。

在另一优选例中，所述ecm1促进剂包括促进ecm1表达的物质。

在另一优选例中，所述ecm1促进剂包括促进ecm1蛋白和整合素αv形成复合物的物质。

在另一优选例中，所述ecm1促进剂包括ecm1蛋白促进剂和/或ecm1基因促进剂。

在另一优选例中，所述促进ecm1表达或活性指将ecm1基因或蛋白的表达或活性提高≥20％，较佳地，≥50％，更佳地，≥70％。

在另一优选例中，所述ecm1促进剂选自下组：小分子化合物、表达ecm1的载体、或其组合。

在另一优选例中，所述表达ecm1的载体包括病毒载体。

在另一优选例中，所述病毒载体选自下组：腺相关病毒载体、慢病毒载体、或其组合。

在另一优选例中，所述的蛋白包括全长蛋白或蛋白片段。

在另一优选例中，所述的ecm1基因、或其蛋白来源于哺乳动物，更佳地来源于啮齿动物(如小鼠、大鼠)、灵长动物和人。

在另一优选例中，所述ecm1蛋白还包括ecm1蛋白的衍生物。

在另一优选例中，所述ecm1蛋白的衍生物包括经修饰的ecm1蛋白、氨基酸序列与天然ecm1蛋白同源且具有天然ecm1蛋白活性的蛋白分子、ecm1蛋白的二聚体或多聚体、含有ecm1蛋白氨基酸序列的融合蛋白。

在另一优选例中，所述经修饰的ecm1蛋白是peg化的ecm1蛋白。

在另一优选例中，所述“氨基酸序列与天然ecm1蛋白同源且具有天然ecm1蛋白活性的蛋白分子”是指其氨基酸序列与ecm1蛋白相比具有≥85％的同源性，较佳地≥90％的同源性，更佳地≥95％的同源性，最佳地≥98％同源性；并且具有天然ecm1蛋白活性的蛋白分子。

在另一优选例中，所述ecm1蛋白选自下组：

(a)氨基酸序列如seqidno.:1或3所示的多肽；

(b)将seqidno.:1或3所示的氨基酸序列经过一个或几个(通常为1-60个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的ecm1蛋白衍生物，或其活性片段；

(c)序列与seqidno.:1或3所示的氨基酸序列相比，同源性≥90％，较佳地≥95％，更佳地≥98％，最佳地≥99％的ecm1蛋白衍生物，或其活性片段。

在另一优选例中，所述的ecm1基因编码ecm1蛋白。

在另一优选例中，所述的ecm1基因选自下组：

(a)编码如seqidno.:1或3所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如seqidno.:2或4所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与seqidno.:2或4所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)，且编码seqidno.:1或3所示多肽的多核苷酸；

(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述组合物包括药物组合物。

在另一优选例中，所述药物组合物含有(a)ecm1基因、或其蛋白或其促进剂；和(b)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述药物组合物为液态、固体、或半固体。

在另一优选例中，所述药物组合物的剂型包括片剂、颗粒剂、胶囊、口服液、或注射剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物中，所述组分(a)占所述药物组合物总重量的1-99wt％，较佳地10-90wt％，更佳地30-70wt％。

在另一优选例中，所述组合物还包括额外的(a)预防和/或治疗肝纤维化相关疾病；和/或(b)维持肝脏稳态的组分。

在另一优选例中，所述组合物还包括额外的抑制星状细胞(hsc)的激活的组分。

在另一优选例中，所述组合物还包括选自下组的额外的组分：cwhm12、c8、pf-573228、emd527040、或其组合。

在另一优选例中，所述组合物或制剂在(a)预防和/或治疗肝纤维化相关疾病；和/或(b)维持肝脏稳态的应用中，可单独使用，或联合使用。

在另一优选例中，所述的联合使用包括：与其它(a)预防和/或治疗肝纤维化相关疾病；和/或(b)维持肝脏稳态的药物联合使用。

在另一优选例中，所述其它(a)预防和/或治疗肝纤维化相关疾病；和/或(b)维持肝脏稳态的药物选自下组：cwhm12、c8、pf-573228、emd527040、或其组合。

在另一优选例中，所述肝纤维化相关疾病选自下组：肝纤维化、肝硬化、酒精肝、脂肪肝、自身免疫性肝病、药物性肝损伤、病毒性肝炎、或其组合。

本发明第二方面提供了一种药物组合物，包括：

(a1)用于预防和/或治疗肝纤维化相关疾病的第一活性成分，所述第一活性成分包括：ecm1基因、或其蛋白或其促进剂；

(a2)预防和/或治疗肝纤维化相关疾病的第二活性成分，所述第二活性成分包括：其他的用于预防和/或治疗肝纤维化相关疾病的药物；和

(b)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的药物组合物中，所述组分(a1)占所述药物组合物总重量的1-99wt％，较佳地10-90wt％，更佳地30-70wt％。

在另一优选例中，所述的药物组合物中，所述组分(a2)占所述药物组合物总重量的1-99wt％，较佳地10-90wt％，更佳地30-70wt％。

在另一优选例中，所述第一活性成分和第二活性成分的重量比为1:100至100：1，较佳地为1:10至10：1。

在另一优选例中，所述药物组合物还包括额外的维持肝脏稳态的组分。

在另一优选例中，所述药物组合物还包括额外的抑制星状细胞(hsc)的激活的组分。

在另一优选例中，所述其他的用于预防和/或治疗肝纤维化相关疾病的药物选自下组：cwhm12、c8、pf-573228、emd527040、或其组合。

在另一优选例中，所述组合物还包括选自下组的额外的组分：cwhm12、c8、pf-573228、emd527040、或其组合。

在另一优选例中，所述药物组合物中可以是单一化合物，也可以是多个化合物的混合物。

在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备治疗或预防肝纤维化相关疾病的药物或制剂。

在另一优选例中，所述的药物剂型为口服给药或非口服给药剂型。

在另一优选例中，所述的口服给药剂型是片剂、散剂、颗粒剂或胶囊剂，或乳剂或糖浆剂。

在另一优选例中，所述的非口服给药剂型是注射剂或针剂。

在另一优选例中，所述的活性成分(a1)和活性成分(a2)的总含量为组合物总重的1～99wt％，更佳地为5～90wt％。

本发明第三方面提供了一种药盒，包括：

(i)第一容器，以及位于该第一容器中的活性成分(a1)ecm1基因、或其蛋白或其促进剂，或含有活性成分(a)的药物；和

(ii)第二容器，以及位于该第二容器中的活性成分(a2)其他的用于预防和/或治疗肝纤维化相关疾病的药物,或含有活性成分(a2)的药物。

在另一优选例中，所述的第一容器和第二容器是相同或不同的容器。

在另一优选例中，所述的第一容器的药物是含ecm1基因、或其蛋白或其促进剂的单方制剂。

在另一优选例中，所述的第二容器的药物是含其他的用于预防和/或治疗肝纤维化相关疾病的药物的单方制剂。

在另一优选例中，所述药物的剂型为口服剂型或注射剂型。

在另一优选例中，所述试剂盒还含有说明书，所述说明书中记载了联合给予活性成分(a1)和活性成分(a2)从而(i)预防和/或治疗肝纤维化相关疾病；和/或(ii)维持肝脏稳态的说明。

在另一优选例中，所述含有活性成分(a1)ecm1基因、或其蛋白或其促进剂的制剂或含有其他的用于预防和/或治疗肝纤维化相关疾病的药物的制剂的剂型分别包括胶囊、片剂、栓剂、或静脉注射剂。

在另一优选例中，所述含有活性成分(a1)ecm1基因、或其蛋白或其促进剂的制剂中，所述ecm1基因、或其蛋白或其促进剂的浓度为0.0001-100mg/kg体重，较佳地0.1-50mg/kg体重，更佳地1-20mg/kg体重。

本发明第四方面提供了一种抑制星状细胞(hsc)激活的方法，包括步骤：

在ecm1基因、或其蛋白或其促进剂存在的条件下，培养星状细胞，从而抑制星状细胞(hsc)激活。

在另一优选例中，所述星状细胞为肝窦内的星状细胞。

在另一优选例中，所述方法为非诊断性和非治疗性的。

在另一优选例中，所述方法为治疗性的。

在另一优选例中，所述ecm1或其促进剂的作用浓度为0.0001-100mg/kg体重，较佳地为1-50mg/kg体重，更佳地为5-20mg/kg体重。

本发明第五方面提供了一种筛选肝纤维化相关疾病的潜在治疗剂的方法，包括：

(a)在测试组中，在培养体系中，在测试化合物的存在下，培养表达ecm1基因的细胞一段时间t1，检测测试组所述培养体系中的ecm1基因的表达量e1；

并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组所述培养体系中ecm1基因的表达量e2；和

(b)对e1和e2进行比较，如果e1显著高于e2，则表示所述测试化合物是肝纤维化的潜在治疗剂。

在另一优选例中，所述“显著高于”指e1/e2≥2，较佳地，≥3，更佳地，≥4。

在另一优选例中，所述细胞包括肝细胞。

在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗性的。

在另一优选例中，所述的方法包括步骤(c)：将步骤(a)中所确定的潜在治疗剂施用于哺乳动物，从而测定其对哺乳动物的肝纤维化相关疾病的影响。

在另一优选例中，所述哺乳动物包括人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物、灵长目动物，较佳地，包括小鼠、大鼠、兔、猴。

本发明第六方面提供了一种预防和/或治疗肝纤维化相关疾病的方法，包括步骤：

给需要的对象，施用ecm1基因、或其蛋白或其促进剂、本发明第二方面所述的药物组合物、或本发明第三方面所述的药盒。

在另一优选例中，所述的施用包括口服。

在另一优选例中，所述的对象包括人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物和灵长目动物，优选小鼠、大鼠、兔、猴。

在另一优选例中，所述ecm1或其促进剂的施用剂量为0.0001-100mg/kg体重，较佳地为1-50mg/kg体重，最佳地为5-20mg/kg体重。

在另一优选例中，所述ecm1或其促进剂的施用频率为1-150次/月，较佳地为1天/次。

在另一优选例中，所述ecm1或其促进剂的施用时间为5-100天，较佳地为10-50天，最佳地为14-42天。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了ecm1小鼠组织表达分析结果。其中，

a：称取正常小鼠各个器官500mg裂解于1mlripa裂解液中，研磨裂解。用bca定量后，用ripa裂解液统一稀释为2ug/ml,加入loadingbuffer加热变性。上样时每个样品20ug/泳道。使用抗小鼠ecm1抗体检测。

b：取正常小鼠肝脏固定，脱水，制作为冰冻切片。使用抗小鼠ecm1抗体为一抗，anti-rabbit-cy3抗体为二抗。荧光显微镜拍照。

图2显示了不同肝纤维化模型中ecm1的表达检测结果。其中，

a和b：一组正常小鼠每周注射ccl41ul/g体重，连续注射4周(ccl4组)，同时一组注射橄榄油做对照(nc组)。最后一次注射完ccl42天后处死小鼠，取肝脏做realtime和wb分析ecm1表达。

c和d：一组正常小鼠饲喂蛋氨酸/胆碱缺乏饲料(mcd，methionine-cholinedeficientdiet)(nash组)8周，同时一组饲喂正常饲料作为对照(nc组)。8周后取肝脏做realtime和wb分析ecm1表达。

e和f：一组正常小鼠做胆管结扎3天后处死取肝脏(3days),一组正常小鼠做胆管结扎9天后处死取肝脏(9days),一组小鼠只做手术，不做胆管结扎作为对照(nc组)。取bdl-3days和bdl-9days肝脏做realtime分析ecm1表达。取bdl-9days肝脏做wb分析ecm1表达。

图3显示了肝细胞是肝脏内ecm1蛋白的主要来源。其中，

a.正常小鼠肝脏原位灌流，消化后密度梯度离心获得各种细胞悬液，密度最大的为肝实质细胞(hepatocyte),hsc，kupffer细胞和lsec通过各自的表面特征分子使用磁珠或者流式细胞仪分选获得。收集细胞后立即使用trizo裂解，抽提mrna，反转录得到cdna，最后通过rt-pcr检测ecm1的表达。gapdh为内参。

b.正常小鼠注射ccl4造模4周后，肝脏原位灌流，消化后密度梯度离心获得各种细胞悬液。分离纯化hepatocyte,hsc，kupffer细胞和lsec。同时使用一组不处理的小鼠作为对照。通过rt-pcr检测ecm1的表达。gapdh为内参。

图4显示了alb-cre可以特异性敲除肝细胞内基因。其中，

a.rosa^mtmg小鼠荧光基因表达示意图。正常情况下rosa^mtmg小鼠内只有红色荧光蛋白(membrane-targetedtandemdimertomato，mt)在细胞膜表面表达，绿色荧光蛋白(membrane-targetedgreenfluorescentprotein，mg)因为前面有终止密码子，所以不会被转录。在有cre酶表达的细胞中，红色荧光蛋白(mt)基因和绿色荧光蛋白(mg)前端终止密码子被剪切，绿色荧光蛋白(mg)会替代红色荧光蛋白(mt)表达在细胞膜表面，使细胞由红色转变为绿色。

b.取rosa^mtmg小鼠和alb-cre/rosa^mtmg小鼠的肝脏固定，脱水，冰冻切片后染dapi标记细胞核后荧光显微镜拍照。

图5显示了肝细胞特异性敲除ecm1基因小鼠表达验证。其中，

alb-cre/ecm1flox^+/+小鼠肝脏原位灌流，消化后密度梯度离心获得各种细胞悬液，密度最大的为肝实质细胞(hepatocyte),hsc，kupffer细胞和lsec通过各自的表面特征分子使用磁珠或者流式细胞仪分选获得。收集细胞后立即使用trizo裂解，抽提mrna，反转录得到cdna，最后通过rt-pcr检测ecm1的表达。gapdh为内参。

图6显示了肝细胞特异性敲除ecm1基因促进肝纤维化。其中，

ecm1野生型小鼠(ecm1^flox/flox)和ecm1肝实质细胞特异性敲除小鼠(alb-cre/ecm1^flox/flox)每周注射2次ccl41ul/g体重，连续注射4周(ccl4组)，同时一组注射橄榄油做对照(oil组)。最后一次注射完ccl42天后处死小鼠，取肝脏固定，脱水，包埋，切片，天狼星红胶原染色分析。

图7显示了肝细胞特异性敲除ecm1基因促进星状细胞活化。其中，

ecm1野生型小鼠(ecm1^flox/flox)和ecm1肝实质细胞特异性敲除小鼠(alb-cre/ecm1^flox/flox)每周注射2次ccl41ul/g体重，连续注射4周(ccl4组)，同时一组注射橄榄油做对照(oil组)。最后一次注射完ccl42天后处死小鼠，取肝脏固定，脱水，包埋，切片，a-sma免疫组化染色分析。

图8显示了肝细胞特异性敲除ecm1基因促进肝纤维化。其中，

ecm1野生型小鼠(ecm1^flox/flox)和ecm1肝实质细胞特异性敲除小鼠(alb-cre/ecm1^flox/flox)每周注射2次ccl41ul/g体重，连续注射4周(ccl4组)，同时一组注射橄榄油做对照(oil组)。最后一次注射完ccl42天后处死小鼠，取肝脏做羟脯氨酸定量分析。

图9显示了ecm1蛋白与整合素αv相互作用。其中，

野生型小鼠(wt)肝脏pfa固定后，脱水，包埋，冰冻切片后使用抗鼠ecm1抗体和抗整合素αv染色后，复染dapi，封片，拍照。激光共聚焦荧光显微镜拍照。

图10显示了ecm1蛋白抑制tgf-β1的活化和小鼠hsc的激活。其中，

a：分离野生型小鼠(wt)肝脏原代的星状细胞(hsc)，与含有tgf-β1活性报告系统的nih-3t3细胞共同培养。培液中加入重组的小鼠ecm1蛋白(50μg/ml)，crgd(10μg/ml)或无关的igg蛋白(50μg/ml)作为阴性对照(nc)。培养16小时后裂解细胞，检测裂解液中的荧光素酶(luciferase)活性。

b:分离野生型小鼠(wt)肝脏原代的星状细胞(hsc)，体外培养2个星期。培液中加入重组的小鼠ecm1蛋白(50μg/ml)，crgd(10μg/ml)或无关的igg蛋白(50μg/ml)作为阴性对照(nc)。每3天更换一次新鲜培液。2个星期后用trizo裂解，抽提mrna，反转录得到cdna，最后通过rt-pcr检测相关基因的表达。

图11显示了人肝脏中ecm1蛋白与整合素αv相互作用。其中，

健康人肝脏组织pfa固定后，脱水，包埋，石蜡切片后使用抗鼠ecm1抗体和抗整合素αv染色后，复染dapi，封片，拍照。激光共聚焦荧光显微镜拍照。

图12显示了ecm1蛋白抑制tgf-β的活化和人hsc的激活。其中，

a：将人的星状细胞(lx-2)，与含有tgf-β1活性报告系统的nih-3t3细胞共同培养。培液中加入重组的人ecm1蛋白(50μg/ml)，crgd(10μg/ml)或无关的igg蛋白(50μg/ml)作为阴性对照(nc)。培养16小时后裂解细胞，检测裂解液中的荧光素酶(luciferase)活性。

b和c:将人的星状细胞(lx-2)培养2个星期。培液中加入重组的人ecm1蛋白(50μg/ml)，crgd(10μg/ml)或无关的igg蛋白(50μg/ml)作为阴性对照(nc)。每3天更换一次新鲜培液。2个星期后用trizo裂解，抽提mrna，反转录得到cdna，最后通过rt-pcr检测相关基因的表达。

图13显示了人肝脏中的ecm1蛋白表达在肝窦的胞外基质中。其中，

健康人肝脏组织pfa固定后，脱水，包埋，石蜡切片后使用抗人ecm1抗体一抗后，再孵育带hrp标记的抗鼠二抗，最后dab显色，苏木精复染细胞核，封片，拍照。

图14显示了人肝脏中的ecm1蛋白主要由肝实质细胞表达。其中，

健康人肝脏组织pfa固定后，脱水，包埋，石蜡切片后使用带红色荧光标记的人ecm1基因探针杂交。复染dapi后封片。激光共聚焦荧光显微镜拍照。

图15显示了肝硬化病人中ecm1表达下降。其中，

a：取hbv感染导致的肝硬化病人和健康人的肝脏组织使用trizo裂解，抽提mrna，反转录得到cdna，最后通过rt-pcr检测ecm1的表达。gapdh为内参。

b：取酒精性肝炎导致的肝硬化病人和健康人的肝脏组织使用trizo裂解，抽提mrna，反转录得到cdna，最后通过基因芯片检测ecm1的表达。

c：健康人和hbv感染导致的肝硬化病人的肝脏组织pfa固定后，脱水，包埋，石蜡切片后使用抗人ecm1抗体一抗后，再孵育带hrp标记的抗鼠二抗，最后dab显色，苏木精复染细胞核，封片，拍照。

图16显示了ecm1蛋白量与肝纤维化程度负相关。其中，

a：取不同肝纤维化metavir分期(s1-s4)的病人肝穿刺样本，pfa固定后，脱水，包埋，石蜡切片后使用抗人ecm1抗体一抗后，再孵育带hrp标记的抗鼠二抗，最后dab显色，苏木精复染细胞核，封片，拍照。

b：对肝穿刺样本ecm1蛋白的ihc染色结果使用imagej软件进行染色阳性区域面积统计，绘图。

图17显示了腺相关病毒介导的ecm1蛋白表达可以治疗肝纤维化。其中，

a：wt小鼠分为2组，每组10只。分别通过尾静脉注射1x10¹¹表达ecm1基因的2/8型腺相关病毒(aav-ecm1)或不表达基因的对照病毒(aav-nc)。注射病毒1周后，每周腹腔注射ccl4造模。注射6周后，处死小鼠取肝脏固定，脱水，包埋，切片。分别进行h&e；masson染色和a-sma免疫组化染色。

b：注射6周后，处死小鼠，收集肝脏500mg裂解于1mlripa裂解液中，研磨裂解。用bca定量后，用ripa裂解液统一稀释为2ug/ml,加入loadingbuffer加热变性。上样时每个样品20ug/泳道。使用抗小鼠ecm1和flag抗体检测。

c:处死小鼠取肝脏固定，脱水，包埋，切片。分别进行天狼星红染色和a-sma免疫组化染色。

d:处死小鼠取肝脏裂解，按照羟脯氨酸检测试剂盒处理样品及检测，最后用分光光度计在od550波长处读值。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，ecm1基因、或其蛋白、或其促进剂可显著(i)预防和/或治疗肝硬化相关疾病；和/或(ii)维持肝脏的稳态。此外，还意外的发现，ecm1基因、或其蛋白、或其促进剂还可显著(i)抑制肝纤维化相关疾病的发生；和/或(ii)抑制星状细胞(hsc)的激活。在此基础上，本发明人完成了本发明。

如本文所用，cwhm12的结构式为

如本文所用，c8(αγβ1整合素抑制剂c8)的结构式为

如本文所用，pf-573228的结构式为

如本文所用，emd527040的结构式为

ecm1蛋白及其编码核酸

如本文所用，术语“ecm1蛋白”、“胞外基质蛋白1”可互换使用。

本发明涉及一种ecm1蛋白及其变体，在本发明的一个优选例中，所述ecm1蛋白的氨基酸序列如seqidno.:1或3所示。本发明的ecm1蛋白或其促进剂可(i)预防和/或治疗肝硬化相关疾病；和/或(ii)维持肝脏的稳态。

本发明还包括与本发明的seqidno.:1或3所示序列具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％)同源性的具有相同或相似功能的多肽或蛋白。

其中，seqidno.:1为鼠源ecm1蛋白；seqidno.:3为人源ecm1蛋白。

所述“相同或相似功能”主要是指：“(i)预防和/或治疗肝硬化相关疾病；和/或(ii)维持肝脏的稳态”。

本发明的蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白、合成蛋白。本发明的蛋白可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的蛋白还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括具有ecm1蛋白活性的ecm1蛋白片段和类似物。如本文所用，术语“片段”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然ecm1蛋白相同的生物学功能或活性的蛋白。

本发明的突变蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的突变蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的突变蛋白，或(iii)成熟突变蛋白与另一个化合物(比如延长突变蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的突变蛋白，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此突变蛋白序列而形成的突变蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此突变蛋白的序列或蛋白原序列，或与抗原igg片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。本发明中，保守性替换的氨基酸最好根据表i进行氨基酸替换而产生。

表i

本发明还包括与本发明的天然ecm1蛋白具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％)同源性的具有相同或相似功能的多肽或蛋白。在蛋白质变体可以经过若干个(通常为1-60个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)取代、缺失或添加至少一个氨基酸所得的衍生序列，以及在c末端和/或n末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能，在c末端和/或\末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。本发明包括天然ecm1蛋白类似物与天然ecm1蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白的类似物包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分了生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然l-氨基酸的残基(如d-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性蛋白。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外蛋白的化学衍生形式如乙酸化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白质合成和加工中进行糖基化修饰。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。此外，还可以对本发明突变蛋白进行修饰。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的突变蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在突变蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的突变蛋白。这种修饰可以通过将突变蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的突变蛋白。

本发明还提供了编码ecm1蛋白的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna形式包括：dna、基因组dna或人工合成的dna，dna可以是单链的或是双链的。编码成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

在本发明优选例中，编码人ecm1蛋白的dna序列编码seqidno.:1或3所示的ecm1蛋白，编码ecm1蛋白的多核苷酸序列如seqidno.:2或4所示。

其中，seqidno.:2为鼠源ecm1基因的核苷酸序列；seqidno.:4为人源ecm1基因的核苷酸序列。

根据本文所述的核苷酸序列，本技术领域人员可方便地用各种已知方法制得本发明的编码核酸。这些方法例如但不限于：pcr，dna人工合成等，具体的方法可参见j.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。作为本发明的一种实施方式，可通过分段合成核苷酸序列再进行重叠延伸pcr的方法来构建本发明的编码核酸序列。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严紧条件)下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×ssc，0.1％sds，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。

本发明的蛋白和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地，被纯化至均质。

本发明多核苷酸全长序列通常可以通过pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于pcr扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cdna库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cdna库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次pcr扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的dna序列。然后可将该dna序列引入本领域中已知的各种现有的dna分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用pcr技术扩增dna/rna的方法被优选用于获得本发明的多核苷酸。特别是很难从文库中得到全长的cdna时，可优选使用race法(race-cdna末端快速扩增法)，用于pcr的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的dna/rna片段。

ecm1促进剂

在本发明中，ecm1促进剂包括能够在体内或体外提高ecm1基因或其蛋白的活性和/或含量的物质。

在本发明中，ecm1促进剂还包括促进ecm1蛋白和整合素αv形成复合物的物质。

其中，可通过下述方法增加ecm1的表达量：组织自身分泌大量ecm1蛋白或人工过表达ecm1蛋白、或者人工输送ecm1蛋白(比如，用病毒载体，如腺相关病毒载体)或者ecm1促进剂。

在本发明中，所述ecm1促进剂没有特别限制，只要能够促进ecm1的表达或者增强ecm1蛋白活性都在本发明的保护范围内。

在一优选实施方式中，所述ecm1促进剂包括小分子化合物。

复方药物组合物和药盒

本发明提供了含有活性成分(a)ecm1基因、或其蛋白或其促进剂；以及(b)药学上可接受的载体的复方药物组合物。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、粉剂、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。本发明的药物组合也可以被制成粉剂用于雾化吸入。本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。本发明的药物组合物优选为注射制剂。此外，本发明药物组合物还可与其他治疗剂一起使用。并且，本发明的药物组合物还可以包括额外的组分，所述额外的组分选自下组：(a)预防和/或治疗肝纤维化相关疾病；和/或(b)维持肝脏稳态的组分。

本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳地，0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。

本发明还提供了一种可用于(a)预防和/或治疗肝纤维化相关疾病；和/或(b)维持肝脏稳态的药盒，该药盒含有：

(i)第一容器，以及位于该第一容器中的活性成分(a)ecm1基因、或其蛋白或其促进剂，或含有活性成分(a)的药物；和

(ii)说明书，所述说明书中记载了给予活性成分(a)从而(i)预防和/或治疗肝纤维化相关疾病；和/或(ii)维持肝脏稳态的说明。

本发明的药物组合物和药盒适用于(i)预防和/或治疗肝纤维化相关疾病；和/或(ii)维持肝脏稳态。

本发明制剂可以每一天服用三次到每十天服用一次，或者以缓释方式每十天服用一次。优选的方式是每天服用一次，因为这样便于病人坚持，从而显著提高病人服药的顺应性。

服用时，极大多数病例一般每天应用的总剂量应低于(或少数病例等于或略大于)各个单药的每天常用剂量，当然，所用的活性成分的有效剂量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而有所变化。

治疗方法

本发明还提供了用本发明的两种活性成分或相应的药物来(i)预防和/或治疗肝纤维化相关疾病；和/或(ii)维持肝脏稳态的方法，它包括给哺乳动物施用有效量的活性成分(a)ecm1基因、或其蛋白或其促进剂，或者施用含有所述活性成分(a)的药物组合物。

当本发明两种活性成分被用于上述用途时，可与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合，如溶剂、稀释剂等，而且可以用如下形式口服给药：片剂、丸剂、胶囊、可分散的粉末、颗粒或悬浮液(含有如约0.05-5％悬浮剂)、糖浆(含有如约10-50％糖)、和酏剂(含有约20-50％乙醇)，或者以无菌可注射溶液或悬浮液形式(在等渗介质中含有约0.05-5％悬浮剂)进行非肠胃给药。例如，这些药物制剂可含有与载体混合的约0.01-99％，更佳地约为0.1％-90％(重量)的活性成分。

本发明的两种活性成分或药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、口服、瘤内或局部给药。优选的给药途径包括口服给药、肌内给药或静脉内给药。

从易于给药的立场看，优选的药物组合物是液态组合物，尤其是注射剂。

此外，本发明的两种活性成分或药物还可与其他(a)预防和/或治疗肝纤维化相关疾病；和/或(b)维持肝脏稳态的组分或药物(如cwhm12、c8、pf-573228、emd527040等)联合使用。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明首次发现，ecm1基因、或其蛋白或其促进剂可显著(a)预防和/或治疗肝纤维化相关疾病；和/或(b)维持肝脏稳态。

(2)本发明首次发现，ecm1基因、或其蛋白或其促进剂还可显著(i)抑制肝纤维化相关疾病的发生；和/或(ii)抑制星状细胞(hsc)的激活。

(3)本发明首次发现，ecm1大量表达在肝脏胞外基质中。

(4)本发明首次利用不同细胞内敲除ecm1基因的小鼠模型证明了肝实质细胞(hepatocyte)内的特异性显著的降低肝脏内ecm1蛋白的含量，且更快的促进了肝纤维化的发生，说明了肝实质细胞分泌产生的ecm1蛋白对维持肝脏稳态，抑制肝纤维化的发生有着重要的作用，而肝脏病理状态下肝细胞功能损伤，肝实质细胞产生ecm1蛋白能力下降促进了肝纤维化发展，此结果说明ecm1蛋白在肝脏内有着重要的维持肝脏稳态的功能，ecm1的表达下调会促进肝纤维化发展的加速。

(5)本发明首次发现，ecm1蛋白通过与整合素αv分子(integrinαv)相互作用形成复合物，从而抑制hsc的活化和胶原蛋白的产生。体外给予ecm1蛋白和体内重表达ecm1基因均可以抑制hsc的活化以及肝纤维化的进展，证明了ecm1是一个具有重要治疗肝纤维化作用的新分子。

(6)本发明首次发现，正常小鼠肝脏疾病发生、纤维化不断进展的时候，肝脏内的ecm1表达量会下调。

(7)本发明首次发现，人的肝脏中ecm1蛋白同样主要由肝实质细胞合成分泌，并且在肝实质细胞损伤后降低了ecm1蛋白的合成，从而促进了肝纤维化的发生。

(8)本发明首次发现，ecm1蛋白是肝脏胞外基质的重要组成成分，通过与整合素αv分子相互作用维持着肝脏胞外基质的稳态和肝脏的正常生理功能，对抑制肝纤维化有着重要的作用。并且由于ecm1基因表达在肝纤维化过程中下降，使其成为一个潜在的重要的治疗靶点。

(9)本发明首次发现，ecm1基因或其蛋白的促进剂可促进ecm1蛋白与整合素αv分子(integrinαv)形成复合物。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

如无特别说明，实施例所用的所有材料和试剂均为市售产品。

实施例1ecm1大量表达在肝脏胞外基质中

ecm1作为一个非常重要的胞外基质蛋白，但是目前并没有文章对其在成年小鼠中的表达情况做过详细的研究。为了进一步了解ecm1的表达和肝纤维化发生的关系，首先对ecm1在小鼠体内的表达情况作了详细的研究。取了同一只小鼠的不同组织，ripa裂解后，使用wb观察到ecm1在小鼠的实质器官中主要大量表达与肝脏(图1a)。提示了ecm1是一种肝脏组成型表达的蛋白质，在肝脏中有着重要的作用。这可能就是在ecm1全身敲除小鼠中可以观察到肝脏出现非常明显病变的原因之一。

为了进一步了解ecm1在肝脏内的表达情况，制作了小鼠肝脏的冰冻切片，通过ecm1在小鼠肝脏内的原位荧光染色来观察。染色结果上可以看出在肝脏的肝窦间隙，胞外基质富集，肝脏内不同细胞crosstalk的地方有着很强的染色信号(图1b)。此结果表明ecm1在肝脏内主要富集在肝窦的胞外基质中，是肝脏胞外基质的重要组成成分。

实施例2肝纤维化造模时ecm1表达降低

为了进一步了解ecm1的表达与肝脏疾病发生的关系，在3种不同的肝纤维化模型中观察了ecm1的表达变化情况。

首先在正常小鼠中按照1ul/g体重的剂量给予ccl4一周2次。4周后取小鼠肝脏与对照组进行比较观察。可以看到在ccl4造模4周后，小鼠开始出现明显的纤维化时ecm1在肝脏内的mrna表达量被明显的下调了(图2a)。同时wb的结果也显示肝脏内ecm1的蛋白量也下降了一半以上(图2b)。

非酒精性脂肪肝(nash)也是目前肝脏领域内非常严重且发病人数大量上升的一种肝脏疾病，是肝纤维化发生的一大诱因之一。因此也想看一下ecm1在这种疾病中的变化情况。使用了一种非酒精性脂肪肝小鼠造模方法：给予正常小鼠饲喂蛋氨酸/胆碱缺乏饲料8周时间，小鼠肝脏会表现出类似于人类非酒精性脂肪肝类似的表型。在饲喂蛋氨酸/胆碱缺乏饲料8周后，取小鼠肝脏与对照组进行比较观察可以发现ecm1在肝脏内的mrna和蛋白的表达量同样被明显的下调了(图2，c和d)。

肝脏内胆道发生病变导致胆汁在肝脏内淤积，造成慢性肝损伤也是人类肝脏疾病中肝纤维化发生的重要原因之一。将正常小鼠的胆管进行结扎(bdl模型)，可以人为的造成胆汁在肝脏内淤积的表型，用来模拟人类的胆汁淤积导致的肝纤维化。在给小鼠进行胆管结扎后的第3天和第9天收集了小鼠的肝脏，和对照组小鼠进行了对比。结果可以发现随着胆汁淤积造成的肝损伤和纤维化的出现，肝脏内ecm1mrna的表达量随着疾病的加重不断下调(图2e)，同时ecm1蛋白的表达量同样被明显的下调了(图2f)。

实施例3肝细胞分泌产生的ecm1蛋白维持肝脏稳态和抑制纤维化发生

肝脏内主要的细胞由肝实质细胞(hepatocyte),星状细胞(hsc)，肝巨噬细胞(kupffer细胞)和肝窦状内皮细胞(liversinusoidalendothelialcell，lsec)构成。除此之外还有一些骨髓来源的免疫细胞如单核细胞(monocyte)，粒细胞(granulocytes)，和t细胞侵润在肝脏内。这些细胞，尤其是骨髓来源的免疫细胞会在肝脏不同的疾病状态有不同的数量和生理功能的变化。

肝脏的胞外基质是肝脏重要的结构骨架，也是肝脏内不同细胞进行信号交流(crosstalk)的必经途径。肝脏的胞外基质对肝脏内各种细胞的功能有着重要的调节作用，同时肝脏内不同细胞也在不断的动态调节着肝脏的胞外基质构成。

ecm1蛋白作为肝脏胞外基质的重要组成，同样也受肝脏内不同细胞的调节。为了更好的研究ecm1蛋白在肝纤维化中发挥的作用，因此首先需要确定肝脏内ecm1蛋白的主要来源细胞。

3.1肝细胞是肝脏内ecm1蛋白的主要来源

肝脏用胶原酶原位灌流后通过密度梯度离心可以初步分离肝脏内的实质细胞(parenchymalcells)和非实质细胞(non-parenchymalcells)。实质细胞主要就是肝实质细胞(hepatocyte)。而非实质细胞(non-parenchymalcells)悬液只要由星状细胞(hsc)，肝巨噬细胞(kupffer细胞)和肝窦状内皮细胞(liversinusoidalendothelialcell，lsec)构成。通过不同的密度梯度离心可以简单的分离这些细胞，但是纯度不够。因此为了得到纯度更高的细胞(>99％)，首先通过各自的表面特征分子使用磁珠或者流式细胞仪分选获得hsc，kupffer细胞和肝窦状内皮细胞后在进行了基因表达分析。

ecm1基因表达分析结果表明，肝脏不同的细胞中，肝实质细胞(hepatocyte)的ecm1表达量最高(图3a)。考虑到肝脏内>80％的细胞都是肝实质细胞(hepatocyte)，可以认为肝实质细胞(hepatocyte)贡献了肝脏胞外基质中绝大多数的ecm1蛋白。

同时也对肝纤维化疾病状态下的不同细胞ecm1基因表达进行了分析。结果表明，在ccl4诱导的肝纤维化中，肝实质细胞(hepatocyte)表达的ecm1基因量被明显的下调，而其他细胞的ecm1基因表达量变化不大(图3b)。

因此可以认为肝实质细胞(hepatocyte)贡献了肝脏胞外基质中绝大多数的ecm1蛋白，且在肝纤维化发生时，由于大部分的肝实质细胞(hepatocyte)被破坏或者状态发生改变，导致肝实质细胞(hepatocyte)ecm1基因表达被显著下调，最终使得肝脏胞外基质中的ecm1蛋白量降低。

3.2肝细胞特异性敲除ecm1基因促进肝纤维化进展

在确定了肝实质细胞(hepatocyte)是肝脏ecm1蛋白的主要来源后，构建了ecm1^flox/flox小鼠(loxp-flanked(“floxed”))用于在不同细胞内对ecm1基因进行条件性敲除实验。血清白蛋白(serumalbumin,alb)是一种主要由肝实质细胞(hepatocyte)分泌产生的蛋白，以alb基因的启动子表达cre酶，可以使cre酶特异性的表达在肝实质细胞中。

首先使用rosamtmg小鼠来验证了alb-cre小鼠在肝脏内基因敲除的有效性和特异性。rosamtmg小鼠内只有红色荧光蛋白(membrane-targetedtandemdimertomato，mt)在细胞膜表面表达，绿色荧光蛋白(membrane-targetedgreenfluorescentprotein，mg)因为前面有终止密码子，所以不会被转录。在有cre酶表达的细胞中，红色荧光蛋白(mt)基因以及绿色荧光蛋白(mg)前端的终止密码子被剪切，绿色荧光蛋白(mg)会替代红色荧光蛋白(mt)表达在细胞膜表面，使细胞由红色转变为绿色(图4a)。取rosamtmg小鼠和alb-cre/rosamtmg小鼠的肝脏固定，脱水，冰冻切片后染dapi标记细胞核后拍照后可见rosamtmg小鼠的肝脏内肝细胞膜被标记的都红色荧光蛋白，而在alb-cre/rosamtmg小鼠的肝脏中，所有的肝细胞表面都转化为了绿色荧光蛋白。这结果说明alb-cre小鼠可以有效的将folxp小鼠内肝细胞ecm1基因做特异性敲除(图4b)。

通过将alb-cre小鼠与ecm1^flox/flox小鼠交配后得到纯合的ecm1肝实质细胞特异性敲除小鼠(alb-cre/ecm1^flox/flox)。首先通过分选肝脏内不同的细胞，抽提mrna，反转录得到cdna，最后通过rt-pcr检测ecm1的表达确定alb-cre介导的ecm1条件性敲除只发生在肝实质细胞中，而ecm1^flox/flox小鼠肝脏内ecm1基因表达正常(图5)。因此ecm1肝实质细胞特异性敲除小鼠(alb-cre/ecm1^flox/flox)可以用于后续的肝纤维化造模实验比较肝细胞产生的ecm1蛋白对肝纤维化的影响。

将ecm1野生型小鼠(ecm1^flox/flox)和ecm1肝实质细胞特异性敲除小鼠(alb-cre/ecm1^flox/flox)每周注射2次ccl41ul/g体重，连续注射4周(ccl4组)，同时一组注射橄榄油做对照(oil组)。最后一次注射完ccl42天后处死小鼠，取肝脏固定，脱水，包埋，切片，天狼星红胶原染色分析。

实验结果表明，在ecm1肝实质细胞特异性敲除(alb-cre/ecm1^flox/flox)小鼠中，并没有像ecm1全身性敲除(ecm1-ko)小鼠那样有自发的纤维化出现。但是在每周注射2次ccl4造模后，ecm1肝实质细胞特异性敲除(alb-cre/ecm1^flox/flox)小鼠相比ecm1野生型小鼠(ecm1^flox/flox)出现了更快的肝纤维化(图6)且更早的出现腹水。此结果说明ecm1肝实质细胞特异性敲除(alb-cre/ecm1^flox/flox)小鼠的肝脏表达的ecm1蛋白受到了影响，胞外基质中ecm1蛋白的减少促进了的肝纤维的发生和发展。

对小鼠的肝脏做了a-sma的免疫组化染色后，结果发现ecm1肝实质细胞特异性敲除(alb-cre/ecm1^flox/flox)小鼠的肝脏中，a-sma阳性的细胞的量大于ecm1野生型小鼠(ecm1^flox/flox)(图7)。此结果与肝脏内的天狼星红染色结果一致。更进一步观察发现在野生型小鼠(ecm1^flox/flox)造模时激活的星状细胞一般称束状出现，集中在假小叶的间隔上。而ecm1肝实质细胞特异性敲除(alb-cre/ecm1^flox/flox)小鼠的肝脏中激活的星状细胞不仅束状出现，在其他所有的肝窦间隙中，都有非常强的激活的星状细胞，这个现象与在ecm1全身敲除小鼠(ecm1-ko)肝脏内观察到的星状细胞激活表型一致。这结果表明，肝实质细胞特异性敲除ecm1后，由于肝窦内的星状细胞缺乏胞外基质中ecm1蛋白的保护，更容易被激活。肝窦内活化的星状细胞产生了大量的胶原蛋白沉积在肝窦中，可以迅速的增加肝门静脉的血压，促进腹水的发生。

同样的，为了对实验组的小鼠进行更好的统计学分析，我们取了所有实验的小鼠的肝脏做羟脯氨酸定量分析。结果显示注射橄榄油的对照组(oil)中ecm1野生型小鼠(ecm1^flox/flox)和ecm1肝实质细胞特异性敲除小鼠(alb-cre/ecm1^flox/flox)的肝脏内羟脯氨酸含量无明显差异，但是在ccl4模型组小鼠中，ecm1肝实质细胞特异性敲除小鼠(alb-cre/ecm1^flox/flox)的肝脏内羟脯氨酸含量显著大于ecm1野生型小鼠(ecm1^flox/flox)(图8)。此结果说明了在ccl4造模过程中ecm1肝实质细胞特异性敲除小鼠(alb-cre/ecm1^flox/flox)的肝脏内纤维化程度强于ecm1野生型小鼠(ecm1^flox/flox)。

这些结果说明了ecm1肝实质细胞特异性敲除小鼠(alb-cre/ecm1^flox/flox)在ccl4造模后相对于ecm1野生型小鼠(ecm1^flox/flox)会出现更快的纤维化进展。证明了肝实质细胞(hepatocyte)分泌产生的ecm1蛋白对维持肝脏稳态，抑制肝纤维化的发生有着重要的作用。

3.3ecm1蛋白通过与整合素αv作用抑制tgfβ1的活化和hsc的激活

通过对ecm1全身敲除小鼠(ecm1-ko)和肝实质细胞(hepatocyte)条件性敲除小鼠(alb-cre/ecm1^flox/flox)的研究显示，ecm1基因的敲除并没有像其他经典的纤维化模型那样对肝细胞损伤或者炎症有显著的影响。ecm1全身敲除小鼠(ecm1-ko)和肝实质细胞(hepatocyte)条件性敲除小鼠(alb-cre/ecm1^flox/flox)都显示了肝窦内的星状细胞(hsc)发生了原位激活转化为活化的成纤维细胞。在星状细胞(hsc)活化的过程中，最重要也是最必须的一个因素是tgf-β1的刺激。星状细胞(hsc)必须要经过tgf-β1的刺激才能被激活转化为活化的成纤维细胞，在这个过程中如果抑制了tgf-β1的功能，星状细胞(hsc)的活化也会受到抑制。

tgf-β1在肝脏内可以有多种细胞合成。但是合成的tgf-β1在一开始是以非活性形式被分泌到细胞外，被称为latenttgf-β1。latenttgf-β1与lap(latency-associatedpeptide)通过ltbp1(latenttgf-β1bindingprotein1)结合成为llc(largelatentcomplex),储存在胞外基质中。latenttgf-β1需要在细胞外被特定因子剪切并从lap上分离后，才能成为有活性的tgf-β1，与tgf-β1受体相结合并激活下游信号通路。整合素分子(integrins)主要组成型的表达于许多种细胞表面。它们是一个由α亚基和β亚基所组成的异源二聚体受体分子家族。到目前为止，整合素家族一共发现有24个亚基，其中18个α亚基和6个β亚基。在整合素家族分子中，有五个整合素类分子含有αν亚基(αvβ1,αvβ3,αvβ5,αvβ6,和αvβ8)，这五个含有αν亚基的整合素分子可以与tgf-β1前体复合物中lap上的rgd(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)三肽序列相互结合，这种结合对前体tgf-β1在生理条件下的成熟活化非常重要。随后的研究发现，αv整合素在tgf-β1的活化过程中是必需的，αv整合素的缺失或tgf-β1上αv整合素结合位点的突变都会使体内的tgf-β1前体无法成熟活化产生有生物活性的tgf-β1，造成体内tgf-β1信号通路缺失。

3.3.1：ecm1蛋白与整合素αv(integrinαv)相互作用

通过对小鼠肝脏的切片做原位的荧光染色来确定ecm1蛋白与整合素αv是否有相互作用。如图9所示，免疫荧光染色结果表明小鼠肝脏内ecm1蛋白与整合素αv在肝窦内都表达为强阳性，红色荧光可以和绿色荧光叠加为黄色荧光信号。说明ecm1蛋白与整合素αv在小鼠肝脏内由相互作用。

3.3.2ecm1蛋白抑制tgf-β1的活化和小鼠星状细胞hsc的激活

latenttgf-β1激活为tgf-β1的过程是一种瞬时的作用。激活的tgf-β1会与邻近细胞表面的tgf-β1受体结合，使下游的smad蛋白发生磷酸化，然后激活下游基因表达。为了更好的检测latenttgf-β1激活为tgf-β1的过程，我们使用了一种共培养体系用来检测发生在星状细胞hsc表面的tgfβ1激活过程。nih-3t3细胞稳转了一个荧光素酶报告基因。在这个报告基因上游包含4个重复smad结合位点。因此一旦有latenttgf-β1被激活为有活性的tgf-β1，其会结合到nih-3t3细胞表面的受体上，激活nih-3t3细胞下游的smad信号通路，诱导荧光素酶报告基因表达。通过检测nih-3t3细胞内的荧光素酶的活性就可以反映出在这个共培养体系中有多少latenttgf-β1被激活为有活性的tgf-β1。

首先分离野生型小鼠(wt)肝脏原代的星状细胞(hsc)，与含有tgf-β1活性报告系统的nih-3t3细胞共同培养。培液中加入重组的小鼠ecm1蛋白(50μg/ml)，crgd(10μg/ml)或无关的igg蛋白(50μg/ml)作为阴性对照(nc)。培养16小时后裂解细胞，检测裂解液中的荧光素酶(luciferase)活性。实验结果表明重组的小鼠ecm1蛋白可以显著的抑制星状细胞(hsc)表面latenttgf-β1的活化(图10a)。这个体系中我们加入了一个经典的整合素αv的抑制剂crgd作为阳性对照。

小鼠肝脏原代的星状细胞(hsc)在体外培养的过程中会发生自激活。这是因为培养条件的改变，细胞分泌的latenttgf-β1会被细胞表面的整合素αv活化从而活化了星状细胞(hsc)，在这个过程中加入整合素αv的抑制剂(crgd)或者tgf-β1的中和抗体都会抑制星状细胞(hsc)的自激活。

因此分离野生型小鼠(wt)肝脏原代的星状细胞(hsc)，体外培养2个星期。培液中加入重组的小鼠ecm1蛋白(50μg/ml)，crgd(10μg/ml)或无关的igg蛋白(50μg/ml)作为阴性对照(nc)。每3天更换一次新鲜培液。2个星期后用trizo裂解，抽提mrna，反转录得到cdna，最后通过rt-pcr检测相关基因的表达来确定原代的星状细胞(hsc)的活化程度。实验结果显示重组的小鼠ecm1蛋白和crgd都显著的抑制了星状细胞(hsc)的活化(图10b)。

这些实验结果表面ecm1蛋白有着和crgd类似的功能，可以通过与整合素αv的相互作用抑制胞外基质中的latenttgf-β1会被细胞表面的整合素αv活化为tgf-β1从而激活肝窦内的星状细胞(hsc)转化为活化的成纤维细胞。

3.3.3ecm1蛋白抑制人hsc的激活

lx-2细胞系是一种常用的人的星状细胞系，不过lx-2细胞相对于肝脏内原代的星状细胞，他已经是一种被活化的类似于成纤维细胞的细胞系了。不过目前通过对lx-2细胞内a-sma和胶原蛋白等标志性基因的检测，lx-2细胞依然被广泛用于对纤维化进展有促进或抑制作用的基因或小分子的功能检测。

首先我们通过对健康人的肝脏的切片做原位的荧光染色来确定ecm1蛋白与整合素αv是否有相互作用。免疫荧光染色结果表明人肝脏内ecm1蛋白与整合素αv在肝窦内都表达为强阳性，红色荧光可以和绿色荧光叠加为黄色荧光信号(图11)。说明ecm1蛋白与整合素αv在人肝脏内也是有相互作用的。

然后我们将人的星状细胞(lx-2)，与含有tgf-β1活性报告系统的nih-3t3细胞共同培养。培液中加入重组的人ecm1蛋白(50μg/ml)，crgd(10μg/ml)或无关的igg蛋白(50μg/ml)作为阴性对照(nc)。培养16小时后裂解细胞，检测裂解液中的荧光素酶(luciferase)活性。实验结果表明重组的人ecm1蛋白同样可以显著的抑制lx-2细胞表面latenttgf-β1的活化(图12a)。

同时我们将人的星状细胞(lx-2)培养2个星期。培液中加入重组的人ecm1蛋白(50μg/ml)，crgd(10μg/ml)或无关的igg蛋白(50μg/ml)作为阴性对照(nc)。每3天更换一次新鲜培液。2个星期后用trizo裂解，抽提mrna，反转录得到cdna，最后通过rt-pcr检测相关基因的表达。实验结果显示重组的人ecm1蛋白和crgd都显著的抑制了lx-2细胞的活化(图12b)。

这些实验结果表明，人类的ecm1蛋白有着和小鼠ecm1蛋白类似的功能，可以通过与整合素αv的相互作用抑制胞外基质中的latenttgf-β1会被细胞表面的整合素αv活化为tgf-β1从而激活肝窦内的星状细胞(hsc)转化为活化的成纤维细胞。

3.4：肝纤维化病人肝脏中ecm1表达下降

我们在小鼠中观察到肝脏胞外基质内的ecm1蛋白主要有肝实质细胞(hepatocyte)合成分泌，并且由于在肝脏受到刺激后导致肝实质细胞(hepatocyte)损伤，降低了ecm1蛋白的合成，从而促进了肝纤维化的发生。在人体中，肝脏也一直受到外界环境的刺激，如病毒感染，酒精等肝毒性物质的刺激或是自身胆汁代谢发生问题导致胆汁淤积等。

中国是肝病大国，有约1亿人被乙肝病毒(hepatitisbvirus)慢性感染，1500万人被丙肝病毒(hepatitiscvirus)慢性感染。同时还有大量的病人遭受酒精肝和非酒精性脂肪肝引起的肝纤维化和肝硬化困扰。

我们通过和北京友谊医院，广州南方医院以及德国海德堡大学合作，收集肝纤维化和肝硬化病人样本，分析了这些样本中ecm1蛋白的表达情况和以及其与肝纤维化的相关性。

3.4.1：人肝脏中的ecm1蛋白表达在肝窦的胞外基质中

在小鼠中我们发现ecm1蛋白在肝脏内主要富集在肝窦的胞外基质中，是肝脏胞外基质的重要组成成分。因此，我们首先对健康人肝脏内的ecm1蛋白的分布进行了研究。

健康人肝脏组织pfa固定后，脱水，包埋，石蜡切片后使用抗人ecm1抗体一抗后，再孵育带hrp标记的抗鼠二抗，最后dab显色，苏木精复染细胞核，封片，拍照。实验结果发现，健康人的肝脏样本中肝窦的胞外基质内有着大量棕色的阳性染色(图13)。这说明和小鼠的ecm1蛋白一样，人肝脏中的ecm1蛋白也是主要富集在肝窦的胞外基质中的。

3.4.2人肝脏中的ecm1蛋白主要由肝实质细胞表达

在小鼠中，我们发现肝脏内绝大部分的ecm1的基因转录都发生在肝实质细胞(hepatocyte)中，因此首先我们对健康人肝脏内的ecm1基因表达也进行了研究。

因为健康人的肝脏样本非常珍贵，我们没有办法像小鼠实验那样通过消化肝组织分选细胞的方法得到不同的细胞再去分析。因此我们选择在健康人的肝脏切片上使用fish荧光探针去检测ecm1的mrna表达位置，同样可以反映ecm1是由肝脏中哪种细胞表达。

健康人肝脏组织pfa固定后，脱水，包埋，石蜡切片后使用带红色荧光标记的人ecm1基因探针杂交。复染dapi后封片。激光共聚焦荧光显微镜拍照结果显示红色的荧光信号基本的都出现在细胞核较大的肝实质细胞(hepatocyte)中(图14)。因此，这说明和小鼠肝脏中的结论一致，人肝脏内的ecm1的基因转录大多都发生在肝实质细胞(hepatocyte)中。

3.4.3：肝硬化病人中ecm1表达下降

在小鼠中，我们在不同的肝纤维化模型中都观察到了明显的ecm1基因表达下调。因此首先我们对健康人和不同病因的肝硬化病人肝脏内的ecm1基因表达也进行了研究。

通过和北京友谊医院的合作，我们获取了8个健康人的肝脏组织cdna和12个hbv感染导致的肝硬化病人的肝脏组织cdna。通过rt-pcr检测cdna中的ecm1基因表达水平，我们发现对比健康人，hbv感染导致的肝硬化病人肝脏中的ecm1基因表达明显降低(图15a)。

通过和德国海德堡大学的合作，我们获取了健康人的肝脏组织和酒精性肝炎导致的肝硬化病人的肝脏组织基因表达芯片的数据。提取其中的ecm1基因表达数据可以发现对比健康人，酒精性肝炎导致的肝硬化病人肝脏中的ecm1基因表达也明显降低(图15b)。

同样的我们也对健康人和肝硬化病人肝脏内的ecm1蛋白表达水平也进行了实验研究。我们通过和北京友谊医院的合作，我们获取了健康人的肝脏组织切片和hbv感染导致的肝硬化病人肝脏组织切片。石蜡切片脱蜡，复水后后使用抗人ecm1抗体一抗后，再孵育带hrp标记的抗鼠二抗，最后dab显色，苏木精复染细胞核，封片，拍照。实验结果发现，健康人的肝脏样本中肝窦的胞外基质内有着大量棕色的阳性染色，而hbv感染导致的肝硬化病人肝脏组织基本上见不到棕色的阳性染色(图15c)。这结果说明和ecm1mrna表达一致，肝硬化病人肝脏中的ecm1蛋白表达也明显降低。

上述实验结果表明，和小鼠肝纤维化模型一致，人类发生肝硬化时肝实质细胞(hepatocyte)分泌产生ecm1的能力被破坏了。

3.5.4：ecm1蛋白量与肝纤维化程度负相关

在各种病因导致的肝脏疾病中，从肝纤维化发展到肝硬化都需要几十年的时间。在这过程中肝实质细胞(hepatocyte)不断受损，肝脏内炎症增强，活化的星状细胞增多，胶原蛋白不断积累。因此，我们想知道在肝脏疾病，肝纤维化不断发展的过程中ecm1蛋白是否是随着肝实质细胞(hepatocyte)不断受损而逐渐降低的。如果是这样，那么在这个过程中补充ecm1蛋白或者恢复肝实质细胞(hepatocyte)的ecm1基因表达能力就有可能治疗肝纤维化。

通过和广州南方医院的合作，我们获取了hbv感染导致的不同肝纤维化分期的病人肝脏组织活检穿刺样本(metavir评分分期，s1期至s4期，每期各20例样本)。pfa固定后，脱水，包埋，石蜡切片后使用抗人ecm1抗体一抗后，再孵育带hrp标记的抗鼠二抗，最后dab显色，苏木精复染细胞核，封片，拍照。结果显示在肝纤维化不断发展的过程中，肝窦内ecm1蛋白含量在不断的降低(图16a)。为了更好的统计分析病人肝脏中ecm1蛋白的变化，我们对肝穿刺样本ecm1蛋白的ihc染色结果使用imagej软件进行染色阳性区域面积统计，绘图。统计分析结果同样表明在肝纤维化不断发展的过程中，肝窦内ecm1蛋白含量梯度下降(图16b)。

这些实验结果说明，在肝脏疾病发生过程中，肝实质细胞(hepatocyte)不断受损使肝窦内ecm1蛋白表达降低，促进了肝纤维化的发展。

实施例4腺相关病毒介导的ecm1表达抑制ccl4诱导的小鼠的肝纤维化

前面的研究发现，小鼠在发生肝纤维化时，肝脏内表达的ecm1蛋白下降，因此，尝试在这个过程中使用腺相关病毒在小鼠肝脏内重新表达ecm1蛋白，看是否可以抑制肝纤维化的发生。

wt小鼠分为2组，每组10只。分别通过尾静脉注射1x1011表达ecm1基因的2/8型腺相关病毒(aav-ecm1)或不表达基因的对照病毒(aav-nc)。注射病毒1周后，每周腹腔注射ccl4造模。注射6周后，处死小鼠取肝脏固定，脱水，包埋，切片。分别进行天狼猩红染色和a-sma免疫组化染色(图17a)。

首先发现腺相关病毒可以使ecm1基因在ccl4造模的小鼠肝脏内重新表达(图17b)。

天狼星红染色和a-sma免疫组化染色实验结果表明注射了不表达基因的对照病毒(aav-nc)组的小鼠组织中出现了大量被染成淡红色的物质沉积，肝纤维化发生的更快更严重。而注射了表达ecm1基因的2/8型腺相关病毒(aav-ecm1)的小鼠肝脏内胶原蛋白的含量更少，说明纤维化的发生被抑制了(图17c)。利用羟脯氨酸检测试剂盒检测结果表明，注射了表达ecm1基因的2/8型腺相关病毒(aav-ecm1)的小鼠肝脏内羟脯氨酸的含量远小于于(aav-nc)组小鼠(图17d)。

这些实验结果表明用2/8型腺相关病毒介导ecm1基因在肝脏内重表达可以抑制小鼠肝脏出现纤维化。上述这些实验结果说明，ecm1蛋白在小鼠体内同样可以抑制星状细胞的激活和肝纤维化的产生。

讨论

在这部分实验结果中，发现和在小鼠中观察到的实验结果一致，在人的肝脏中，肝脏胞外基质内的ecm1蛋白主要有肝实质细胞(hepatocyte)合成分泌，并且由于在肝脏受到刺激后肝实质细胞(hepatocyte)损伤，降低了ecm1蛋白的合成，从而促进了肝纤维化的发生。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>ecm1在预防和/或治疗肝纤维化相关疾病中的应用

<130>p2018-1528

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>559

<212>prt

<213>小鼠(musmusculus)

<400>1

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