一种新型定制化T细胞表位疫苗的双靶向纳米药、其制备方法及应用与流程

本发明属于纳米医药技术领域，特别涉及一种新型定制化t细胞表位疫苗的双靶向纳米药、其制备方法及应用。

背景技术：

1型糖尿病是一种以t细胞介导的胰岛β细胞破坏为主要特征的器官特异性的自身免疫性疾病。胰岛β细胞是分泌控制血糖的胰岛素的唯一细胞。目前主流补充胰岛素的治疗使1型糖尿病从急性、致死性疾病变成慢性疾病，但胰岛素无法阻挡胰岛自身免疫攻击的进程。短期内，患者最终会因胰岛功能完全丧失出现频发严重低血糖和血糖巨幅波动的脆性糖尿病。

胰岛自身抗原特异性的t细胞是1型糖尿病胰岛β细胞破坏的关键。目前认为某个触发事件（目前未知）导致了胰岛β细胞破坏并产生炎症。胰腺内，树突状细胞（dcs）内吞释放的β细胞自身抗原移往胰腺局部淋巴结，通过hlai类和ii类分子递呈抗原短肽至t细胞，导致cd8+和cd4+t细胞的激活。这些抗原特异性t细胞入血后进入胰岛。cd8+t细胞在胰岛内直接杀伤β细胞，β细胞破坏后释放更多的自身抗原，诱导更多的自身反应，t细胞富集后对胰岛进行攻击。t细胞自身免疫反应的机制主要聚焦在针对胰腺内胰岛释放的不同抗原靶点。这些抗原的靶点主要包括：胰岛素（insulin）、谷氨酸脱羧酶（gad65）、锌转运体8（znt8）、胰岛素瘤相关抗原-2（ia-2）以及胰岛细胞葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白（igrp）等。因此，针对胰岛自身免疫攻击的病因治疗—破坏胰岛抗原特异性t细胞，是延缓胰岛损伤进程改善1型糖尿病生存现状的关键。

运用纳米材料作为给药载体在自身免疫病中诱导免疫耐受已成为近年来研究的热点。目前，许多基于纳米颗粒设计的给药载体的治疗方法已经被美国fda批准，因此这些研究为今后临床实验提供了极大的可能性。研究证明，聚苯乙烯纳米颗粒或者聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly(lactic-co-glycolicacid),plga）颗粒在实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimentalautoimmuneencephalomyelitis，eae）动物模型中能够有效阻止疾病发生，预防表位扩展以及逆转疾病进程（gettsdr,etal.microparticlesbearingencephalitogenicpeptidesinducet-celltoleranceandameliorateexperimentalautoimmuneencephalomyelitis.natbiotechnol.2012;30(12):1217-1224）。自身免疫的抗原多肽纳米聚合物负载后可以诱导抗原特异性treg，有效治疗自身免疫病的进展（carambiaa,etal.nanoparticle-basedautoantigendeliverytotreg-inducingliversinusoidalendothelialcellsenablescontrolofautoimmunityinmice.jhepatol.2015;62(6):1349-1356）。抗原多聚体连接的plga（acnp）纳米颗粒可使抗原负载模块化，且结合后低解离率，并模拟暴露的表面抗原。acnp在低于常规给药剂量10倍的情况下诱导treg，并在单次注射多种多肽acnp后能够有效治疗eae（pearsonrm,etal.controlleddeliveryofsingleormultipleantigensintolerogenicnanoparticlesusingpeptide-polymerbioconjugates.molther.2017;25(7):1655-1664）。我们前期的研究结果也证明500nm的聚苯乙烯微球包裹的1型糖尿病致病性t细胞表位能够抑制人源化小鼠抗原特异性t细胞反应，能够延缓并阻止其自身免疫糖尿病的进程；此外，可以显著抑制1型糖尿病病人外周血中抗原特异性t细胞反应（xux,etal.multipeptide-couplednanoparticlesinducetolerancein'humanised'hla-transgenicmiceandinhibitdiabetogeniccd8(+)tcellresponsesintype1diabetes.diabetologia.2017;60(12):2418-2431）。

由于非特异性干预所引起的安全性、副作用及免疫耐受不能持久作用等问题，抗原特异性免疫治疗一直被认为是治疗1型糖尿病最理想最有希望的治疗方法，它具有精准性，特异性且并没有非特异性免疫治疗的副作用。目前抗原特异性免疫治疗大多都是单抗原给药，一部分已经进入临床实验阶段。虽然以上免疫治疗方案都试图努力达到预防和治疗1型糖尿病的目标，然而目前多数单一抗原或者多肽的方案并不能有效针对抗原表位的扩展，因此都只获得有限的成功。此外，可溶性抗原在体内容易降解，在到达胰腺后有效生物利用率低，而增加注射剂量可能带来很大的毒副作用；且可溶性多肽的直接注射可导致部分病人的过敏反应。

药物传递系统（drugdeliverysystem，dds）指的是在人体内运输治疗药物的方法、制剂、技术的系统，以安全有效地达到预期的治疗效果。传统的药物传递系统经常伴随非特异性的生物分布，且无法控制药物的释放。为了克服这些问题，先进可控的smart-dds控制系统已经发展到通过空间控制的方式在目标靶点释放有效的药物负荷。与传统的dds相比，smart-dds可以在有效降低药物剂量和服用频率的同时，在靶器官或者靶组织长期维持药物浓度。从这个意义上说，smart-dds可以降低血药浓度的波动、减轻药物毒性、改善治疗效果，为临床治疗提供了广阔的的应用前景。

纳米材料由于其独特的纳米级属性以及特殊的生物学功能，为smart-dds提供了更具吸引力的优势（rileyrs,etal.deliverytechnologiesforcancerimmunotherapy.natrevdrugdiscov.2019）。纳米药物的优势在于：1）改善药物的可溶性，达到最大的生物利用度和治疗效果，降低副作用；2）增加多肽药物的血浆半衰期，保护它们在进入靶器官前免受环境和血液中蛋白酶或其他酶的降解；3）共转运药物载体和靶向药可以有效运输到靶器官后直接针对靶细胞；4）精确控制药物的释放时间和剂量；5）使药物通过生物屏障系统（prosperid,etal.drugnanocarrierstotreatautoimmunityandchronicinflammatorydiseases.seminimmunol.2017;34:61-67）。由于纳米材料大多数本身是惰性的，所以进入机体后和体内的免疫系统不反应。在全身给药的同时，利用纳米材料制成的smart-dds能靶向特定组织达到高效的药物负荷；且药物在血液循环系统内未到达目标组织前，药物不会随意释放。目前，许多基于纳米颗粒设计的给药载体的治疗方法已经被美国fda批准，这些研究为临床实验提供了有效依据。因此，这些纳米材料的载体能够克服目前1型糖尿病抗原特异性免疫治疗的缺陷。本技术要解决的技术问题是提供一种定制化抗原特异性t细胞与胰腺双靶向的免疫治疗药物。

技术实现要素：

本发明的目的是解决上述现有技术的不足，提供一种定制化抗原特异性t细胞与胰腺双靶向的免疫治疗药物。一种新型的针对胰腺中胰岛抗原特异性t细胞的精准的靶向免疫治疗药物。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种新型定制化t细胞表位疫苗的双靶向纳米药，包含

i）pmhc多聚体；

ii）与pmhc多聚体连接的皂素蛋白；

iii）纳米载体，该载体将i）和ii）包裹其内；

iv）人胰腺特异性表达的细胞表面膜抗原蛋白的抗体，该抗体连接于纳米载体外部。

优选地，所述pmhc多聚体为在1型糖尿病病人中优势mhci类限制性的多肽和mhci类分子相结合形成的pmhc多聚体。

优选地，所述pmhc多聚体与皂素蛋白通过链霉亲和素与生物素的天然亲和力或者tag和抗tag的碱基配对作用连接。

优选地，所述纳米载体为脂质体纳米颗粒或者聚乳酸-羟基乙酸共聚物（plga）纳米颗粒。

优选地，所述人胰腺特异性表达的细胞表面膜抗原的抗体为cuzd1（cu）蛋白抗体或gp2（g）蛋白抗体。

制备上述新型定制化双靶向纳米药的方法，包括以下步骤：

（1）筛选在1型糖尿病病人中优势的mhci类限制性的多肽和mhci类分子相结合形成的pmhc多聚体；

（2）将pmhc多聚体和皂素蛋白相连接；

（3）将步骤（2）得到的物质包裹入纳米载体内；

（4）在纳米载体外连接人胰腺特异性表达的细胞表面膜抗原的抗体。

优选地，步骤（2）所述连接方式为将生物素化pmhc多聚体和链霉亲和素连接的皂素蛋白相连接，或者将连接有tag序列的pmhc多聚体和连接有抗tag序列的皂素蛋白相连接。

优选地，所述生物素化为将pmhc多聚体上的氨基与酰化的生物素共价结合。

本发明还保护上述新型定制化双靶向纳米药在治疗1型糖尿病中的应用。

免疫学上，t细胞上的受体（tcr）与抗原递呈细胞上的多肽-mhc（pmhc）结合，形成tcr-多肽-mhc复合物，是t细胞活化的第一信号；联合共刺激分子形成t细胞活化的第二信号后，t细胞将被激活（图1）。cd8+t细胞与mhci类分子相结合，cd4+t细胞与mhcii类分子相结合。在体外条件下，pmhc虽能与tcr结合，但两者亲和力低，解离速度快，无法直接用于检测及t细胞负载抗原特异性分析。1996年，altman等首次报道了pmhc四聚体技术，四个pmhc相连，为pmhc与t细胞受体（tcr）的相互作用提供了足够的稳定性，具有信号放大功能，在抗原特异性t细胞的定性、定量的分析中已得到广泛应用。近年来，五聚体的出现更增强了对抗原特异性t细胞检测的敏感性（casalegno-gardunor,etal.multimertechnologiesfordetectionandadoptivetransferofantigen-specifictcells.cancerimmunolimmunother.2010;59(2):195-202）。

因此申请人应用前期筛选出的在1型糖尿病病人中优势的（dominant）mhci类限制性的多肽和mhci类分子相结合形成pmhc的五聚体，接着，将生物素化（或者连接有tag序列的）pmhc的五聚体和链霉亲和素连接的（或者连接有抗tag序列的）皂素蛋白（streptavidin（sa）—saporin（sap））相连接，pmhc五聚体可模拟抗原递呈细胞，将表面结合的mhci类限制性多肽递呈给抗原特异性cd8+t细胞，形成tcr-抗原肽-mhci类分子的复合物，因pmhc五聚体表面无t细胞活化的第二信号，抗原特异性t细胞无法被活化。而与之连接的sap可选择性地作用于真核细胞的核糖体和原核细胞裸露的rrna使其脱嘌呤，从而抑制蛋白质的合成，使结合的t细胞死亡。将这一能够致死t细胞的五聚体包裹入聚乳酸-羟基乙酸共聚物（plga）（或者脂质体）的纳米载体内。plga纳米材料由两种单体——乳酸和羟基乙酸随机聚合而成，是一种被fda批准的，可降解的功能高分子有机化合物，具有良好的生物相容性、无毒、良好的成囊和成膜的性能。plga载体外连接人胰腺特异性表达的细胞表面膜抗原cu蛋白（或g蛋白）的抗体，该抗体能够使得靶向药特异性的富集于胰腺组织，靶向药在经过其他组织时并不能与该药物反应（图2）。双特异性靶标通过纳米载体连接，达到定制化精准靶向的目的。

1型糖尿病是组织特异性的自身免疫病。致病性t细胞主要攻击的是胰腺中的胰岛，而对其他组织、器官并无破坏。胰岛破坏后，不能分泌胰岛素降血糖，现有的临床主要治疗方式只能对症补充相应的胰岛素达到降低血糖的效果，而胰岛破坏的免疫学进程则未被阻断。近年来，国际上免疫治疗方式主要是针对全身所有的免疫细胞（t或者b细胞），短期可以改善胰岛功能，而长期应用可导致免疫抑制、感染或肿瘤的发生。目前针对致病性t细胞的抗原特异性治疗仍在探索阶段，也是被认为能够针对病因，阻断针对胰腺内胰岛致病性t细胞，诱导免疫耐受，保护胰岛功能最有希望的免疫治疗方式。然而，目前进入临床应用的主要是单一抗原或者抗原多肽免疫病人诱导免疫耐受。

本发明的有益效果在于：

我们免疫治疗药物可以根据病人体内不同的胰岛抗原致病性t细胞，定制适合不同病人的抗原多肽的毒性pmhc多聚体来杀伤胰岛抗原致病性的t细胞，并通过筛选出人胰腺特异性靶标的抗体在外部连接纳米载体，使得该纳米药能够主要富集在胰腺增加药效，降低给药浓度和全身大剂量给药的毒副作用。纳米载体包裹的毒性pmhc多聚体，也能够大大降低靶向药物在体内运输过程中的降解和损耗，是具有定制化，胰腺、致病性t细胞双靶向的精准免疫治疗的纳米药：

（1）含有能够选择性杀死胰岛致病性t细胞的带毒性靶标的pmhc多聚体；

（2）含有能够靶向胰腺的胰腺特异性的cu蛋白的抗体或g蛋白的抗体；

（3）含有具有fda批准的，可降解的功能高分子纳米材料，具有良好的生物相容性、无毒、良好的成囊和成膜的性能。

附图说明

图1为t细胞活化的信号图；

图2为纳米靶向药的结构示意图；

图3为cu蛋白在人胰腺特异性表达图；

图4为g蛋白在人胰腺特异性表达图；

图5为cu和g基因在小鼠mrna和蛋白水平的表达图；

图6为tcratcrbny8.3小鼠的致病性cd8+t反应图；

图7为杀伤性聚体对tcratcrbny8.3小鼠的致病性cd8+t细胞特异性的杀伤能力图；

图8为纳米材料的表征鉴定图；

图9为纳米材料表面负载抗体的表征鉴定图；

图10为纳米药物的治疗效果图；

图11为致病性t细胞优势表位库。

具体实施方式

为更好理解本发明，下面结合实施例及附图对本发明作进一步描述，以下实施例仅是对本发明进行说明而非对其加以限定。

一、人胰腺特异性抗原的筛选

我们在thehumanproteinatlas上筛选出两种人胰腺特异性表达的膜表面蛋白，cu蛋白和g蛋白，作为人胰腺靶向抗体的候选蛋白(图3，图4)，即这两种蛋白为已知公认的可作为人胰腺特异性表达蛋白抗体的靶标。

二、t细胞表位疫苗的双靶向纳米药的制备

实施例1

(1)靶向杀伤性聚体的制备

1）定制特异性靶向聚体：选用tcratcrbny8.3小鼠的致病性cd8+t细胞特异性抗原肽igrp206-214，与小鼠h-2kd合成相应的生物素标记的mhcclassi聚体（proimmune，uk）。

2）选择链霉素/皂草素复合物（streptavidin-zap），和定制的生物素标记的pmhc五聚体按等摩尔比例混合，充分混合均匀后室温孵育15分钟，之后将混合物置于-20℃储存，使用前轻柔摇晃，按需要稀释。

(2)靶向纳米药的制备

1）将plga（300mg）溶解在dcm（20ml）中，使用探头超声仪将靶向杀伤性聚体溶液乳化到plga溶液中，在冰浴中以40％的振幅设置100s。

2）将w/o初乳倒入pva溶液（3％）中，使用高速剪切机在冰浴中以6000rpm30分钟匀浆均化。

3）将得到的w/o/w复乳在室温搅拌下转移至pva溶液（1％）中过夜，使几乎所有的dcm蒸发掉并且微球结构硬化。

4）通过离心（3000rpm，30分钟）收集固化的微球，并用去离子（di）水洗涤3次，以去除残留的和未包封的游离靶向杀伤性聚体。

5）将聚体-plga微球悬浮液（5ml）加入到50ml离心管中的pei溶液（35ml，1.0mg/ml）中，摇晃并混合约2h，然后在3000×g下离心30分钟。

6）弃去上清液，并用去离子水洗涤过量的未吸附的pei3次。

7）将获得的微球悬浮液与cu抗体混合，并将混合物孵育2小时。

8）将得到的混合物以3000rpm离心30分钟以消除未结合的cu抗体（santacruz,usa）。

实施例2

(1)靶向杀伤性聚体的制备

1）定制特异性靶向聚体：临床上，不同病人根据其外周血筛选出其体内存在的优势表达的致病性cd8+t细胞，根据该致病性t细胞的表位多肽种类定制个体化的多肽-tag序列标记的mhcclassi聚体（pmhc多聚体）（proimmune，uk）。

2）将连接有tag序列的pmhc多聚体和连接有抗tag序列的皂素蛋白按等摩尔比例混合，充分混合均匀后室温孵育15分钟，之后将混合物置于-20℃储存，使用前轻柔摇晃，按需要稀释。

(2)靶向纳米药的制备

1）dppc,dspc,和dspe-peg2k按照90:5:5摩尔比例在氯仿中充分溶解，而后加入g蛋白抗体（abcam,uk），混合均匀。

2）在氮气保护下真空蒸发至少2小时以除去氯仿。

3）将具有靶向杀伤性聚体的pbs（ph=7.4±0.1，5ml）溶液添加到干燥的脂质中，将脂质膜再水化。

4）将脂质悬浮液充分混合到脂质的相变温度（60℃）以上，以形成多层囊泡的乳状溶液。

5）在高于脂质混合物相变温度的条件下，将该溶液通过具有聚碳酸酯膜（孔径200nm）的脂质体挤出机挤出。

6）将挤出的脂质体悬浮液通过用生理盐水（0.9％氯化钠）平衡的sephadexg-50离心柱，去除未封装的g蛋白抗体。

7）室温条件下用磷酸盐溶液（ph=6.5）以1ml/min的速率洗脱后，收集纯g抗体负载的脂质体，最终的加压脂质体溶液置于4℃保存直至进一步使用。

三、双靶向纳米药的验证

（1）胰腺特异性抗原的验证

经筛选，cu蛋白和g蛋白均为人胰腺靶向抗体的候选蛋白，而通过动物模型是初步验证药物有效性的方法之一，因此我们在tcratcrbny8.3小鼠上验证了这两个蛋白的基因在mrna和蛋白水平的表达。我们发现cu和g基因在小鼠的mrna水平都是特异性表达的，而在蛋白水平，cu特异性表达在tcratcrbny8.3小鼠的胰腺，而g则并不表达。此外，我们验证了胰腺的胰岛和外分泌腺，发现均有cu的表达（图5）。因此我们筛选了cu蛋白作为小鼠胰腺特异性表达的蛋白（实施例1）。

(2)杀伤性聚体的验证

我们将合成的tcratcrbny8.3小鼠的致病性cd8+t细胞特异性抗原肽igrp206-214与小鼠cd8+t细胞反应，检测抗原肽与致病性t细胞的反应性。图6结果证明，我们合成的抗原肽能刺激小鼠特异性t细胞的反应，从而验证我们合成的抗原肽能结合小鼠致病性t细胞。

进一步我们观察了杀伤性聚体与小鼠致病性cd8+t细胞结合后杀伤致病性t细胞的能力。图7结果证明杀伤性聚体能够特异性杀伤98.8%小鼠的致病性cd8+t细胞(cd8+pentamer+)（图7右上），而对其他cd8+t细胞(cd8+pentamer-)几乎没有杀伤（图7右下）。

(3)纳米材料的表征鉴定

我们将实施例1制作的纳米材料plga对纳米粒径及电位进行分析，表面电位-19.5mv，水动力尺寸约200-250nm（图8）。透射电镜显示，与对照组相比，实验组plga纳米载体外成功包裹着cu蛋白的抗体（图9）。

(4)双靶向纳米药的疗效鉴定

我们设置空载体组、仅有杀伤性聚体的单靶向纳米药组和双靶向纳米药（实施例1）组，在四周左右开始给药，每周静脉给药一次，连续给药3次后停止给药，观察其发病率。我们发现与空载对照组相比，单靶向和双靶向药物治疗的小鼠发病速度和比例都明显延缓，其中双靶向药物的发病速度和比例均低于单靶向组（图10）。

通过以上结果，我们证明双靶向纳米药可以成功制备，证明了药物制备方法的可行性。应用tcratcrbny8.3小鼠模型，我们证明其在体内能够特异性的阻止igrp206-214致病性t细胞所致的自身免疫糖尿病的发生及进展，证明了该药物的有效性。

四、定制个体化的双靶向纳米药

在临床上，应用我们前期筛选的致病性t细胞优势表位库（图11），不同病人根据其外周血筛选出其体内存在的优势表达的致病性cd8+t细胞，根据该致病性t细胞的表位多肽种类定制个体化的双靶向纳米药，将该药物静脉注入体内后通过体内血液循环达到胰腺。之后，靶向药离开血管，纳米载体外表面的cu抗体/g抗体与胰腺特异性结合，将靶向药物富集至胰腺。纳米载体内的细胞毒性的pmhc多聚体复合物释放入组织识别胰腺内致病性的抗原特异性cd8+t细胞，sap可导致致病性t细胞死亡。

以上所述实施方式仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。