一种DNA水凝胶介导的眼用药物输运系统及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物医学
技术领域：
，更具体涉及一种dna水凝胶介导的眼用药物输运系统及其制备方法和应用。
背景技术：
：近年来，电子化办公和电子产品的普及使得各种眼病的患病率呈现明显上升的趋势。眼科疾病容易导致视力下降，严重的甚至引发失明，影响人们的正常生活。由于眼角膜前的泪液清除系统(precornealtearclearance)和眼部结构对药物的低渗透性，眼用药物滴剂的生物利用度普遍较低(小于5％)且药物的滞留时间较短，需要每日多次给药以保证治疗效果。病人的不依从性(patientnoncompliance)也成为眼部疾病治疗中的重要问题之一。因此，有必要研究一种新的外用制剂来提高药物的生物利用度并延长药物发挥作用的时间。技术实现要素：本发明的目的是提供一种dna水凝胶介导的眼用药物输运系统及其制备方法和应用，从而解决现有技术中眼用滴剂药物生物利用度低，药物滞留时间短，病人的依从性差等问题。为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：根据本发明的第一方面，提供一种dna水凝胶介导的眼用药物输运系统的制备方法，包括以下步骤：1)将眼用药物溶解或分散于可降解的功能高分子材料中获得药物微球；2)制备dna水凝胶单体；以及3)将步骤1)所得药物微球与步骤2)所得dna水凝胶单体混合，使所述药物微球分散于所述dna水凝胶单体中，dna水凝胶单体间通过dna连接酶或交联链碱基互补配对自组装，即得。根据本发明所提供的制备方法，其工作原理为：首先将眼用药物分散于可降解的功能高分子材料中获得药物微球，再将药物微球均匀分散于dna水凝胶单体中，dna水凝胶单体间通过dna连接酶或交联链碱基互补配对自组装成载运药物微球的dna水凝胶，即，一种眼用药物输运系统。dna水凝胶和微球的双重负载大大提高了药物的装载量。给药后，由于dna水凝胶与眼部黏膜有良好的亲和力，且dna水凝胶与高分子微球都具有缓释效应，大大延长了药物在眼部的滞留时间。并且，dna水凝胶和高分子微球都是生物可降解，因此该眼用药物输运系统安全性良好。根据本发明，步骤1)中的药物包括：地塞米松、盐酸奥它洛定、色甘酸钠、依美斯汀或普拉洛芬。步骤1)中的可降解的功能高分子材料包括：聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)，聚乳酸、交联聚酯、天然蛋白、壳聚糖、明胶或海藻酸盐。应当理解的是，步骤1)中的上述药物和功能高分子材料的种类均可自由组合。上述功能高分子材料的分子量为5000～75000道尔顿，更优地为24000～38000道尔顿。针对聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)材料，聚乳酸与羟基乙酸的比例为85:15～50:50，较佳地为60:40～50:50，最佳地为50:50。步骤1)中将眼用药物溶解或分散于可降解的功能高分子材料中的方法包括：乳化溶剂挥发法、相分离法、喷雾干燥法、超临界流体技术或微流控技术。其中，乳化溶剂挥发法包括o/w乳化溶剂挥发法、o1/o2乳化液中干燥法、复乳化溶剂挥发法，较佳的为o/w乳化溶剂挥发法。根据本发明的一个优选实施方式，步骤1)采用o/w乳化溶剂挥发法，具体方法如下：将plga和地塞米松溶解于w1有机溶剂中，冰浴条件下混匀，得到plga和地塞米松的有机溶剂溶液，将此混合溶液缓慢的加入到w2水相溶液中，并在冰浴条件下进行探头超声，形成水包油型乳液；将获得的水包油型乳液加入到w3水溶液中，在常温常压下磁力搅拌，挥发有机溶剂；挥发完全后，用去离子水清洗，离心，冷冻干燥，4～10℃保存。根据该优选实施方式，所述plga和地塞米松的质量比为：20:1～5:1，较佳地为10:1～5:1。根据该优选实施方式，所述w1有机溶剂可以为二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、乙腈、丙酮，较优地为二氯甲烷、三氯甲烷，更优地为二氯甲烷。根据该优选实施方式，所述乳化剂w2水相溶液为2％～10％w/v吐温80溶液、1％～3％w/v聚乙二醇溶液、1～2％w/v泊洛沙姆溶液；w3水相溶液为去离子水，0.1～0.3％w/v聚乙二醇溶液、0.1～0.2％w/v泊洛沙姆溶液。根据该优选实施方式，所述w1有机相溶剂、w2水相和w3水相的体积比w1：w2：w3为：1:10～50:250～500。根据该优选实施方式，所述探头超声振幅为25～90，超声方式为超声3～10s间歇5～15s，连续超声3～20min。根据该优选实施方式，所述磁力搅拌转速为150～15000rpm/min，搅拌挥发有机溶剂时间为4～12h，离心转速为10000～15000r/min，离心时间为15～50min。根据本发明所提供的制备方法，步骤1)中制得的药物微球的粒径为150nm～10μm。该药物微球的载药量为1～25％,包封率为15～80％。应当知晓的是，dna水凝胶单体的制备属于本领域常规技术手段，步骤2)制备的dna水凝胶单体包括化学方法制备的水凝胶单体和物理方法制备的水凝胶单体。化学方法以dna凝胶基本单体通过化学键(磷酸二酯键、氨基)作为交联点形成水凝胶。物理方法以dna凝胶基本单体通过非化学键(氢键、范德华力、dna分子间的缠绕作用)作为交联点形成水凝胶单体。其中，dna水凝胶单体包括y型结构单体、x型结构单体或t型结构单体。步骤2)中所需溶液为生理盐水、磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersaline，pbs)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(hepes)、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(tris-hclbuffer)。步骤3)中药物微球和dna水凝胶单体混和的摩尔浓度比优选为1:3～3:1，混合时间优选为：10～30min，混合温度优选为：15～37℃。更优选地，药物微球和dna水凝胶单体混和的摩尔浓度比优选为1:1～3:1。步骤3)中，dna连接酶包括：e·colidna连接酶或t4dna连接酶。根据本发明的第二方面，提供一种根据上述制备方法制备的dna水凝胶介导的眼用药物输运系统。根据本发明的第三方面，提供一种dna水凝胶介导的眼用药物输运系统在制药中的应用。众所周知，dna水凝胶具有良好的生物相容性和生物可降解性，可作为载体向肿瘤组织和免疫系统实现高效递送。但是，现有技术中dna水凝胶能够载运的药物仅仅局限于水溶性药物或者能够直接与dna结合的药物(如dox，喜树碱，sirna等)，其中，治肿瘤选用的化疗药dox/喜树碱等都是dna嵌入型，不需要为解决药物如何进入凝胶而设计特殊的步骤。应用dna水凝胶向眼部递送药物的工作在此之前更是从未报道，主要原因可能是因为单纯dna水凝胶能够装载的药物种类有限。然而，根据本发明，发明人首次采用dna水凝胶装载药物微球，微球结构的引入使得对dna水凝胶中装载的药物没有特殊限制。此外，dna水凝胶与眼部黏膜有良好的亲和力，dna水凝胶与高分子微球都具有缓释效应，大大延长了药物在眼部的滞留时间，药物流失少，提高了生物利用度，使用方便。再次，dna水凝胶和微球的双重负载大大提高了药物的装载量，因此，本发明提供了一种高效安全的眼部药物输运系统。对于本领域技术人员来说，本发明相对现有技术均是非显而易见的。本发明相对现有技术具有的积极进步效果还在于：根据本发明制备的一种基于dna水凝胶的眼用药物输运系统，能够高效装载药物，增加药物在眼部的富集并延长滞留时间，从而显著提高对眼科疾病的治疗效果，具有良好的医学应用前景。特别是在实际应用中，该眼用药物输运系统介导的地塞米松药物递送系统每日给药一次的疗效显著优于市售地塞米松滴剂每日多次给药的疗效。总之，本发明提供了一种简单、安全且高效的眼用药物输运系统，在眼科疾病治疗中具有良好的应用前景。附图说明图1是根据本发明的实施例1制备的plga药物微球的扫描电镜成像图；图2是根据本发明的实施例1制备的hdex复合物的流变学测试图；图3是根据本发明的实施例1制备的hdex复合物的扫描电镜图，其中，圆圈内是复合物中的plga药物微球；图4是plga药物微球和dna水凝胶单体在不同混合浓度比下制备hdex复合物的产物的照片；图5是不同dex终浓度的hdex复合物和人角膜上皮细胞一起孵育24h、48h下的细胞存活率的结果比较；图6是hdex复合物和市售dex滴眼液的细胞摄取行为结果比较；其中，a为hdex复合物和dex滴眼液分别和hce-t细胞孵育6h后细胞内dex含量分析图，b为上述药物分别和细胞孵育6h后洗涤，再孵育2-24h细胞内dex含量分析图；图7是根据本发明制备的hdex复合物与市售dex滴眼液随着时间的变化在小鼠眼部不同组织中滞留量的结果分析图；其中，a为结膜组织中结果；b为眼球组织中结果；图8是hdex复合物和dex滴眼液在治疗小鼠过敏性结膜炎中的症状评分比较图；图9是hdex复合物和dex滴眼液在治疗小鼠过敏性结膜炎中的血清超敏反应分子含量比较图，其中，a为各组间血清免疫分子ige的含量统计；b为各组间血清卵清蛋白特异性ige的含量统计；图10是hdex复合物和dex滴眼液在用药后随着时间变化在兔子眼部的荧光成像图比较；图11是hdex复合物和dex滴眼液在治疗兔子过敏性结膜炎中的血清ige含量比较图。具体实施方式以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。本发明主要选择物理方法制备的dna水凝胶为代表，药物微球以plga微球为代表，以过敏性结膜炎为应用代表，递送的药物以地塞米松(dex)为主，以下实施例具体说明本发明的实施效果。实施例1：dna水凝胶-地塞米松药物输运系统的制备及表征1.1制备药物微球。将100mgplga和20mgdex溶解于2ml二氯甲烷中，混匀，通过注射器缓慢加入到5ml2％pva水相溶液中，冰浴超声，形成水包油型乳液。将该乳液加入25ml0.1％pva水溶液中，800rpm磁力搅拌，挥发6h，去离子水清洗3～5次，离心，冷冻干燥，制得plga药物微球。1.2制备dna水凝胶单体。将y型结构单链按照浓度比y1:y2:y3＝1:1:1(单链终浓度均为1mm)混合，95℃5min，反应形成y型结构单体，冷却到室温稳定1h。所述dna序列如表1所示。表1：实施例1中涉及的dna序列名称序列(5’to3’)y15’-acgttcgctgacgttgcagacatcacgttgacgctgtcga-3’y25’-acgttcgtcaacgtctgtctgctgtctgcaacgtcagcga-3’y35’-acgttcgacagcgtcaacgtgagcagacagacgttgcga-3’1.3将上述plga药物微球、y型结构单体按照浓度比1.2:1混合均匀,加入t4dna连接酶(neb，货号：m0202s)反应，反应条件为：t4dna连接酶：20uμl-1，y型结构单体终浓度：250μm，获得dna水凝胶-地塞米松复合物(hdex)，其中dex的浓度为1mg/ml。结果：plga药物微球的扫描电镜结果如图1，马尔文纳米粒度电位仪测得粒径为500±50nm。高效液相色谱检测计算得到该微球对dex的载药量达到10％，包封率为30％。流变学测试显示hdex存储模量g’稍大于损耗模量g”，如图2所示，因此为水凝胶状态。hdex复合物的扫描电镜结果如图3所示，呈现三维网状多孔结构，plga药物微球均匀分散在水凝胶中。实施例2：plga药物微球和dna水凝胶单体的比例对制备hdex的影响plga药物微球和dna水凝胶单体的制备方法同实施例1。将所合成药物微球和单体分别按照浓度比1:3、1:1、3:1和10:1混合，加入t4dna连接酶反应，反应条件为：t4连接酶：20uμl-1、y型结构单体终浓度：250μm，制得hdex。结果：plga药物微球和单体浓度混合比为1:3、1:1、3:1的条件下，能成功制备出hdex复合物，所制备的hdex复合物中药物浓度分别为0.4mgml-1、0.9mgml-1、1.2mgml-1；而药物微球和单体浓度混合比为10:1的条件下，无法成功制备出hdex复合物，如图4所示。因此，合成hdex复合物的plga药物微球与dna水凝胶单体较优浓度比为1:1～3:1。实施例3:plga与药物的比例对微球载药量的影响将100mgplga分别与5、10、20mgdex混合溶解于2ml二氯甲烷中，混匀，通过注射器缓慢加入到5ml2％pva水相溶液中，冰浴超声，形成水包油型乳液。将该乳液加入25ml0.1％pva水溶液中，800rpm磁力搅拌，挥发6h，去离子水清洗3～5次，冷冻干燥得到微球；甲醇溶解微球，高效液相色谱分析微球中药物含量。结果：plga与dex质量比20:1～5:1范围内均能合成微球，其中10:1～5:1范围内形成的微球载药量较高。表2：plga与药物的比例对微球载药量的影响plga:dex质量比包封率载药量微球产率微球大小20:150±3％5±0.2％47±2％463±60nm10:136±2％8±0.3％45±3％480±40nm5:130±3％10±0.2％50±3％500±50nm实施例4：hdex复合物安全性评估人角膜上皮细胞(hce-t细胞)购自北纳生物有限公司，以6000/孔的密度接种于96孔板，贴壁过夜，分别加入dex终浓度为12.5、25和50μgml-1的hdex复合物，以不做任何处理的细胞为对照，孵育24/48h后用mtt(sigma)染色4h，加入10％酸性sds溶解生成的甲瓚结晶，于od570nm处测定每孔的紫外吸收值，细胞存活率以od(处理组)/od(对照组)的百分比表示。结果：实验结果显示，hdex复合物对细胞不显示任何毒性效应，参见图5。实施例5:hdex复合物和dex滴眼液的细胞摄取行为比较hce-t细胞以5×105/孔的密度接种在6孔板中，贴壁过夜，分别加入本发明制备的hdex复合物和市售dex磷酸钠滴眼液(两组中dex浓度均为32μgml-1)，37℃孵育6h，pbs洗涤。以未做任何处理的细胞为对照。收集细胞计数，加入甲醇超声破碎、过滤、蒸发、溶解、再过滤，高效液相色谱分析细胞内药物浓度。两组洗涤后分别在37℃孵育2，4，6，12和24h，收集细胞高效液相色谱分析细胞内药物浓度。结果：如图6所示，和dex滴眼液组相比，hdex复合物组在hce-t细胞内的药物浓度明显高的多(a)；hdex复合物和dex滴眼液分别与细胞孵育6h后洗涤，dna水凝胶上负载的dex被细胞摄取后能在24h内缓慢释放，而dex滴眼液组在hce-t细胞内的药物浓度经过洗涤几乎没有滞留(b)。实施例6：hdex复合物和dex滴眼液在小鼠眼部滞留时间比较balb/c小鼠(购自上海斯莱克实验动物公司)，雄性，随机分成2组，每组45只。设置以下实验组：凝胶组、滴眼液组，分别滴入hdex复合物和dex滴眼液，双眼，每眼20μl，药物浓度为1mgml-1，轻轻闭合双眼。滴眼后10、20、40min和1、2、4、6、8、12、24h取结膜和眼球(每组每个时间点5只)，分别置于甲醇溶液中，剪碎、研磨、超声组织，过滤后蒸发去除甲醇，溶解后再过滤，高效液相色谱分析，每个样品平行操作三份，计算不同时间点组织内药物滞留量。结果:如图7所示，滴入眼部后，和滴眼液组相比，hdex复合物组在各时间点结膜/眼球内的药物滞留量显著升高(a)，并且dna水凝胶上负载的dex进入眼部组织后能在24h内缓慢释放(b)。实施例7：hdex复合物和dex滴眼液在小鼠过敏性结膜炎中的应用比较balb/c小鼠，雄性，随机分成4组，每组5只，设置以下实验组：对照组，模型组，凝胶组以及滴眼液组。后三组分别于第0、7天腹腔注射200μl含100mg卵清蛋白和5mgal(oh)3佐剂的混合物。第15天开始每天用4mgml-1卵清蛋白溶液点眼刺激双眼，连续7天；刺激眼部前1h对小鼠双眼进行给药。空白对照组和模型组使用生理盐水滴眼，每天一次，每次每眼20μl；凝胶组每天给药一次，滴眼液组每天给药两次，每次每眼均为20μl(凝胶组和滴眼液组药物种类和浓度同实施例4)。末次点眼72h后，用4mgml-1卵清蛋白溶液滴入眼部进行致敏原位攻击，激发20min后，观察过敏性结膜炎的超敏反应，裂隙灯显微镜观察眼部特征，根据magone等的评分标准(文献：m.t.magone,c.c.chan,l.v.rizzo,a.t.kozhich,s.m.whitcup,anovelmurinemodelofallergicconjunctivitis,clin.immunol.immunopathol.87(1998)75–84)，通过双盲法对结膜充血、眼睑水肿、分泌物、结膜水肿等指标进行评估。24h后，眼眶取血，全血室温静置4小时，3000rpm离心15分钟，收集血清，elisa法检测血清中总ige以及卵清蛋白特异性ige的含量。血清ige含量用igemouseuncoatedelisakitwithplates(ebioscience,货号885046022)检测；卵清蛋白特异性ige含量用legendmaxtmmouseovaspecificigeelisakitwithpre-coatedplates(biolegend，货号439807)检测。结果：正常小鼠活泼，无明显畏光；裂隙灯下观察，眼睑结膜无明显充血，水肿情况，且无流泪，分泌物过多等症状。模型小鼠易激惹、倦怠、畏光；眼睑结膜有水肿、充血症状，同时分泌物增多，并伴有瘙痒导致的挠抓行为。过敏性结膜炎症状评分结果显示，相对于滴眼液组，hdex复合物组的评分显著降低，接近于正常小鼠水平(图8)。elisa检测结果显示，和滴眼液组相比，hdex复合物组的血清ige(介导i型超敏反应的重要免疫分子)和卵清蛋白特异性ige含量显著降低，接近对照水平。更重要的是，hdex复合物组的每日给药次数少于滴眼液组(图9)。实施例8：dna水凝胶在新西兰兔眼部滞留行为观察新西兰兔(购自上海斯莱克实验动物公司)，雄性，随机分成2组，每组3只，设置dna水凝胶组以及对照组。dna水凝胶单体的制备方法同实施例1。荧光微球(fluospheres；invitrogen,grandisland,ny)、y型结构单体混合(质量浓度比为2:5)，加入t4dna连接酶反应(20uμl-1)，获得dna水凝胶-荧光微球复合物(hs)。微量取样器分别在各兔结膜囊内滴入200μlhs，对照组滴入荧光微球200μl，两组荧光微球浓度均为4mgml-1。轻轻闭合双眼，5、10、30min和1、3、4h在体式荧光显微镜下观察兔子眼部。结果：滴入5min后，和对照组相比，hs复合物组眼部荧光信号显著升高，并且dna水凝胶上负载的荧光小球进入眼部组织后能在4h内缓慢释放(图10)。实施例9：hdex复合物和dex滴眼液在新西兰兔过敏性结膜炎中的应用比较新西兰兔，雄性，随机分成4组，每组3只，设置以下实验组：对照组，模型组，凝胶组以及滴眼液组。后三组分别于第0天、7天腹腔注射卵清蛋白(3.4mgkg-1)和al(oh)3(85mgkg-1)佐剂混合物，第15天开始每天用卵清蛋白(4mgml-1)溶液点眼刺激两眼眼部，连续7天；刺激眼部前1h对兔子两眼进行给药，空白对照组和模型组使用生理盐水滴眼，每天一次，每次每眼200μl；凝胶组每天给药一次，每次每眼200μl；滴眼液组每天给药两次，每次每眼200μl(凝胶组和滴眼液组药物种类和浓度同实施例4)。末次点眼72h后，用卵清蛋白溶液滴入眼部进行致敏原位攻击。24h后，眼眶取血，全血室温静置4小时，3000rpm离心15分钟，收集血清，elisa法检测血清中ige含量。ige含量用rabbitigeelisakit(上海樊克生物科技有限公司，货号fk-sx2415)检测。结果：elisa检测结果显示，和滴眼液组相比，hdex复合物组的血清ige含量显著降低。更重要的是，hdex复合物组的每日给药次数还少于滴眼液组(图11)。以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。sequencelisting<110>上海应用物理研究所<120>一种dna水凝胶介导的眼用药物输运系统及其制备方法和应用<160>3<210>1<211>40<212>dna<213>人工序列<400>1acgttcgctgacgttgcagacatcacgttgacgctgtcga40<210>2<211>40<212>dna<213>人工序列<400>2acgttcgtcaacgtctgtctgctgtctgcaacgtcagcga40<210>3<211>39<212>dna<213>人工序列<400>3acgttcgacagcgtcaacgtgagcagacagacgttgcga39当前第1页12