一种琼脂糖醋酸酯纳米纤维膜的制备方法与流程

本发明属于骨科材料技术领域，具体涉及一种英语骨组织工程支架的琼脂糖醋酸酯纳米纤维膜的制备方法。

背景技术：

近年来，多糖具有突出的降解性，优异的生物相容性，并具有促进细胞粘附、增殖和组织再生的光学生物医学能力。目前已经将许多不同的多糖用于组织工程支架，例如藻酸盐，淀粉基材料，纤维素，葡聚糖和壳聚糖。

琼脂糖，一种由d-半乳糖和3，6-脱水-l-吡喃半乳糖组成的多糖，其来自红藻细胞壁且已被广泛研究用于软骨细胞培养和软骨再生。骨与软骨结构非常接近。琼脂糖的这些特征可能适合骨再生。基于琼脂糖的凝胶也被证明对成骨细胞粘附和增殖具有良好的生物相容性。琼脂糖的生物惰性，无毒和低炎症反应在这些研究中起着非常重要的作用。然而，琼脂糖中的大量羟基导致琼脂糖的强亲水性，这导致加工性能差，并且基于琼脂糖的支架的机械弱点和孔隙率较小，这对骨缺损修复是不利的。因此，通过改性是拓宽其在组织工程中应用的关键问题。琼脂糖醋酸酯(aga)是疏水性琼脂糖衍生物，以进一步改善琼脂糖生物医学应用的可加工性。琼脂糖醋酸酯比琼脂糖更疏水，有利于蛋白质吸附或细胞粘附。琼脂糖醋酸酯可以溶解在许多有机溶剂中，并且可以通过多种成型方法制造。如琼脂糖醋酸酯可以纺丝，并且其纤维在水中保持稳定而不膨胀，这有利于构建多孔组织工程支架。

骨是羟基磷灰石(ha)和ⅰ型胶原纤维的混合体系，以复杂且有组织的多孔结构组装。在骨组织工程研究中，磷酸钙材料已经证明了骨诱导性，并且通常被添加到支架中以改善骨诱导性。已发现β-tcp用于骨组织工程中具有足够的生物降解性，良好的生物相容性和骨诱导性。这种与聚合物混合的无机颗粒也将改善支架的机械性能。由aga和β-tcp组成的复合支架可在骨再生中结合它们的优点。

各种加工技术已被用于将不同的聚合物(pla，pcl，壳聚糖，胶原蛋白等)加工成适用的支架，以满足相分离，冷冻干燥，自组装和盐颗粒浸出等基本要求。静电纺丝广泛被认为是用于制造纤维支架的有前景的聚合物加工技术。由于天然细胞外基质由纤维胶原蛋白和蛋白多糖组成，并且胶原纤维以3d多孔结构组织，一些其他形成过程不能完美地模仿细胞外基质结构。电纺纤维支架通常由纳米直径的纤维组成，具有高表面积与体积比和高孔隙率，因此非常适合复制细胞外基质(ecm)的物理结构。此外，可以通过掺入生物活性化合物来功能化由电纺纤维组成的支架以增强细胞活性。因此，电纺纳米纤维已广泛用于人体组织，如皮肤，骨骼，神经和血管的再生。

因此，本领域需要开发一种生物相容性优异、表面形态优良、润湿性和机械稳定性好并且成骨作用明显的纳米纤维膜支架，从而克服临床应用中单一骨修复材料的缺点，提升骨修复的应用价值。

技术实现要素：

针对现有技术中的问题，本发明提供一种琼脂糖醋酸酯纳米纤维膜的制备方法，解决了临床应用中单一骨修复材料的缺点，通过琼脂糖醋酸酯与生物活性物质β-磷酸三钙结合，得到生物相容性优异、表面形态优良、润湿性和机械稳定性好并且成骨作用明显的纳米纤维膜支架，提升了骨修复方面的应用价值。

为实现以上技术目的，本发明的技术方案是：

一种琼脂糖醋酸酯纳米纤维膜的制备方法，包括琼脂糖醋酸酯的制备、电纺液的配制和纳米纤维膜的制备；

所述琼脂糖醋酸酯的制备包括：

步骤1，将琼脂糖加入冰乙酸中磁力搅拌1-3h，然后加入醋酸酐和硫酸反应0.5-5h，得到琼脂糖醋酸酯悬浊液；

步骤2，将琼脂糖醋酸酯悬浊液进行多次蒸馏水洗涤，直至抽滤后的滤液呈中心，然后将过滤得到的琼脂糖醋酸酯冷冻，干燥；

所述电纺液的配制包括：

步骤3，将步骤2中干燥的琼脂糖醋酸酯加入至有机溶剂中，并室温搅拌5-10h，得到均相的琼脂糖醋酸酯溶液；

步骤4，将β-磷酸三钙粉末加入至琼脂糖醋酸酯溶液中搅拌10-20h，然后放入500w超声仪中40％强度下超声处理10-30min，得到琼脂糖醋酸酯/β-磷酸三钙复合溶液，即为电纺液；

所述纳米纤维膜的制备包括：

步骤5，将电纺液通过10ml的塑料注射器内，并与注射泵相接，然后进行高压静电纺丝反应，得到纳米纤维，并在真空下干燥。

所述步骤1中的琼脂糖的重均分子量为100-400万。

所述步骤1中的琼脂糖在冰乙酸内的浓度为5-20％(g/ml)。

所述步骤1中的冰乙酸、醋酸酐和硫酸的体积比为60-100:40-80:1.

所述步骤1中的反应的温度为45-55℃。

所述步骤3中的琼脂醋三醋酸酯的浓度为5-10％(g/ml)。

所述步骤3中的有机溶剂采用二甲基乙酰胺、丙酮或二氯甲烷中的一种。

所述步骤4中的β-磷酸三钙粉末加入至琼脂糖醋酸酯的质量比为0-1:1。

所述步骤5中的高压静电纺丝参数如下：纺丝电压为10-30kv，推进速度为0.5-2.0ml/h，接收距离为10-30cm。

本发明先将琼脂糖疏水改性，将琼脂糖醋酸酯与生物活性物质β-磷酸三钙(β-tcp)混合，通过静电纺丝法制备aga/β-tcp纳米纤维膜。纳米纤维膜的平均纤维直径随β-tcp颗粒含量的增加而增加；与β-tcp共混后，琼脂糖醋酸酯的亲水性和机械性能得到改善。在基于aga的纳米纤维膜上培养大鼠骨髓间充质干细胞(rbmscs)，与单一aga膜相比，含有β-tcp的纳米纤维膜上更多的rbmscs分化为成骨细胞样细胞，当rbmscs在含有β-tcp的纳米纤维膜上培养时，可以检测到更多的碱性磷酸酶(alp)和矿化基质。生物学评价结果表明含有β-tcp的纳米纤维膜促进了大鼠骨髓间充质干细胞(rbmscs)的增殖和成骨分化。另外，纳米纤维膜在四周植入期间在体内没有明显的炎症反应。因此，具有生物相容性质的基于aga/β-tcp的纳米纤维膜可潜在用于骨组织修复。

从以上描述可以看出，本发明具备以下优点：

1.本发明解决了临床应用中单一骨修复材料的缺点，通过琼脂糖醋酸酯与生物活性物质β-磷酸三钙结合，得到生物相容性优异、表面形态优良、润湿性和机械稳定性好并且成骨作用明显的纳米纤维膜支架，提升了骨修复方面的应用价值。

2.本发明制备的纳米纤维膜的平均纤维直径随β-tcp颗粒含量的增加而增加，可控性强，且控制简单。

3.本发明采用的琼脂糖醋酸酯具有良好的生物相容性，可降解，能够提供连续的结构，易于成型，可实现高孔隙率和高表面积，满足骨修复的要求。

4.本发明采用β-磷酸三钙作为生物活性材料，利用其成分与骨基质的无机成分相似，与骨结合好的特点，确保人体细胞可以在β-磷酸三钙材料上正常生长，分化和繁殖。

附图说明

图1是本发明实施例1的纳米纤维膜的纤维sem图，放大倍数为5000倍。

具体实施方式

结合图1，详细说明本发明的一个具体实施例，但不对本发明的权利要求做任何限定。

一种琼脂糖醋酸酯纳米纤维膜的制备方法，包括琼脂糖醋酸酯的制备、电纺液的配制和纳米纤维膜的制备；

所述琼脂糖醋酸酯的制备包括：

步骤1，将琼脂糖加入冰乙酸中磁力搅拌1-3h，然后加入醋酸酐和硫酸反应0.5-5h，得到琼脂糖醋酸酯悬浊液；

步骤2，将琼脂糖醋酸酯悬浊液进行多次蒸馏水洗涤，直至抽滤后的滤液呈中心，然后将过滤得到的琼脂糖醋酸酯冷冻，干燥；

所述电纺液的配制包括：

步骤3，将步骤2中干燥的琼脂糖醋酸酯加入至有机溶剂中，并室温搅拌5-10h，得到均相的琼脂糖醋酸酯溶液；

步骤4，将β-磷酸三钙粉末加入至琼脂糖醋酸酯溶液中搅拌10-20h，然后放入500w超声仪中40％强度下超声处理10-30min，得到琼脂糖醋酸酯/β-磷酸三钙复合溶液，即为电纺液；

所述纳米纤维膜的制备包括：

步骤5，将电纺液通过10ml的塑料注射器内，并与注射泵相接，然后进行高压静电纺丝反应，得到纳米纤维，并在真空下干燥。

所述步骤1中的琼脂糖的重均分子量为100-400万。

所述步骤1中的琼脂糖在冰乙酸内的浓度为5-20％(g/ml)。

所述步骤1中的冰乙酸、醋酸酐和硫酸的体积比为60-100:40-80:1.

所述步骤1中的反应的温度为45-55℃。

所述步骤3中的琼脂醋三醋酸酯的浓度为5-10％(g/ml)。

所述步骤3中的有机溶剂采用二甲基乙酰胺、丙酮或二氯甲烷中的一种。

所述步骤4中的β-磷酸三钙粉末加入至琼脂糖醋酸酯的质量比为0-1:1。

所述步骤5中的高压静电纺丝参数如下：纺丝电压为10-30kv，推进速度为0.5-2.0ml/h，接收距离为10-30cm。

实施例1

一种琼脂糖醋酸酯纳米纤维膜的制备方法，包括如下步骤：

(1)琼脂糖醋酸酯的制备：

称取干燥好的3g琼脂糖(mw＝300万)，放入盛有30ml冰乙酸的烧瓶中，磁力搅拌琼脂糖溶胀2h，再加入24ml醋酸酐和0.4ml的硫酸，在50℃温度下反应2.0h。反应结束后，用蒸馏水洗涤多次，抽滤至滤液呈中性，最后将琼脂糖醋酸酯冷冻，干燥即得产物。

(2)电纺液的配制：

为了制备聚合物溶液，首先将琼脂糖醋酸酯6g溶解在100ml二甲基乙酰胺与丙酮的混合有机溶剂中(v:v＝1:1)，在室温下搅拌6h溶解，得到琼脂糖醋酸酯浓度为6％(g/ml)均相溶液。然后将3gβ-磷酸三钙粉末再加入到上述溶液中并继续搅拌15h，使粉末均匀分散并获得稳定均一的溶液。最后将混合液再放入500w超声仪40％强度下超声处理20min，制备琼脂糖醋酸酯/β-磷酸三钙复合溶液(电纺液)。

(3)纤维膜的制备：

将制备复合材料的溶液注入到10ml的塑料注射器内，针头为内径为0.5mm的不锈钢扁针，并连接到注射泵上。纺丝电压20kv，推进速度1.0ml/h，接收距离为15cm，用铝箔覆盖在静电鼓收集器上收集，得到细的纳米纤维。将沉积的纳米纤维膜从收集器上小心地分离出并在真空下干燥1h。

经检测，该实施例制备的纳米纤维膜的扫描sem图如图1所示。

实施例2

一种琼脂糖醋酸酯纳米纤维膜的制备方法，包括如下步骤：

(1)琼脂糖醋酸酯的制备：

称取干燥好的6g琼脂糖(mw＝200万)，放入盛有40ml冰乙酸的烧瓶中，磁力搅拌琼脂糖溶胀3h，再加入35ml醋酸酐和0.5ml的硫酸，在50℃温度下反应2.0h。反应结束后，用蒸馏水洗涤多次，抽滤至滤液呈中性，最后将琼脂糖醋酸酯冷冻，干燥即得产物。

(2)电纺液的配制：

为了制备聚合物溶液，首先将琼脂糖醋酸酯8g溶解在100ml二甲基乙酰胺与丙酮的混合有机溶剂中(v:v＝1:1)，在室温下搅拌10h溶解，得到琼脂糖醋酸酯浓度为8％(g/ml)均相溶液。然后将2.4gβ-磷酸三钙粉末再加入到上述溶液中并继续搅拌10h，使粉末均匀分散并获得稳定均一的溶液。最后将混合液再放入500w超声仪40％强度下超声处理25min，制备琼脂糖醋酸酯/β-磷酸三钙复合溶液(电纺液)。

(3)纤维膜的制备：

将制备复合材料的溶液注入到10ml的塑料注射器内，针头为内径为0.5mm的不锈钢扁针，并连接到注射泵上。纺丝电压30kv，推进速度1.2ml/h，接收距离为15cm，用铝箔覆盖在静电鼓收集器上收集，得到细的纳米纤维。将沉积的纳米纤维膜从收集器上小心地分离出并在真空下干燥0.5h。

实施例3

一种琼脂糖醋酸酯纳米纤维膜的制备方法，包括如下步骤：

(1)琼脂糖醋酸酯的制备：

称取干燥好的8g琼脂糖(mw＝400万)，放入盛有40ml冰乙酸的烧瓶中，磁力搅拌琼脂糖溶胀3h，再加入32ml醋酸酐和0.4ml的硫酸，在55℃温度下反应5h。反应结束后，用蒸馏水洗涤多次，抽滤至滤液呈中性，最后将琼脂糖醋酸酯冷冻，干燥即得产物。

(2)电纺液的配制：

为了制备聚合物溶液，首先将琼脂糖醋酸酯10g溶解在100ml丙酮中，在室温下搅拌10h溶解，得到琼脂糖醋酸酯浓度为10％(g/ml)均相溶液。然后将10gβ-磷酸三钙粉末再加入到上述溶液中并继续搅拌20h，使粉末均匀分散并获得稳定均一的溶液。最后将混合液再放入500w超声仪40％强度下超声处理30min，制备琼脂糖醋酸酯/β-磷酸三钙复合溶液(电纺液)。

(3)纤维膜的制备：

将制备复合材料的溶液注入到10ml的塑料注射器内，针头为内径为0.5mm的不锈钢扁针，并连接到注射泵上。纺丝电压30kv，推进速度2.0ml/h，接收距离为30cm，用铝箔覆盖在静电鼓收集器上收集，得到细的纳米纤维。将沉积的纳米纤维膜从收集器上小心地分离出并在真空下干燥2h。

实施例4

一种琼脂糖醋酸酯纳米纤维膜的制备方法，包括如下步骤：

(1)琼脂糖醋酸酯的制备：

称取干燥好的2g琼脂糖(mw＝100万)，放入盛有40ml冰乙酸的烧瓶中，磁力搅拌琼脂糖溶胀1h，再加入26.7ml醋酸酐和0.7ml的硫酸，在45℃温度下反应0.5h。反应结束后，用蒸馏水洗涤多次，抽滤至滤液呈中性，最后将琼脂糖醋酸酯冷冻，干燥即得产物。

(2)电纺液的配制：

为了制备聚合物溶液，首先将琼脂糖醋酸酯5g溶解在100ml二氯甲烷中，在室温下搅拌5h溶解，得到琼脂糖醋酸酯浓度为5％(g/ml)均相溶液。然后将0.1gβ-磷酸三钙粉末再加入到上述溶液中并继续搅拌10h，使粉末均匀分散并获得稳定均一的溶液。最后将混合液再放入500w超声仪40％强度下超声处理10min，制备琼脂糖醋酸酯/β-磷酸三钙复合溶液(电纺液)。

(3)纤维膜的制备：

将制备复合材料的溶液注入到10ml的塑料注射器内，针头为内径为0.5mm的不锈钢扁针，并连接到注射泵上。纺丝电压10kv，推进速度0.5ml/h，接收距离为10cm，用铝箔覆盖在静电鼓收集器上收集，得到细的纳米纤维。将沉积的纳米纤维膜从收集器上小心地分离出并在真空下干燥0.5h。

性能检测

对比例采用市售琼脂糖醋酸酯纳米纤维膜。

综上所述，本发明具有以下优点：

1.本发明解决了临床应用中单一骨修复材料的缺点，通过琼脂糖醋酸酯与生物活性物质β-磷酸三钙结合，得到生物相容性优异、表面形态优良、润湿性和机械稳定性好并且成骨作用明显的纳米纤维膜支架，提升了骨修复方面的应用价值。

2.本发明制备的纳米纤维膜的平均纤维直径随β-tcp颗粒含量的增加而增加，可控性强，且控制简单。

3.本发明采用的琼脂糖醋酸酯具有良好的生物相容性，可降解，能够提供连续的结构，易于成型，可实现高孔隙率和高表面积，满足骨修复的要求。

4.本发明采用β-磷酸三钙作为生物活性材料，利用其成分与骨基质的无机成分相似，与骨结合好的特点，确保人体细胞可以在β-磷酸三钙材料上正常生长，分化和繁殖。

可以理解的是，以上关于本发明的具体描述，仅用于说明本发明而并非受限于本发明实施例所描述的技术方案。本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换，以达到相同的技术效果；只要满足使用需要，都在本发明的保护范围之内。