一种一步法软骨再生修复复合物及其制备方法与流程

本发明涉及一种组织工程产品技术，尤其涉及一种一步法软骨再生修复复合物及其制备方法。

背景技术：

关节软骨能减少相邻两骨间的摩擦，缓冲运动时产生的震动，所以由运动造成的软骨损伤极为普遍。有数据表明，单美国的软骨相关手术每年就有超过40万例。由于软骨无血管、无神经分布，软骨损伤后几乎不能自行修复，如果不采取手段干预治疗，会导致进一步的软骨和软骨下骨磨损，引发骨关节炎，对其结构和功能造成不可逆的损害，严重影响患者的生活质量。目前临床治疗软骨损伤的常用方法包括关节腔灌洗清创术、微骨折术等，及后期的关节置换，上述治疗方案能减轻关节疼痛和缓解症状，并不能有效地促进软骨组织的修复再生。而自体软骨移植仅修复小面积软骨缺损且造成病人二次创伤。因此，寻找新型的、可有效促进软骨生理性再生修复的方法具有极其重要的临床意义。

近年来，随着组织工程和再生医学技术的不断成熟，为提高软骨的修复质量带来崭新的机会。组织工程的三要素是种子细胞、支架材料和生物活性分子。自体软骨细胞移植术(组织工程化组织移植)在国外已经被国际软骨修复学会(icrs)推荐为大面积软骨缺损的修复方法，该方法的大致过程为：关节镜下取少量自体非负重区软骨组织，体外分离、培养、扩增自体软骨细胞，细胞种植在胶原支架等生物材料上，加以合适的诱导因子培养组织工程化软骨组织，最终二次手术移植于体内软骨缺损处。该方法对满足治疗适应证的患者疗效较好，但也有很大的不足：需要体外软骨细胞的扩增与培养，需要二次手术，成本昂贵，临床准入门槛高。目前该技术在国内还处于新技术的临床研究阶段，尚未成为成熟的临床应用技术。

软骨微环境中本身存在原位种子细胞---软骨干细胞(c-mscs)，滑膜干细胞(sm-mscs)和骨髓干细胞(b-mscs)，多项研究表明细胞微环境对于干细胞的迁移、黏附、增殖、分化等各个方面都有显著的影响。如果能在体内创造合适的软骨微环境，并提供原位软骨再生修复所必须的再生要素(种子细胞、生物材料、生长因子等)，有效的诱导干细胞参与软骨损伤自发修复。无需进行体外细胞的扩增培养，一次手术实现原位再生修复，将对现今软骨组织工程带来革命性的创新，极大的提高软骨修复的效率，降低成本，降低患者痛苦，降低医疗准入门槛。

目前国外出现了基质诱导的自体软骨修复技术(amic)，在微骨折术基础上，覆盖胶原支架等生物材料，为骨髓间充质干细胞提供更好的愈合环境，挺高软骨修复的质量，疗效比微骨折术更持久。申请号为201810213909.3的专利公开了一种关节骨软骨脱细胞和富集血小板血浆制成的软骨缺损修复材料及其制备方法；申请号为201810025677.9的专利公开了一种软骨微粒和ii型胶原蛋白制成的软骨缺损修复材料。两种方法均在改善软骨修复的效果。然而，还没有形成一套系统性的“一步法软骨修复复合物及其制备方法与应用”，申请人前期研究中发明了改良的微骨折器械(zl201510816922.4)，降低微骨折术对软骨下骨的损伤，并减少微骨折术的打孔数量。基于组织工程学原理，为组织生长提供足够的种子细胞、生长因子和一个良好的支架环境是关键。基于此，本发明提出了以自体软骨微粒和自体骨髓单核细胞浓集物为种子细胞来源、自体外周血浓集其中的去除白细胞的富血小板血浆为生长因子和生物材料为细胞生长微环境的原位组织工程组织的构建方法，用于修复受损的关节软骨组织。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种一步法软骨再生修复复合物。该复合物能够有效改善软骨损伤部位的愈合微环境，并提供软骨原位再生修复所需的再生要素，诱导原位骨髓间充质干细胞、软骨干细胞等种子干细胞参与损伤修复，从而促进软骨损伤的修复再生。

本发明的目的之二在于提供一种一步法软骨再生修复复合物的制备方法。该制备方法可操作性强，适合推广。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：一种一步法软骨再生修复复合物由种子细胞和去除白细胞的富血小板血浆制成；所述种子细胞包括骨髓单核细胞浓集物和软骨微粒。

进一步地，所述去除白细胞的富血小板血浆由外周血经离心制备而成，所述去除白细胞的富血小板血浆的用量为根据软骨缺损面积每1cm²对应采集外周静脉血量8～12ml。

进一步地，所述去除白细胞的富血小板血浆的制备方法如下：采集过程无菌操作，采集外周血；外周血进行第一次离心，去除红细胞，离心力200～250g，时间5～15min；取上层的淡黄色血浆层，丢弃下层红色的红细胞层；淡黄色血浆层继续进行第二次离心，去除白细胞，离心力120～200g，时间3～8min；取上层血浆层，丢弃底部少量白细胞为主的沉淀物；血浆层继续进行第三次离心，浓集富血小板血浆为目的，离心力800～1100g，时间5～10min；取底部血小板及上方的血浆1～5ml，并混匀，即得。

进一步地，所述骨髓单核细胞浓集物由骨髓血经离心制备而成，所述骨髓血的用量为根据软骨缺损面积每1cm²对应采集骨髓血量8～12ml。

进一步地，所述骨髓单核细胞浓集物的制备方法如下：采集过程无菌操作，采集骨髓血；骨髓血进行第一次离心，去除骨髓血中的红细胞系，离心力350～450g，时间5～15min；取上层液体及细胞，丢弃下层红色的红细胞层；上层液体及细胞继续进行第二次离心，浓集骨髓单核细胞，离心力250～350g，时间5～15min；取底部沉淀的细胞及上方需要体积的液体0.5～1ml，即得。

进一步地，所述软骨微粒取自非负重区健康软骨组织，或创伤引起软骨剥脱及缺损边缘需要修整的健康软骨组织，软骨组织的用量为根据软骨缺损面积scm²，取(0.1-0.25)scm²的软骨组织量。

进一步地，所述软骨微粒由软骨组织经切碎而成，颗粒不大于1mm，生理盐水浸没湿润保护软骨微粒。

本发明的目的之二采用如下技术方案实现：一种一步法软骨再生修复复合物的制备方法，包括如下步骤：

预混合的步骤：将制备的去除白细胞的富血小板血浆和骨髓单核细胞浓集物轻轻混合，得到富血小板血浆/骨髓单核细胞浓集物复合物；

混合的步骤：在富血小板血浆/骨髓单核细胞浓集物复合物上加入软骨微粒，得到富血小板血浆/骨髓单核细胞浓集物/软骨微粒复合物；

制凝胶的步骤：将0.5～1ml凝血酶溶液加入上述富血小板血浆/骨髓单核细胞浓集物/软骨微粒复合物，并混匀，室温静置3～5min，形成凝胶，即得软骨再生修复复合物。

进一步地，在预混合的步骤中，若修复软骨缺损面积为scm²，混合后富血小板血浆/骨髓单核细胞浓集物复合物液体总体积为(0.6～0.8)sml。

进一步地，在制凝胶的步骤中，所述凝血酶溶液由1ml生理盐水调配500u的凝血酶冻干粉制得。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明提出了以自体软骨微粒和自体骨髓单核细胞浓集物为种子细胞来源、自体外周血浓集其中的去除白细胞的富血小板血浆为生长因子和生物材料，该复合物能够有效改善软骨损伤部位的愈合微环境，并提供软骨原位再生修复所需的再生要素，诱导原位骨髓间充质干细胞、软骨干细胞等种子干细胞参与损伤修复，从而促进软骨损伤的修复再生。

附图说明

图1为实施例1小型猪膝关节软骨损伤造模及术后8月软骨修复大体图。

图2为实施例1猪膝关节软骨修复术后8月组织学he与so染色图片；

图3为实施例2患者膝关节外侧股骨髁软骨缺损修复前后照片。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

一种一步法软骨再生修复复合物由种子细胞和去除白细胞的富血小板血浆制成；所述种子细胞包括骨髓单核细胞浓集物和软骨微粒。

1.外周血制备浓集去除白细胞的富血小板血浆(p-prp)

所述去除白细胞的富血小板血浆由外周血经离心制备而成，外周血为人体外周血或动物外周血，采自人体外周血应用于人体软骨缺损的修复，采自动物体外周血应用于动物体软骨缺损的修复，优选采自软骨缺损者的自身外周血。所述去除白细胞的富血小板血浆的用量为根据软骨缺损面积每1cm²对应采集外周静脉血量8～12ml。采集过程无菌操作，并避免外周血凝固。外周血在万级洁净制备室内，并在局部百级的超净台或生物安全柜等设备内进行操作。

作为进一步优选方案，所述去除白细胞的富血小板血浆的制备方法如下：采集过程无菌操作，采集外周血；外周血进行第一次离心，去除红细胞，离心力200～250g，时间5～15min；取上层的淡黄色血浆层，丢弃下层红色的红细胞层；淡黄色血浆层继续进行第二次离心，去除白细胞，离心力120～200g，时间3～8min；取上层血浆层，丢弃底部少量白细胞为主的沉淀物；血浆层继续进行第三次离心，浓集富血小板血浆为目的，离心力800～1100g，时间5～10min；取底部血小板及上方的血浆1～5ml，并混匀，即得。

2.骨髓血采集及骨髓单核细胞浓集物制备

骨髓血采集，骨髓血可以采自人体或动物体的骨髓血，采自人体骨髓血应用于人体软骨缺损的修复，采自动物体骨髓血应用于动物体软骨缺损的修复，优选采自软骨缺损者的自身骨髓血。所述骨髓血的用量为根据软骨缺损面积每1cm²对应采集骨髓血量8～12ml。采集过程无菌操作，并避免骨髓血凝固。骨髓血在万级洁净制备室内，并在局部百级的超净台或生物安全柜等设备内进行操作。

作为进一步优选方案，所述骨髓单核细胞浓集物由骨髓血经离心制备而成，所述骨髓单核细胞浓集物的制备方法如下：采集过程无菌操作，采集骨髓血；然后将采集的骨髓血进行第一次离心，去除骨髓血中的红细胞系，离心力350～450g，时间5～15min；取上层液体及细胞，丢弃下层红色的红细胞层；上层液体及细胞继续进行第二次离心，浓集骨髓单核细胞，离心力250～350g，时间5～15min；取底部沉淀的细胞及上方需要体积的液体0.5～1ml，即得。

3.非负重区采集软骨组织及软骨微粒制备

所述软骨微粒取自非负重区健康软骨组织，或创伤引起软骨剥脱及缺损边缘需要修整的健康软骨组织。软骨组织的用量，根据软骨缺损面积scm²，取(0.1-0.25)scm²的软骨组织量,制备成软骨微粒。软骨组织可以采自人体或动物体的软骨组织，采自人体软骨组织应用于人体软骨缺损的修复，采自动物体软骨组织应用于动物体软骨缺损的修复，优选自体软骨组织修复自体的软骨缺损。

作为进一步优选方案，所述软骨微粒由软骨组织经切碎而成，颗粒不大于1mm，生理盐水浸没湿润保护软骨微粒。

该一步法软骨再生修复复合物的制备方法，包括如下步骤：

预混合的步骤：将制备的去除白细胞的富血小板血浆和骨髓单核细胞浓集物轻轻混合，得到富血小板血浆/骨髓单核细胞浓集物复合物；作为进一步优选方案，在预混合的步骤中，若修复软骨缺损面积为scm²，混合后富血小板血浆/骨髓单核细胞浓集物复合物液体总体积为(0.6～0.8)sml。

混合的步骤：在富血小板血浆/骨髓单核细胞浓集物复合物上加入软骨微粒，得到富血小板血浆/骨髓单核细胞浓集物/软骨微粒复合物；

制凝胶的步骤：将0.5～1ml凝血酶溶液加入上述富血小板血浆/骨髓单核细胞浓集物/软骨微粒复合物，并混匀，室温静置3～5min，形成凝胶，即得软骨再生修复复合物。作为进一步优选方案，在制凝胶的步骤中，所述凝血酶溶液由1ml生理盐水调配500u的凝血酶冻干粉制得。最后用无菌手术镊子，夹持凝胶，将其覆盖微骨折术后的软骨缺损面，凝胶上面覆盖生物材料膜。生物材料膜可选择胶原膜，脱细胞基质等生物材料。在修整完软骨缺损面，即可根据缺损形状修剪生物材料膜，使两者相互匹配。采用5-0可吸收缝线，间断缝合固定生物材料膜与周围软骨组织。沿生物材料膜与周围软骨交接处，注射涂抹外科用人纤维蛋白胶，进一步促进生物材料膜的固定。

以下是本发明具体的实施例，在下述实施例中所采用的原材料、设备等除特殊限定外均可以通过购买方式获得。

实施例1小型猪膝关节软骨损伤再生修复

1.小型猪关节软骨损伤造模或寻找现有关节软骨损伤的小型猪：

取体重12.5kg成年雄性巴马小型猪或者取体重12.1kg成年雄性巴马小型猪，其膝关节股骨髁全层软骨缺损直径φ8mm；先用2ml的鹿眠宁肌注麻醉，待猪昏睡时再用3％戊巴比妥钠按照1ml/kg用量通过耳缘静脉注射麻醉。双侧膝关节周围10cm范围剃毛，将猪仰卧在手术手术台上，四肢固定，碘伏消毒，铺无菌洞巾。

2.取耳缘静脉血约12ml，髂骨处取骨髓血约12ml。采集过程无菌操作，抗凝剂为枸橼酸钠，骨髓血与枸橼酸钠的体积比为7:1，外周血与枸橼酸钠的体积比为8:1。血液在空气消毒后的独立实验室内，并在局部百级超净台内进行操作离心管的敞口操作。

3.骨髓血单核细胞浓集物制备。第一次离心，离心力410g，时间8min。取上层液体及细胞，丢弃下层红色的红细胞层。第二次离心，离心力320g，时间10min。取底部沉淀的细胞及上方需要体积的液体0.3ml，备用。

4.外周血去白细胞的富血小板血浆制备。第一次离心，离心力230g，时间10min。取上层的淡黄色血浆层，丢弃下层红色的红细胞层。第二次离心，离心力160g，时间5min。取上层血浆层，丢弃底部少量白细胞为主的沉淀物。第三次离心，血浆层继续离心，离心力1000g，时间8min。取底部血小板及上方的血浆0.7ml，并混匀，备用。

5.暴露膝关节内侧髁软骨面并造模。取膝关节内侧切口，切开皮肤、皮下筋膜，经髌骨内侧缘切开膝关节，向外侧牵开髌腱和股四头肌肌腱，显露膝关节，在膝关节股骨内侧髁软骨面，用骨钻制造一个直径φ8mm的全层软骨缺损区。

6.软骨微粒制备。采用术中直径8cm造模取出软骨组织，取1/4量。软骨组织在手术台旁，在生理盐水湿润保护下，切碎，颗粒小于1mm，备用。

7.微骨折术。软骨缺损处进行改良微骨折器械的微骨折术。改良的微骨折器械为空心管状锐头，将微骨折孔内的骨质取出，不会造成周围挤压。微骨折孔径约1mm，孔间距约4mm。孔深为2～3mm，以孔冒血为准。双侧膝关节内侧髁均进行微骨折术。左腿膝关节仅进行微骨折术后。右腿膝关节微骨折术后，进行软骨修复再生复合物覆盖，并缝合固定胶原膜。

该步骤中的微骨折器械可以采用传统的微骨折器械，也可以采用改良的微骨折器械进行打孔，优选采用改良的微骨折器械；传统的微骨折器械采用实心的圆锥头打孔，软骨下骨向周围挤压形成孔通道，软骨下骨的骨髓血上溢。但是，挤压容易导致周围骨小梁损伤，并不利于骨髓血溢出。改良的微骨折器械为空心管状锐头，将微骨折孔内的骨质取出，不会造成周围挤压，详见申请人之前的专利(一种新型空心钻医用微骨折器械，申请号201510816922.4，授权公告号105286944b)。

关闭手术切口：将脱位的髌骨从膜上方小心归位。严密缝合膝关节囊和肌肉筋膜组织，缝合皮肤切口。切口碘伏消毒。标准动物饲料喂养。

修复效果评估：术后8月，过量麻醉处死小型猪。取材包括股骨下端在内的关节面。如图1所示，图1-a为修复前膝关节股骨髁全层软骨缺损直径φ8mm的照片；图1-b术后8月对照组(单纯微骨折术)软骨修复大体图；图1-c术后8月试验组软骨修复大体图。大体观察发现单纯微骨折术(对照组)的软骨损伤处仍有超过50％软骨面未实现修复。试验组关节软骨缺损为充满新生的白色软骨组织，按压质地与周围正常软骨组织相近。再生修复的组织与周围组织连接平滑，无炎症反应。

如图2所示，为实施例1猪膝关节软骨修复术后8月组织学he与so染色图片。组织学so染色为透明软骨组织的特异性染色，软骨组织为红色。对照组新成部分红色软骨组织，但仍以其他纤维修复为主。试验组关节面形成红色的透明软骨组织，与周围正常软骨组织相近，进一步证明该一步法原位软骨再生修复复合物能促进软骨缺损的修复再生，显著提高微骨折术的疗效。

实施例2人体患者的膝关节软骨再生修复

40岁女性患者，车祸致左膝关节外侧股骨髁软骨缺损伴半月板撕裂。软骨缺损面积约6cm²，患者充分知情后决定性行一步法原位软骨再生修复治疗。

1.自体骨髓血采集及骨髓单核细胞浓集物的制备

术前2小时，采集骨髓血50ml。采集过程无菌操作，并避免骨髓血凝固，抗凝剂为枸橼酸钠，骨髓血与枸橼酸钠的体积比为7:1。骨髓血在万级洁净制备室内，并在局部百级生物安全柜内进行操作离心管的敞口操作。第一次离心，去除骨髓血中的(原)红细胞系为主，离心力410g，时间8min。取上层液体及细胞，丢弃下层红色的红细胞层。第二次离心，浓集骨髓单核细胞为主，离心力320g，时间10min。取底部沉淀的细胞及上方需要体积的液体1ml，备用。

2.自体外周静脉血采集及去除白细胞的富血小板血浆制备

术前2小时采集外周血50ml，抗凝剂枸橼酸钠与血液的体积比1:9。采集过程无菌操作，并摇晃避免外周血凝固。外周血在万级洁净制备室内，并在局部百级的生物安全柜内进行离心管的敞口操作。第一次离心，去除红细胞为目的，离心力230g，时间10min。取上层的淡黄色血浆层，丢弃下层红色的红细胞层。第二次离心，去除白细胞为目的，淡黄色血浆层继续离心，离心力160g，时间5min。取上层血浆层，丢弃底部少量白细胞为主的沉淀物。第三次离心，浓集富血小板血浆为目的，血浆层继续离心，离心力1000g，时间8min。取底部血小板及上方的血浆3ml，并混匀，备用。

3.非负重区采集软骨组织及软骨微粒制备

术中取非负重区健康软骨组织和创伤引起软骨缺损边缘需要修整的健康软骨组织，总量约为缺损面积的17％的软骨组织。软骨组织在手术台旁，在生理盐水湿润保护下，切碎，颗粒小于1mm。

4.改良微骨折术

改良的微骨折器械为空心管状锐头，将微骨折孔内的骨质取出，不会造成周围挤压。微骨折孔约1mm，孔间距约5mm。孔深为8mm，以放开止血带后，孔冒血为准。

5.软骨再生修复复合物的复合制备

手术台旁，需要使用复合物时，将去除白细胞的富血小板血浆3ml和骨髓单核细胞浓集物1ml轻轻混合。然后与软骨微粒混合。1ml生理盐水调配凝血酶冻干粉(500u)，使用约1ml凝血酶轻轻混合上述复合物，静置4min，形成凝胶。将凝胶覆盖在微骨折术后的软骨缺损面，凝胶上面覆盖修剪好的胶原支架膜。

6.胶原蛋白支架膜的固定

在修整完软骨缺损面，即可根据形状修剪胶原支架膜，使两者相互匹配。采用5-0可吸收缝线，间断缝合固定生物材料膜与周围软骨组织，缝合间距约5mm。沿生物材料膜与周围软骨交接处，注射涂抹外科用人纤维蛋白胶约1.2ml，进一步促进生物材料膜的固定。术后进行康复锻炼。术后1年关节镜随访评估。

修复效果评估：如图3所示，图3-o为改良微骨折术后的照片，图3-p为损伤部位覆盖软骨再生修复复合物的照片，图3-q为胶原膜缝合固定的照片，图3-r为术中关节镜照片，图3-s为术后1年关节镜随访的照片，图3-t为术后1年关节镜随访的照片。评估结果显示，术后1年，再生修复的组织与周围组织连接平滑，无炎症反应，证明该一步法原位软骨再生修复复合物能促进软骨缺损的修复再生，显著提高微骨折术的疗效。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。