一种柒香嫩容散发酵原浆化妆品及其制备方法与应用与流程
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种柒香嫩容散发酵原浆化妆品及其制备方法与应用。
背景技术：
当前人们的生活水平不断提高，越来越多的消费者开始重视既对人体健康无害，又具有美容保健作用的天然护肤化妆品。利用中草药提取物作为美容护肤化妆品的添加剂，具有药效稳定持久，既产生功效又没有毒副作用的优势，深受人们的青睐。目前，中草药所含的各种天然活性成分，被广泛应用于现代化妆品中，并发挥各种作用。
柒香嫩容散发酵原浆由古方经典《普济方》中的七香嫩容散改进而来，书中记载选用牵牛子(炒)、白芷、零陵香、甘松、天花粉、茶子、皂荚，研为细末，涂面上，治风刺黑干黑曾。
由朱棣领衔和教授滕硕长史刘醇等编辑而成的普济方一书，广泛搜集明初以前各种医学典籍中的有关方剂，被誉为中国古代最大的一部方书，堪称为集15世纪以前方书编辑之大成。普济方重视辨证论治，从脏腑气血辨治皮肤病，美容方药组成中主要是具有健脾补肾益气养血祛风的药物，如白芷白术川芎熟地肉桂等。书中方药载有具体用量制备及使用方法，对于研发新的美容方药剂型等均有较高的临床指导价值及应用前景。该书美容方药的用药规律:一是以植物药为主；二是多为芳香药及甘润之品，味辛甘，辛香甘润；三是不少药具有抗衰老功能，含维生素类物质，具有营养抗皱之效；四是抗菌；五是石灰及灰类药为消靥痣之专品，对美容药剂的制作开发有一定的参考意义。
本发明根据神七香嫩容散配方制作柒香嫩容散发酵原浆，并经过不断的配方调制，最后《2015版已使用化妆品名录》中可用的原料包括将牵牛子、零陵香、甘松、天花粉、茶籽、皂荚、桃花为原料制得柒香嫩容散发酵原浆。此配方桃花含有山奈酚、香、豆精、三叶豆甙等营养物质，这些物质能扩张血管，润泽肌肤，促进皮肤营养和氧供给，使促进人体衰老的脂褐质素加快排泄，防止黑色素在皮肤内慢性沉积。天花粉古时用本品美容多为外用，如《唐本草》认为本品作粉外用，可使皮肤“洁白美好”，故常在皮肤洗剂中配伍应用。本发明选用牵牛子、零陵香、甘松、天花粉、茶籽、皂荚、桃花复配，经发酵制得柒香嫩容散发酵原浆，在兼具以上中草药所具有功效的同时，发酵过程使产物功效性更加出色。
随着基因工程、细胞工程、酶工程技术的不断发展和完善，微生物发酵技术有了突飞猛进的发展，在天然活性物质的研究开发中发挥着越来越重要的作用。发酵过程所需条件非常温和，而且反应产物单纯和能耗少，是一个与环境友善的绿色化学过程。
北京工商大学理学院的赵丹、许丹妮、王冬冬、张佳婵、李萌、王昌涛在《日用化学工业》杂志2016年04期上发表论文《灵芝发酵液的成分检测及美白与抗衰老功效评价》，文章中提出，为开发灵芝发酵液在化妆品领域的应用，使用葡萄酒酵母发酵灵芝并测定发酵液中所含有的多糖、多酚、黄酮和多肽含量。通过dpph自由基清除实验和羟自由基清除实验对灵芝发酵液的抗氧化能力进行检测，并测定其对成纤维细胞存活率的影响以评估其可能在抗衰老方面发挥的作用。最后通过体外酪氨酸酶实验和小鼠黑色素瘤细胞内的酪氨酸酶活性及黑色素合成抑制实验对灵芝发酵液的美白功效进行评价。结果表明，灵芝发酵液富含多糖，质量浓度为9.910g/l，多酚、黄酮和多肽的质量浓度分别为0.054，0.045和2.931g/l。体积分数分别为25.89％和42.18％的灵芝发酵液可清除50％的dpph自由基和羟自由基；体积分数为0.05％～0.2％范围内的灵芝发酵液可有效促进成纤维细胞增殖；灵芝发酵液对酪氨酸酶活性抑制率高达73.22％，其通过抑制酪氨酸酶活性起到抑制黑色素合成的作用。因此灵芝发酵液具有一定的抗衰老和美白功效。
北京工商大学理学院、中国检验检疫科学研究院化妆品技术中、心云南白药集团医药电子商务有限公司的赵丹、李萌、苏宁、安全、张佳婵、王昌涛在《日用化学品科学》杂志2016年06期上发表论文《枸杞发酵液的抗衰老活性和皮肤安全性研究》，文章中提出，采用枸杞为原料，德氏乳杆菌为菌种进行发酵获得枸杞发酵液。对枸杞发酵液的生理生化性质与成分进行检测，通过自由基清除实验与成纤维细胞增殖实验对枸杞发酵液的抗衰老活性进行检测，利用人体斑贴实验对枸杞发酵液的安全性进行评估。实验结果表明，枸杞发酵液为黏稠弱酸性液体，主要成分是多糖，具有较强的清除dpph自由基和羟自由基的能力，在一定体积分数内可促进成纤维细胞增殖。
北京工商大学理学院、北京工商大学北京食品营养与人类健康高精尖创新中心的许丹妮、史豆豆、赵丹、王昌涛、李萌在《日用化学品科学》杂志2016年12期上发表论文《葡萄籽发酵液抗衰老活性研究》，文章中提出，利用乳酸菌发酵葡萄籽得到葡萄籽发酵液。对发酵液中的主要活性成分进行检测，通过测定自由基清除效果以及成纤维细胞增殖实验来衡量发酵液的抗衰老活性。结果表明葡萄籽发酵液中蛋白质、黄酮、原花青素的含量分别为2.89，1.01，0.43mg/ml。体积分数为0.43％和1.25％的发酵液可清除50％的abts自由基和dpph自由基；发酵液原液对羟自由基的清除率为40％，对铁离子的还原能力表示为2073.43μmoltrolox/l。
北京工商大学理学院/植物资源研究与开发北京市重点实验室、中国检验检疫科学研究院化妆品技术中心、云南白药集团公司的许丹妮、刘平平、苏宁、安全、赵丹、李萌、王昌涛在《湖北农业科学》杂志2017年05期上发表论文《马齿苋发酵液中活性成分含量及化妆品功效研究》，文章中提出，采用紫外分光光度法测定马齿苋(portulacaoleraceal.)发酵液中总糖、黄酮、蛋白质的含量，分析了发酵液对dpph自由基的清除效果，通过测定发酵液对b16细胞中酪氨酸酶活性的抑制效果评价发酵液的美白功效。结果表明，马齿苋发酵液中总糖、黄酮含量分别为3.90、0.59mg/ml；蛋白质含量为55.72±0.83μg/ml。发酵液对dpph自由基的清除效果良好，对b16细胞中酪氨酸酶的活性有抑制作用。
北京工商大学植物资源研究与开发重点实验室、北京食品营养与人类健康高精尖创新中心的赵丹、曹玉峰、丁文玉、王昌涛、史豆豆、虞旦、张佳婵、李萌在《食品与机械》杂志2017年09期上发表论文《玫瑰发酵液的抗氧化及美白功效探究》，文章中提出，通过对玫瑰发酵液的抗氧化和美白功效及皮肤安全性进行评价，探究美白机理。利用酿酒酵母发酵玫瑰获得玫瑰发酵液，检测其对自由基的清除作用以及对酪氨酸酶活性与黑色素合成的影响，利用基因芯片检测其美白机理，采用人体斑贴试验评估其皮肤安全性。结果表明，玫瑰发酵液具有较强的清除dpph自由基能力，对细胞外酪氨酸酶活性的抑制作用与浓度呈正比，对b16细胞内酪氨酸酶活性以及黑色素合成都有一定的抑制作用；玫瑰发酵液能够抑制黑色素瘤通路上游的ngf和fgf2基因表达；人体斑贴试验显示玫瑰发酵液未引起阳性刺激反应。玫瑰发酵液具有较高的皮肤安全性，同时具有抗氧化、抑制酪氨酸酶活性与黑色素生成的功效，其通过抑制ngf和fgf2的表达发挥美白作用。
本发明利用微生物在生长过程中分泌的多种酶对中草药中的活性成分进行提取和修饰，从而获得安全、纯天然的中药护肤品。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种柒香嫩容散发酵原浆。
本发明的另一目的是提供柒香嫩容散发酵原浆的制备方法。
本发明的另一目的是提供柒香嫩容散发酵原浆的检测方法。
本发明的还提供了柒香嫩容散发酵原浆在制备抗衰老、抗氧化、抗氧化化妆品中的用途。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
一种柒香嫩容散发酵原浆，该柒香嫩容散发酵原浆采用如下制备方法制备，步骤如下：
(1)柒香嫩容散干粉的制备：将牵牛子1～2重量份、零陵香1～2重量份、甘松1～2重量份、天花粉1～2重量份、茶籽1～3重量份、皂荚1～3重量份、桃花1～3重量份混合，干燥，粉碎机粉碎，过30～40目筛，得到柒香嫩容散干粉；
(2)柒香嫩容散发酵初始体系的制备：将浓度为(105～108)cfu·ml-1、ph值为6.5～7.5的酵母菌液，与步骤(1)所得的柒香嫩容散干粉和水混合，酵母菌液、柒香嫩容散干粉和水的配比比例为(5～10)ml：(13～20)g：300ml，即得柒香嫩容散发酵初始体系；
(3)柒香嫩容散发酵初原液的制备：在35～45℃下，对步骤(2)所得的柒香嫩容散发酵初始体系进行发酵培养24～30h，得到柒香嫩容散发酵初原液；
(4)柒香嫩容散发酵原浆的制备：将步骤(3)所得的柒香嫩容散发酵初原液在115～121℃下进行灭菌25～35min、然后在离心半径为8～11cm，转速为3800～4200r·min-1条件下，进行离心10～15min，取离心后的上清液，即得到柒香嫩容散发酵原浆。
所述的柒香嫩容散发酵原浆，该柒香嫩容散发酵原浆采用如下制备方法制备，优选的步骤如下：
(1)柒香嫩容散干粉的制备：将牵牛子1重量份、零陵香1重量份、甘松1重量份、天花粉1重量份、茶籽2重量份、皂荚2重量份、桃花2重量份混合，干燥，粉碎机粉碎，过40目筛，得到柒香嫩容散干粉；
(2)柒香嫩容散发酵初始体系的制备：将浓度为107cfu·ml-1、ph值为7.0的酿酒酵母菌液，与步骤(1)所得的柒香嫩容散干粉和水混合，酵母菌液、柒香嫩容散干粉和水的配比比例为8ml：15g：300ml，即得柒香嫩容散发酵初始体系；
(3)柒香嫩容散发酵初原液的制备：在40℃下，对步骤(2)所得的柒香嫩容散发酵初始体系进行发酵培养28h，得到柒香嫩容散发酵初原液；
(4)柒香嫩容散发酵原浆的制备：将步骤(3)所得的柒香嫩容散发酵初原液在118℃下进行灭菌30min、然后在离心半径为9cm，转速为4000r·min-1条件下，进行离心12min，取离心后的上清液，即得到柒香嫩容散发酵原浆。
一种柒香嫩容散发酵原浆的制备方法，该制备方法的步骤如下：
(1)柒香嫩容散干粉的制备：将牵牛子1～2重量份、零陵香1～2重量份、甘松1～2重量份、天花粉1～2重量份、茶籽1～3重量份、皂荚1～3重量份、桃花1～3重量份混合，干燥，粉碎机粉碎，过30～40目筛，得到柒香嫩容散干粉；
(2)柒香嫩容散发酵初始体系的制备：将浓度为(105～108)cfu·ml-1、ph值为6.5～7.5的酵母菌液，与步骤(1)所得的柒香嫩容散干粉和水混合，酵母菌液、柒香嫩容散干粉和水的配比比例为(5～10)ml：(13～20)g：300ml，即得柒香嫩容散发酵初始体系；
(3)柒香嫩容散发酵初原液的制备：在35～45℃下，对步骤(2)所得的柒香嫩容散发酵初始体系进行发酵培养24～30h，得到柒香嫩容散发酵初原液；
(4)柒香嫩容散发酵原浆的制备：将步骤(3)所得的柒香嫩容散发酵初原液在115～121℃下进行灭菌25～35min、然后在离心半径为8～11cm，转速为3800～4200r·min-1条件下，进行离心10～15min，取离心后的上清液，即得到柒香嫩容散发酵原浆。
所述的柒香嫩容散发酵原浆的制备方法，该制备方法优选的步骤如下：
(1)柒香嫩容散干粉的制备：将牵牛子1重量份、零陵香1重量份、甘松1重量份、天花粉1重量份、茶籽2重量份、皂荚2重量份、桃花2重量份混合，干燥，粉碎机粉碎，过40目筛，得到柒香嫩容散干粉；
(2)柒香嫩容散发酵初始体系的制备：将浓度为107cfu·ml-1、ph值为7.0的酿酒酵母菌液，与步骤(1)所得的柒香嫩容散干粉和水混合，酵母菌液、柒香嫩容散干粉和水的配比比例为8ml：15g：300ml，即得柒香嫩容散发酵初始体系；
(3)柒香嫩容散发酵初原液的制备：在40℃下，对步骤(2)所得的柒香嫩容散发酵初始体系进行发酵培养28h，得到柒香嫩容散发酵初原液；
(4)柒香嫩容散发酵原浆的制备：将步骤(3)所得的柒香嫩容散发酵初原液在118℃下进行灭菌30min、然后在离心半径为9cm，转速为4000r·min-1条件下，进行离心12min，取离心后的上清液，即得到柒香嫩容散发酵原浆。
一种柒香嫩容散发酵原浆的检测方法，该柒香嫩容散发酵原浆采用如下制备方法制备，步骤如下：
(1)柒香嫩容散干粉的制备：将牵牛子1～2重量份、零陵香1～2重量份、甘松1～2重量份、天花粉1～2重量份、茶籽1～3重量份、皂荚1～3重量份、桃花1～3重量份混合，干燥，粉碎机粉碎，过30～40目筛，得到柒香嫩容散干粉；
(2)柒香嫩容散发酵初始体系的制备：将浓度为(105～108)cfu·ml-1、ph值为6.5～7.5的酵母菌液，与步骤(1)所得的柒香嫩容散干粉和水混合，酵母菌液、柒香嫩容散干粉和水的配比比例为(5～10)ml：(13～20)g：300ml，即得柒香嫩容散发酵初始体系；
(3)柒香嫩容散发酵初原液的制备：在35～45℃下，对步骤(2)所得的柒香嫩容散发酵初始体系进行发酵培养24～30h，得到柒香嫩容散发酵初原液；
(4)柒香嫩容散发酵原浆的制备：将步骤(3)所得的柒香嫩容散发酵初原液在115～121℃下进行灭菌25～35min、然后在离心半径为8～11cm，转速为3800～4200r·min-1条件下，进行离心10～15min，取离心后的上清液，即得到柒香嫩容散发酵原浆；
采用hplc-elsd法测定柒香嫩容散发酵原浆中12-羟基松香酸甲酯、刺囊酸、皂荚皂苷c的含量，步骤如下：
(1)色谱条件：c18色谱柱，流动相为乙腈-0.2mol·l-1三氟乙酸水溶液，梯度洗脱，洗脱顺序为从0min至15min，乙腈的比例从15％线性上升至30％，0.2mol·l-1三氟乙酸水溶液的比例从85％线性下降至70％；从16min至22min，乙腈的比例从30％线性上升至44％，0.2mol·l-1三氟乙酸水溶液的比例从70％线性下降至56％；从23min至32min，乙腈的比例从44％线性上升至54％，0.2mol·l-1三氟乙酸水溶液的比例从56％线性下降至46％；从33min至50min，乙腈的比例从54％线性上升至81％，0.2mol·l-1三氟乙酸水溶液的比例从46％线性下降至19％；柱温为33～39℃；流速为0.5～1.5ml·min-1；检测器参数为漂移管温度为110～114℃，载气压强为3.0～3.4l·min-1；进样量为5～15μl；
(2)混合对照品溶液的制备：取12-羟基松香酸甲酯、刺囊酸、皂荚皂苷c对照品，精密称定，加体积比为30:70的乙腈-0.2mol·l-1三氟乙酸水溶液制成浓度分别为0.0500～0.0600mg·ml-1、0.3100～0.3300mg·ml-1、0.1800～0.1900mg·ml-1的混合对照品溶液；
(3)供试品溶液的制备：取待测品10.0ml，精密称定，置锥形瓶中，用水饱和正丁醇萃取2～4次，每次为25～35ml，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2～4次，每次为25～35ml，弃去氨试液，正丁醇液浓缩至干，残渣加体积比为30:70的乙腈-0.2mol·l-1三氟乙酸水溶液溶解并定容于10ml容量瓶中，摇匀，即得供试品溶液；
(4)测定：精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各5～15μl，注入高效液相色谱仪，进行测定。
所述的柒香嫩容散发酵原浆的检测方法，该柒香嫩容散发酵原浆采用如下制备方法制备，步骤如下：
(1)柒香嫩容散干粉的制备：将牵牛子1重量份、零陵香1重量份、甘松1重量份、天花粉1重量份、茶籽2重量份、皂荚2重量份、桃花2重量份混合，干燥，粉碎机粉碎，过40目筛，得到柒香嫩容散干粉；
(2)柒香嫩容散发酵初始体系的制备：将浓度为107cfu·ml-1、ph值为7.0的酿酒酵母菌液，与步骤(1)所得的柒香嫩容散干粉和水混合，酵母菌液、柒香嫩容散干粉和水的配比比例为8ml：15g：300ml，即得柒香嫩容散发酵初始体系；
(3)柒香嫩容散发酵初原液的制备：在40℃下，对步骤(2)所得的柒香嫩容散发酵初始体系进行发酵培养28h，得到柒香嫩容散发酵初原液；
(4)柒香嫩容散发酵原浆的制备：将步骤(3)所得的柒香嫩容散发酵初原液在118℃下进行灭菌30min、然后在离心半径为9cm，转速为4000r·min-1条件下，进行离心12min，取离心后的上清液，即得到柒香嫩容散发酵原浆；
采用hplc-elsd法测定柒香嫩容散发酵原浆中12-羟基松香酸甲酯、刺囊酸、皂荚皂苷c的含量，优选的步骤如下：
(1)色谱条件：c18色谱柱，流动相为乙腈-0.2mol·l-1三氟乙酸水溶液，梯度洗脱，洗脱顺序为从0min至15min，乙腈的比例从15％线性上升至30％，0.2mol·l-1三氟乙酸水溶液的比例从85％线性下降至70％；从16min至22min，乙腈的比例从30％线性上升至44％，0.2mol·l-1三氟乙酸水溶液的比例从70％线性下降至56％；从23min至32min，乙腈的比例从44％线性上升至54％，0.2mol·l-1三氟乙酸水溶液的比例从56％线性下降至46％；从33min至50min，乙腈的比例从54％线性上升至81％，0.2mol·l-1三氟乙酸水溶液的比例从46％线性下降至19％；柱温为36℃；流速为1.0ml·min-1；检测器参数为漂移管温度为112℃，载气压强为3.2l·min-1；进样量为10μl；
(2)混合对照品溶液的制备：取12-羟基松香酸甲酯、刺囊酸、皂荚皂苷c对照品，精密称定，加体积比为30:70的乙腈-0.2mol·l-1三氟乙酸水溶液制成浓度分别为0.0550mg·ml-1、0.3200mg·ml-1、0.1850mg·ml-1的混合对照品溶液；
(3)供试品溶液的制备：取待测品10.0ml，精密称定，置锥形瓶中，用水饱和正丁醇萃取3次，每次为30ml，合并正丁醇液，用氨试液洗涤3次，每次为30ml，弃去氨试液，正丁醇液浓缩至干，残渣加体积比为30:70的乙腈-0.2mol·l-1三氟乙酸水溶液溶解并定容于10ml容量瓶中，摇匀，即得供试品溶液；
(4)测定：精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，进行测定。
一种柒香嫩容散发酵原浆制备抗衰老化妆品中的应用，该柒香嫩容散发酵原浆采用如下制备方法制备，步骤如下：
(1)柒香嫩容散干粉的制备：将牵牛子1重量份、零陵香1重量份、甘松1重量份、天花粉1重量份、茶籽2重量份、皂荚2重量份、桃花2重量份混合，干燥，粉碎机粉碎，过40目筛，得到柒香嫩容散干粉；
(2)柒香嫩容散发酵初始体系的制备：将浓度为107cfu·ml-1、ph值为7.0的酿酒酵母菌液，与步骤(1)所得的柒香嫩容散干粉和水混合，酵母菌液、柒香嫩容散干粉和水的配比比例为8ml：15g：300ml，即得柒香嫩容散发酵初始体系；
(3)柒香嫩容散发酵初原液的制备：在40℃下，对步骤(2)所得的柒香嫩容散发酵初始体系进行发酵培养28h，得到柒香嫩容散发酵初原液；
(4)柒香嫩容散发酵原浆的制备：将步骤(3)所得的柒香嫩容散发酵初原液在118℃下进行灭菌30min、然后在离心半径为9cm，转速为4000r·min-1条件下，进行离心12min，取离心后的上清液，即得到柒香嫩容散发酵原浆；
采用hplc-elsd法测定柒香嫩容散发酵原浆中12-羟基松香酸甲酯、刺囊酸、皂荚皂苷c的含量，步骤如下：
(1)色谱条件：c18色谱柱，流动相为乙腈-0.2mol·l-1三氟乙酸水溶液，梯度洗脱，洗脱顺序为从0min至15min，乙腈的比例从15％线性上升至30％，0.2mol·l-1三氟乙酸水溶液的比例从85％线性下降至70％；从16min至22min，乙腈的比例从30％线性上升至44％，0.2mol·l-1三氟乙酸水溶液的比例从70％线性下降至56％；从23min至32min，乙腈的比例从44％线性上升至54％，0.2mol·l-1三氟乙酸水溶液的比例从56％线性下降至46％；从33min至50min，乙腈的比例从54％线性上升至81％，0.2mol·l-1三氟乙酸水溶液的比例从46％线性下降至19％；柱温为36℃；流速为1.0ml·min-1；检测器参数为漂移管温度为112℃，载气压强为3.2l·min-1；进样量为10μl；
(2)混合对照品溶液的制备：取12-羟基松香酸甲酯、刺囊酸、皂荚皂苷c对照品，精密称定，加体积比为30:70的乙腈-0.2mol·l-1三氟乙酸水溶液制成浓度分别为0.0550mg·ml-1、0.3200mg·ml-1、0.1850mg·ml-1的混合对照品溶液；
(3)供试品溶液的制备：取待测品10.0ml，精密称定，置锥形瓶中，用水饱和正丁醇萃取3次，每次为30ml，合并正丁醇液，用氨试液洗涤3次，每次为30ml，弃去氨试液，正丁醇液浓缩至干，残渣加体积比为30:70的乙腈-0.2mol·l-1三氟乙酸水溶液溶解并定容于10ml容量瓶中，摇匀，即得供试品溶液；
(4)测定：精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，进行测定。
一种柒香嫩容散发酵原浆制备治疗瘢痕化妆品中的应用，该柒香嫩容散发酵原浆采用如下制备方法制备，步骤如下：
(1)柒香嫩容散干粉的制备：将牵牛子1重量份、零陵香1重量份、甘松1重量份、天花粉1重量份、茶籽2重量份、皂荚2重量份、桃花2重量份混合，干燥，粉碎机粉碎，过40目筛，得到柒香嫩容散干粉；
(2)柒香嫩容散发酵初始体系的制备：将浓度为107cfu·ml-1、ph值为7.0的酿酒酵母菌液，与步骤(1)所得的柒香嫩容散干粉和水混合，酵母菌液、柒香嫩容散干粉和水的配比比例为8ml：15g：300ml，即得柒香嫩容散发酵初始体系；
(3)柒香嫩容散发酵初原液的制备：在40℃下，对步骤(2)所得的柒香嫩容散发酵初始体系进行发酵培养28h，得到柒香嫩容散发酵初原液；
(4)柒香嫩容散发酵原浆的制备：将步骤(3)所得的柒香嫩容散发酵初原液在118℃下进行灭菌30min、然后在离心半径为9cm，转速为4000r·min-1条件下，进行离心12min，取离心后的上清液，即得到柒香嫩容散发酵原浆；
采用hplc-elsd法测定柒香嫩容散发酵原浆中12-羟基松香酸甲酯、刺囊酸、皂荚皂苷c的含量，步骤如下：
(1)色谱条件：c18色谱柱，流动相为乙腈-0.2mol·l-1三氟乙酸水溶液，梯度洗脱，洗脱顺序为从0min至15min，乙腈的比例从15％线性上升至30％，0.2mol·l-1三氟乙酸水溶液的比例从85％线性下降至70％；从16min至22min，乙腈的比例从30％线性上升至44％，0.2mol·l-1三氟乙酸水溶液的比例从70％线性下降至56％；从23min至32min，乙腈的比例从44％线性上升至54％，0.2mol·l-1三氟乙酸水溶液的比例从56％线性下降至46％；从33min至50min，乙腈的比例从54％线性上升至81％，0.2mol·l-1三氟乙酸水溶液的比例从46％线性下降至19％；柱温为36℃；流速为1.0ml·min-1；检测器参数为漂移管温度为112℃，载气压强为3.2l·min-1；进样量为10μl；
(2)混合对照品溶液的制备：取12-羟基松香酸甲酯、刺囊酸、皂荚皂苷c对照品，精密称定，加体积比为30:70的乙腈-0.2mol·l-1三氟乙酸水溶液制成浓度分别为0.0550mg·ml-1、0.3200mg·ml-1、0.1850mg·ml-1的混合对照品溶液；
(3)供试品溶液的制备：取待测品10.0ml，精密称定，置锥形瓶中，用水饱和正丁醇萃取3次，每次为30ml，合并正丁醇液，用氨试液洗涤3次，每次为30ml，弃去氨试液，正丁醇液浓缩至干，残渣加体积比为30:70的乙腈-0.2mol·l-1三氟乙酸水溶液溶解并定容于10ml容量瓶中，摇匀，即得供试品溶液；
(4)测定：精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，进行测定。
酵母菌为酿酒酵母saccharomycescerevisiae，atcc编号为26603。
实验一：对兔耳增生性瘢痕作用的发酵原浆筛选实验研究
1材料和方法
1.1材料
1.1.1发酵原浆液甲：
(1)干粉的制备：将牵牛子15g、零陵香15g、甘松15g、天花粉15g、茶籽30g、皂荚30g、桃花30g混合，干燥，粉碎机粉碎，过40目筛，得到柒干粉；
(2)发酵初始体系的制备：将浓度为107cfu·ml-1、ph值为7.0的酿酒酵母菌液，与步骤(1)所得的干粉和水混合，酵母菌液、干粉和水的配比比例为8ml：15g：300ml，即得发酵初始体系；
(3)发酵初原液的制备：在40℃下，对步骤(2)所得的发酵初始体系进行发酵培养28h，得到发酵初原液；
(4)发酵原浆的制备：将步骤(3)所得的发酵初原液在118℃下进行灭菌30min、然后在离心半径为9cm，转速为4000r·min-1条件下，进行离心12min，取离心后的上清液，即得到发酵原浆液甲。
1.1.2发酵原浆液乙：
(1)干粉的制备：将牵牛子15g、零陵香15g、甘松15g、天花粉15g、茶籽30g、皂荚30g、桃花30g混合，干燥，粉碎机粉碎，过40目筛，得到干粉；
(2)发酵初始体系的制备：将浓度为107cfu·ml-1、ph值为7.0的植物乳杆菌液，与步骤(1)所得的干粉和水混合，酵母菌液、干粉和水的配比比例为8ml：15g：300ml，即得发酵初始体系；
(3)发酵初原液的制备：在40℃下，对步骤(2)所得的发酵初始体系进行发酵培养28h，得到发酵初原液；
(4)发酵原浆的制备：将步骤(3)所得的发酵初原液在118℃下进行灭菌30min、然后在离心半径为9cm，转速为4000r·min-1条件下，进行离心12min，取离心后的上清液，即得到发酵原浆液乙。
1.1.3发酵原浆液丙：
(1)干粉的制备：将牵牛子15g、零陵香15g、甘松15g、天花粉15g、茶籽30g、皂荚30g、桃花30g混合，干燥，粉碎机粉碎，过40目筛，得到干粉；
(2)发酵初始体系的制备：将浓度为107cfu·ml-1、ph值为7.0的乳酸乳球菌液，与步骤(1)所得的干粉和水混合，酵母菌液、干粉和水的配比比例为8ml：15g：300ml，即得发酵初始体系；
(3)发酵初原液的制备：在40℃下，对步骤(2)所得的发酵初始体系进行发酵培养28h，得到发酵初原液；
(4)发酵原浆的制备：将步骤(3)所得的发酵初原液在118℃下进行灭菌30min、然后在离心半径为9cm，转速为4000r·min-1条件下，进行离心12min，取离心后的上清液，即得到发酵原浆液丙。
1.1.4发酵原浆液丁：
(1)干粉的制备：将牵牛子15g、零陵香15g、甘松15g、天花粉15g、茶籽30g、皂荚30g、桃花30g混合，干燥，粉碎机粉碎，过40目筛，得到干粉；
(2)发酵初始体系的制备：将浓度为107cfu·ml-1、ph值为7.0的嗜酸乳杆菌液，与步骤(1)所得的干粉和水混合，酵母菌液、干粉和水的配比比例为8ml：15g：300ml，即得发酵初始体系；
(3)发酵初原液的制备：在40℃下，对步骤(2)所得的发酵初始体系进行发酵培养28h，得到发酵初原液；
(4)发酵原浆的制备：将步骤(3)所得的发酵初原液在118℃下进行灭菌30min、然后在离心半径为9cm，转速为4000r·min-1条件下，进行离心12min，取离心后的上清液，即得到发酵原浆液丁。
pcr试剂、rt试剂盒、trizolrna提取试剂、转化生长因子β1(tgf-β1)抗体，由北京拜尔迪生物技术有限公司提供；三步法染色试剂盒和dab试剂盒，由北京拜尔迪生物技术有限公司提供；速眠新注射液，由长春军事医学科学院生产。
1.2方法
1.2.1动物模型的建立
健康成年日本大耳白兔20只，体重1.8～2.5kg，雌雄不论，购自北京大学医学部实验动物科学部，许可证号：scxk(京)2016-0010，分笼饲养。实验前适应性喂养1周，温度为(23±1)℃，12h光照，湿度45％，自由进食，单笼饲养，排除饮食及环境等所有可能对实验动物产生的影响。
臀部肌注速眠新注射液(0.2ml/kg)麻醉，常规消毒兔耳腹侧面，在每侧的兔耳腹侧中部沿长轴避开血管做4个边长为1cm的正方形切口，完整切除全层皮肤及软骨膜，保留软骨，其间相距1cm，创面用湿盐水纱布压迫止血、油纱覆盖，其上用弹力胶带固定，每日更换敷料1次，直至其痊愈后形成瘢痕增生块。
1.2.2动物分组及处理
20只日本大耳白兔共制备160个全层皮肤缺损创面，伤后21d创面均上皮化，局部涂抹发酵原浆甲、发酵原浆乙、发酵原浆丙、发酵原浆丁。
造有瘢痕的兔子随机分为6组，其中实验治疗组4组：发酵原浆甲治疗组：给予发酵原浆甲治疗、发酵原浆乙治疗组：给予发酵原浆乙治疗、发酵原浆丙治疗组：给予发酵原浆丙治疗，发酵原浆丁治疗组：给予发酵原浆丁治疗，另外两组分别为：阳性对照组：相同容积的生理盐水对照组、阴性对照组：未处理的瘢痕组，各组4只兔子(32个瘢痕)，均每天涂抹2次，用药10天后(即术后31d)取材、取每组瘢痕数的一半；取材后继续涂抹剩余的瘢痕，均每天涂抹1次，用药11天后(即术后43d)行剩余瘢痕取材。
取材方式：按1.2.1麻醉方式及消毒，切口沿瘢痕边缘位于兔耳正常皮肤与瘢痕交界处，垂直于皮肤表面，深达软骨表面，整个瘢痕组织完整切取。将每个瘢痕平均分成2份，一份用作he及tgf-β1免疫组织化学染色，另一份用作tgf-β1mrna检测(每次等分切取1/2份用来检测)。
1.2.3瘢痕厚度测定
术后32d、43d用彩色超声诊断仪，于同一测定人在相同条件下测定各组创面形成瘢痕的厚度。
1.2.4瘢痕硬度测定
术后32d、43d用瘢痕硬度精密测定仪测定瘢痕硬度：将硬度计垂直放置于待测的瘢痕和皮肤上，靠硬度计本身重量作用于测定部位，根据测定不同瘢痕和皮肤的硬度不同，仪表上即显示不同的数据。每个瘢痕、皮肤分别测定3次，计算平均值，将读数换算成硬度值，单位为n/mm2。
1.2.5瘢痕组织he染色
瘢痕组织标本用4％多聚甲醛固定，石腊包埋，连续5μm厚度切片，常规爬片。做he染色，观察增生性瘢痕的病理表现。
1.2.6tgf-β1免疫组化
切片二甲苯脱腊和梯度酒精脱水，3％过氧化氢阻断过氧化物酶。然后与tgf-β1一抗(1：100)4℃冰箱孵育过夜，滴加适量生物素标记山羊抗鼠igg，37℃孵育20min，磷酸盐缓冲液(pbs)冲洗3×5min，滴加辣根酶标记链霉卵白素，37℃孵育20min，pbs冲洗3×5min，dab显色，自来水充分冲洗，如需要，苏木素复染，脱水，透明，封片。于光镜下观察阳性信号，阳性信号为黄色。在400倍光镜下观察结果，在每张切片的上、中、下、左、右找5个视野进行计数，阳性细胞反应率(r)＝阳性细胞数/细胞总数，结果取均数。
1.3统计学处理
兔耳瘢痕组织学检测数据分析采用spss15.0统计分析软件完成，数据采用均数±标准差表达，采用配对设计的t检验、单因素方差分析，以p<0.05确定差异有显著意义。
2结果
2.1瘢痕组织学观察结果
在术后32d、43d兔耳瘢痕组织发酵原浆甲治疗组瘢痕面积变小，高度变低，质地变软，与发酵原浆乙组、发酵原浆丙组、以及对照组比较，相差十分显著。在he染色法切片上，发酵原浆乙组、发酵原浆丙组、发酵原浆丁组以及对照组的瘢痕组织内大量成纤维细胞、细胞外基质和毛细血管，浅部可见环形或螺旋样分布，组织内少量炎性细胞，发酵原浆甲治疗组瘢痕组织内成纤维细胞明显少于发酵原浆乙组、发酵原浆丙组、发酵原浆丁组以及对照组，表皮层增厚，成纤维细胞排列较规则，细胞外基质多，可见少量毛细血管，在术后43d兔耳瘢痕组织治疗组较术后32d真皮层更薄，成纤维细胞排列较整齐。见说明书附图1、附图2、附图3、附图4、附图5、附图6。
2.2瘢痕厚度测定
在术后32d、43d兔耳瘢痕组织空白对照组、生理盐水组愈合创面厚度接近，明显高于发酵原浆甲组、发酵原浆乙组、发酵原浆丙组、发酵原浆丁组，而发酵原浆乙组、发酵原浆丙组、发酵原浆丁组又高于发酵原浆甲组。且发酵原浆甲组术后43d的愈合创面厚度与术后32d相比有明显的降低，而发酵原浆乙组、发酵原浆丙组与发酵原浆丁组术后43d的愈合创面厚度与术后32d相比没有明显的降低。实验结果见表1。
表1各组瘢痕厚度(mm)
注：与空白对照组比较，*p<0.01，**p<0.05；术后32d与43d配对t检验，#p<0.01
2.3瘢痕硬度测定
在术后32d、43d兔耳瘢痕组织空白对照组、生理盐水组愈合创面硬度接近，明显高于发酵原浆甲组、发酵原浆乙组、发酵原浆丙组、发酵原浆丁组，而发酵原浆乙组、发酵原浆丙组、发酵原浆丁组又高于发酵原浆甲组。且发酵原浆甲组术后43d的愈合创面硬度与术后32d相比有明显的降低，而发酵原浆乙组、发酵原浆丙组发酵原浆丁组与术后43d的愈合创面硬度与术后32d相比没有明显的降低。实验结果见表2。
表2各组瘢痕硬度(n/mm2)
注：与空白对照组比较，*p<0.05，**p<0.01；术后32d与43d配对t检验，#p<0.01
2.4tgf-β1免疫组织化学
在术后32d、43d兔耳瘢痕组织空白对照组、生理盐水组tgf-β1表达明显，黄色为阳性表达，在发酵原浆甲组tgf-β1表达明显下降，发酵原浆乙组与发酵原浆丙组tgf-β1表达有所下降，但不明显。且发酵原浆甲组术后43d的tgf-β1表达比术后32d有明显下降，而发酵原浆乙组与发酵原浆丙组术后43d的tgf-β1表达比术后32d没有明显下降。实验结果见表3。
表3各组tgf-β1表达分析(％)
注：与空白对照组比较及各实验组间比较，*p<0.05；术后32d与43d配对t检验，#p<0.05
3结论
发酵原浆甲的作用效果明显优于发酵原浆乙、发酵原浆丙和发酵原浆丁，说明在特定制备方法下制备的发酵原浆甲具备显著的、预料不到的技术效果。
实验二：hplc-elsd法测定柒香嫩容散发酵原浆中12-羟基松香酸甲酯、刺囊酸、皂荚皂苷c的含量
申请人发明人在研究中发现，在本发明提供的柒香嫩容散发酵原浆中牵牛子中含有的12-羟基松香酸甲酯，以及皂角刺中含有的刺囊酸、皂荚皂苷c，都是本发明柒香嫩容散发酵原浆治疗瘢痕的重要活性成分，所以，申请人发明人对此进行了反复的实验研究，提出并建立了采用hplc-elsd法同时对12-羟基松香酸甲酯、刺囊酸、皂荚皂苷c的含量进行检测的方法，为柒香嫩容散发酵原浆的检测提供实验依据。
1仪器与试药
1.1仪器
shz-d(ⅲ)型循环水式真空泵(上海凌科实业发展有限公司提供)；hh-6型数控恒温水浴锅(宁波新芝生物科技股份有限公司提供)；20-a7型岛津高效液相色谱仪(2000es型elsd检测器)；kh-2200db型数控超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司提供)；电子分析天平(上海丙林电子科技有限公司)。
1.2试药
本发明柒香嫩容散发酵原浆，由上海全丽生物科技有限公司生产，处方和制备方法如下：
(1)柒香嫩容散干粉的制备：将牵牛子15g、零陵香15g、甘松15g、天花粉15g、茶籽30g、皂荚30g、桃花30g混合，干燥，粉碎机粉碎，过40目筛，得到柒香嫩容散干粉；
(2)柒香嫩容散发酵初始体系的制备：将浓度为107cfu·ml-1、ph值为7.0的酿酒酵母菌液，与步骤(1)所得的柒香嫩容散干粉和水混合，酵母菌液、柒香嫩容散干粉和水的配比比例为8ml：15g：300ml，即得柒香嫩容散发酵初始体系；
(3)柒香嫩容散发酵初原液的制备：在40℃下，对步骤(2)所得的柒香嫩容散发酵初始体系进行发酵培养28h，得到柒香嫩容散发酵初原液；
(4)柒香嫩容散发酵原浆的制备：将步骤(3)所得的柒香嫩容散发酵初原液在118℃下进行灭菌30min、然后在离心半径为9cm，转速为4000r·min-1条件下，进行离心12min，取离心后的上清液，即得到柒香嫩容散发酵原浆；
12-羟基松香酸甲酯、刺囊酸、皂荚皂苷c(批号分别为：110745-200617、110703-201128、110754-200822)，乙腈为色谱纯(美国，merck)；三氟乙酸、乙腈为色谱纯(北京化玻站生物分析技术有限公司提供)。
2方法与结果
2.1色谱条件与系统适用性试验
wondasilc18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为乙腈-0.2mol·l-1三氟乙酸水溶液，梯度洗脱，洗脱顺序为从0min至15min，乙腈的比例从15％线性上升至30％，0.2mol·l-1三氟乙酸水溶液的比例从85％线性下降至70％；从16min至22min，乙腈的比例从30％线性上升至44％，0.2mol·l-1三氟乙酸水溶液的比例从70％线性下降至56％；从23min至32min，乙腈的比例从44％线性上升至54％，0.2mol·l-1三氟乙酸水溶液的比例从56％线性下降至46％；从33min至50min，乙腈的比例从54％线性上升至81％，0.2mol·l-1三氟乙酸水溶液的比例从46％线性下降至19％；柱温为36℃；流速为1.0ml·min-1；检测器参数为漂移管温度为112℃，载气压强为3.2l·min-1；进样量为10μl。按上述色谱条件进行测定，12-羟基松香酸甲酯的分离度为7.23、刺囊酸的分离度为7.58、皂荚皂苷c分离度为6.85，分离效果较好。按12-羟基松香酸甲酯、刺囊酸、皂荚皂苷c峰计算理论塔板数均不低于5000。
2.2混合对照品溶液的制备
取12-羟基松香酸甲酯、刺囊酸、皂荚皂苷c对照品，精密称定，加体积比为30:70的乙腈-0.2mol·l-1三氟乙酸水溶液制成浓度分别为0.0550mg·ml-1、0.3200mg·ml-1、0.1850mg·ml-1的混合对照品溶液。
2.3供试品溶液的制备
取柒香嫩容散发酵原浆10.0ml，精密称定，置锥形瓶中，用水饱和正丁醇萃取3次，每次为30ml，合并正丁醇液，用氨试液洗涤3次，每次为30ml，弃去氨试液，正丁醇液浓缩至干，残渣加体积比为30:70的乙腈-0.2mol·l-1三氟乙酸水溶液溶解并定容于10ml容量瓶中，摇匀，即得供试品溶液。
2.4双阴性对照液的制备
按处方量并以相同的工艺分别制备缺牵牛子、黄芩的阴性对照样品，照上述“2.3”方法处理，得双阴性对照溶液。
2.5专属性实验
精密吸取混合对照品、供试品和双阴性对照溶液各10μl，注入液相色谱仪进行测定。结果阴性对照色谱中，在与对照品及供试品色谱图对应保留时间处无相应色谱峰，表明其它组分对该方中12-羟基松香酸甲酯、刺囊酸、皂荚皂苷c的测定无干扰。见说明书附图7、附图8、附图9。
2.6线性关系考察
按以上色谱条件，取上述对照品溶液，分别用自动进样器进5μl、10μl、15μl、20μl、25μl、30μl，测定峰面积值，记录色谱图。以进样量(g)为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，得线性回归方程如下：
12-羟基松香酸甲酯：y＝22368x+156284(r2＝0.9998)；进样量在0.485～1.126μg范围内线性关系良好。
刺囊酸：y＝59852x+465274(r2＝0.9999)；进样量在2.245～5.282μg范围内线性关系良好
皂荚皂苷c：y＝48635x+855452(r2＝0.9998)；进样量在1.355～3.522μg范围内线性关系良好。
2.7精密度试验
精密称取“2.2”项下对照品溶液20μl，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录柒香嫩容散发酵原浆中12-羟基松香酸甲酯、刺囊酸、皂荚皂苷c峰面积，结果12-羟基松香酸甲酯峰面积的rsd％为1.36％、刺囊酸峰面积的rsd％为1.28％、皂荚皂苷c峰面积的rsd％为1.35％。表明该方法的精密度良好。
2.8稳定性试验
取同一种供试品溶液，在制备后分别于0h、2h、4h、8h、16h、32h，注入高效液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件进行测定12-羟基松香酸甲酯、刺囊酸、皂荚皂苷c的峰面积值，12-羟基松香酸甲酯峰面积值的rsd％为1.05％、刺囊酸峰面积值的rsd％为1.46％、皂荚皂苷c峰面积值的rsd％为1.38％，表明12-羟基松香酸甲酯、刺囊酸、皂荚皂苷c在36h内稳定性良好。
2.9重现性试验
取同一批次的柒香嫩容散发酵原浆，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，计算12-羟基松香酸甲酯、刺囊酸、皂荚皂苷c的平均质量分数，12-羟基松香酸甲酯的平均含量为0.095mg·ml-1，rsd％为1.26％；刺囊酸的平均含量为1.565mg·ml-1，rsd％为1.52％；皂荚皂苷c的平均含量为0.045mg·ml-1，rsd％为1.54％。
2.10加样回收率试验
分别取已知含量的柒香嫩容散发酵原浆4.5g(其中12-羟基松香酸甲酯含量为0.095mg·ml-1，刺囊酸含量为1.565mg·ml-1，皂荚皂苷c含量为0.045mg·ml-1)，共6份，精密称定，分别加入的12-羟基松香酸甲酯、刺囊酸、皂荚皂苷c对照品(12-羟基松香酸甲酯、刺囊酸、皂荚皂苷c浓度分别为0.0515mg·ml-1、0.2500mg·ml-1、0.1510mg·ml-1)，照上述供试品溶液的制备方法及色谱条件进行测定，结果显示，12-羟基松香酸甲酯的加样平均回收率为99.37％，rsd％为1.32％，刺囊酸的加样平均回收率为100.18％，rsd％为1.53％，皂荚皂苷c的加样平均回收率为101.95％，rsd％为1.64％。实验结果见表4。
表4加样回收率实验结果(n＝6)
本方法测得12-羟基松香酸甲酯加样回收率平均值为97.49％、刺囊酸加样回收率平均值为99.67％、皂荚皂苷c的加样回收率平均值为101.74％，回收率的rsd％均小于3％，故用该方法测试结果符合定量分析要求。
2.11样品的测定结果
取3批柒香嫩容散发酵原浆样品，照上述供试品溶液制备方法制备，在上述的hplc色谱条件下测定并记录色谱峰面积，经计算，实验结果见表5。
表5样品含量测定结果(mg·ml-1)
3结论
本研究建立了柒香嫩容散发酵原浆中3种成分的含量测定方法，方法稳定可行，专属性高，精密度高，重复性好，其他组分干扰小，回收率高，可用于该制剂的检测。
说明书附图
图1为空白对照组瘢痕组织学观察(400×)
图2为生理盐水组瘢痕组织学观察(400×)
图3为发酵原浆甲组瘢痕组织学观察(400×)
图4为发酵原浆乙组瘢痕组织学观察(400×)
图5为发酵原浆丙组瘢痕组织学观察(400×)
图6为发酵原浆丁组瘢痕组织学观察(400×)
图7为混合对照品溶液hplc图，其中1号峰为12-羟基松香酸甲酯；2号峰为刺囊酸；3号峰为皂荚皂苷c
图8为供试品溶液hplc图，其中1号峰为12-羟基松香酸甲酯；2号峰为刺囊酸；3号峰为皂荚皂苷c
图9为双阴性对照品溶液hplc图。
具体实施方式
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：
柒香嫩容散发酵原浆采用如下制备方法制备，步骤如下：
(1)柒香嫩容散干粉的制备：将牵牛子15g、零陵香15g、甘松15g、天花粉15g、茶籽30g、皂荚30g、桃花30g混合，干燥，粉碎机粉碎，过40目筛，得到柒香嫩容散干粉；
(2)柒香嫩容散发酵初始体系的制备：将浓度为107cfu·ml-1、ph值为7.0的酿酒酵母菌液，与步骤(1)所得的柒香嫩容散干粉和水混合，酵母菌液、柒香嫩容散干粉和水的配比比例为8ml：15g：300ml，即得柒香嫩容散发酵初始体系；
(3)柒香嫩容散发酵初原液的制备：在40℃下，对步骤(2)所得的柒香嫩容散发酵初始体系进行发酵培养28h，得到柒香嫩容散发酵初原液；
(4)柒香嫩容散发酵原浆的制备：将步骤(3)所得的柒香嫩容散发酵初原液在118℃下进行灭菌30min、然后在离心半径为9cm，转速为4000r·min-1条件下，进行离心12min，取离心后的上清液，即得到柒香嫩容散发酵原浆；
采用hplc-elsd法测定柒香嫩容散发酵原浆中12-羟基松香酸甲酯、刺囊酸、皂荚皂苷c的含量，优选的步骤如下：
(1)色谱条件：c18色谱柱，流动相为乙腈-0.2mol·l-1三氟乙酸水溶液，梯度洗脱，洗脱顺序为从0min至15min，乙腈的比例从15％线性上升至30％，0.2mol·l-1三氟乙酸水溶液的比例从85％线性下降至70％；从16min至22min，乙腈的比例从30％线性上升至44％，0.2mol·l-1三氟乙酸水溶液的比例从70％线性下降至56％；从23min至32min，乙腈的比例从44％线性上升至54％，0.2mol·l-1三氟乙酸水溶液的比例从56％线性下降至46％；从33min至50min，乙腈的比例从54％线性上升至81％，0.2mol·l-1三氟乙酸水溶液的比例从46％线性下降至19％；柱温为36℃；流速为1.0ml·min-1；检测器参数为漂移管温度为112℃，载气压强为3.2l·min-1；进样量为10μl；
(2)混合对照品溶液的制备：取12-羟基松香酸甲酯、刺囊酸、皂荚皂苷c对照品，精密称定，加体积比为30:70的乙腈-0.2mol·l-1三氟乙酸水溶液制成浓度分别为0.0550mg·ml-1、0.3200mg·ml-1、0.1850mg·ml-1的混合对照品溶液；
(3)供试品溶液的制备：取待测品10.0ml，精密称定，置锥形瓶中，用水饱和正丁醇萃取3次，每次为30ml，合并正丁醇液，用氨试液洗涤3次，每次为30ml，弃去氨试液，正丁醇液浓缩至干，残渣加体积比为30:70的乙腈-0.2mol·l-1三氟乙酸水溶液溶解并定容于10ml容量瓶中，摇匀，即得供试品溶液；
(4)测定：精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，进行测定；
(5)测定结果：每毫升柒香嫩容散发酵初原液中含12-羟基松香酸甲酯0.097mg，刺囊酸1.568mg，皂荚皂苷c0.049mg。
实施例2：柒香嫩容散发酵原浆在作为化妆品中的应用
将实施例1制备所得的发酵原浆经活性炭脱色、去味。其外观为粘稠液体、颜色为淡黄色至棕黄色。ph值6.3～7.0，粘度190～230cp，可溶性固含物含量3.0～3.5％，菌落总数小于50cfu/ml，无致病菌检出。根据化妆品卫生标准gb7916-87，化妆品细菌总数不高于1000cfu/ml，所以此发酵原浆符合化妆品质量要求。
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