一种基于细胞3D打印的骨-软骨双向功能支架及其制备方法与流程

本发明涉及组织工程领域，更具体地，涉及一种基于细胞3d打印的骨-软骨双向功能支架及其制备方法。

背景技术：

骨组织具有自我修复及再生重建功能，而由于创伤、肿瘤、感染、人口老龄化所引起的骨质疏松等所造成的大面积骨缺损，仅靠骨骼的自我修复能力是有限的，特别是关节软骨，损伤后不能自行愈合。目前临床上常用的治疗方法主要有微骨折术、自体软骨细胞移植和人工关节置换等，这些修复方法各有缺点。组织工程的兴起为软骨缺损修复研究提供了一个新的方向。

快速成型技术又称3d打印技术。低温快速成型制造技术(ldm)是基于快速成型技术原理，结合相分离法的一种新型快速成型技术。目前，有研究者将活性生长因子吸附在ldm打印三维支架上，结果表明活性生长因子会很快缓释，使支架失去长期诱导组织再生能力。利用ldm成型支架过程不需要加热的特点，研究者尝试把活性分子直接和溶液混合后打印，而这会造成活性分子的突释，并且依然难以解决长期稳定释放的问题。

现有的支架（如cn105031718a）一般在成型后还需要烧结或进一步处理，无法植入活细胞，初期需要募集外部细胞定植于支架表面，有很大的不确定性，难以实现关节再生修复。并且，关节损伤一般会出现骨-软骨的联合损伤，现有的支架常用于骨组织修复再生，难以实现骨-软骨组织的联合修复再生。

因此，需要制备一种实现骨-软骨组织联合修复再生的支架。

技术实现要素：

本发明为克服上述现有技术所述的支架功能单一的缺陷，提供一种基于细胞3d打印的骨-软骨双向功能支架的制备方法。该制备方法制得的骨-软骨双向功能支架可以同时实现骨-软骨的联合再生，并且可以实现个性化定制，有利于关节的组织再生，从而能够更好地修复关节损伤。

本发明的另一目的在于提供上述制备方法制得的骨-软骨双向功能支架。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种基于细胞3d打印的骨-软骨双向功能支架的制备方法，包括如下步骤：

s1.分别配制成骨墨水基质和成软骨墨水基质；

s2.向成骨墨水基质中加入骨髓间充质干细胞和柚皮苷，得到成骨墨水；向成软骨墨水基质中加入骨髓间充质干细胞和转化生长因子β，得到成软骨墨水；

s3.分别将成骨墨水和成软骨墨水进行打印，得到支架；所述支架包括成骨侧和成软骨侧；

s4.将支架经过交联处理后，得到骨-软骨双向功能支架。

骨髓间充质干细胞（bmscs）是从骨髓中分离得到，因其取材方便且对机体损伤小，增殖能力强，具有多向分化潜能，bmscs是构建组织工程最常用的细胞，广泛应用于组织缺损的修复。bmscs作为种子细胞具有以下优点：来源广泛，易于取材；易于扩增，体外扩增能力极强；具有独特的分裂形式，可行细胞转染技术使外源基因植入；免疫原性低，植人后可保持良好的生物学活性。bmscs作为最早被应用于骨组织工程的种子细胞，其成骨效果确切，且体外扩增繁殖能力强而被广泛应用。此外，bmscs向软骨细胞分化的潜力确切，被认为是组织工程中用于软骨缺损修复的最理想的种子细胞。bmscs回植至软骨缺损处，可再现胚胎发育时的骨软骨形成过程，且其软骨的形态结构与正常关节软骨十分接近。

转化生长因子β(tgf-β)是一大类生长因子家族，其有促胚胎形成、肿瘤形成、免疫反应等许多生物学作用。bmscs作为种子细胞，向软骨细胞表型分化受多种因素的限制，其中转化生长因子β是bmscs向软骨细胞方向分化所必须的细胞因子。

本发明通过配制含细胞的成骨墨水和成软骨墨水，基于细胞3d打印技术，制备了一种骨-软骨双向功能支架。该骨-软骨双向功能支架具有较好的强度，并无需高温处理，可以将转化生长因子β及活细胞打印于支架内，避免了传统支架生长因子突释和细胞无法定植的难题。所使用的柚皮苷是一种黄酮单体物质，具有化学结构明确、分子量小、提纯方便等特点，具有抗氧化、抗胆固醇、神经保护、抗炎、促骨形成、诱导成骨、抑制骨破坏等作用。本发明提供的骨-软骨双向功能支架是将细胞植入支架内，可以同时实现骨-软骨的联合再生，又实现了个性化定制，有利于关节的组织再生，从而能够更好地修复关节损伤。

优选地，步骤s2.中所述成骨墨水中的柚皮苷的浓度为1×10^-4~1×10^-6mol/l。更优选地，步骤s2.中所述成骨墨水中的柚皮苷的浓度为1×10^-5mol/l。

优选地，步骤s2.中所述骨髓间充质干细胞的浓度为3×10⁶~8×10⁶/ml。更优选地，步骤s2.中所述骨髓间充质干细胞的浓度为5×10⁶/ml。优选地，步骤s2.中所述骨髓间充质干细胞是以骨髓间充质干细胞悬液的形式加入。

优选地，步骤s2.中所述骨髓间充质干细胞悬液与成骨墨水或成软骨墨水的体积比为1∶3~5。

更优选地，步骤s2.中所述骨髓间充质干细胞悬液与成骨墨水或成软骨墨水的体积比为1∶4。

优选地，步骤s2.中所述成软骨墨水中的转化生长因子β的浓度1×10^-8~1×10^-10mol/l。更优选地，步骤s2.中所述成软骨墨水中的转化生长因子β的浓度为1×10^-9mol/l。

优选地，步骤s1.中所述成骨墨水包含无机粉体和生物可降解材料；步骤s1.中所述成软骨墨水包含生物可降解材料。

优选地，步骤s1.中所述无机粉体为介孔生物玻璃粉末、硫酸钙、硅酸三钙、碳酸钙中的一种或几种。更优选地，步骤s1.中所述无机粉体为介孔生物玻璃粉末。

优选地，步骤s1.中所述生物可降解材料为海藻酸钠、明胶、淀粉、琼脂糖、壳聚糖中的一种或几种。更优选地，步骤s1.中所述生物可降解材料为海藻酸钠和明胶。

优选地，步骤s4.中所述交联为化学交联。优选地，步骤s4.中所述化学交联的交联剂为cacl2溶液。优选地，步骤s4.中所述cacl2溶液的浓度为1%~3%。更优选地，步骤s4.中所述cacl2溶液的浓度为1%。将打印出来的成骨侧和成软骨侧放入cacl2溶液中浸泡5分钟，得到骨-软骨双向功能支架。化学交联增加了骨-软骨双向功能支架的强度，并且该支架无需高温处理。

优选地，步骤s1.中所述成骨墨水包括如下质量百分数的组成：介孔生物玻璃粉末5%~15%，海藻酸钠5%~10%，明胶2.5%~5%，余量为水；步骤s1.中所述成软骨墨水包括如下质量百分数的组成：海藻酸钠5%~10%，明胶2.5%~5%，余量为水。成骨墨水和成软骨墨水中，所用水为去离子水。

更优选地，步骤s1.中所述成骨墨水包括如下质量百分数的组成：介孔生物玻璃粉末10%，海藻酸钠5%，明胶5%，余量为水；步骤s1.中所述成软骨墨水包括如下质量百分数的组成：海藻酸钠10%，明胶2.5%，余量为水。

本发明同时保护上述制备方法制得的骨-软骨双向功能支架。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明通过配制含细胞的成骨墨水和成软骨墨水，借助细胞3d打印技术，制备了一种骨-软骨双向功能支架。将细胞植入支架内，可以同时实现骨-软骨的联合再生，又实现了个性化定制，有利于关节的组织再生，从而能够更好地修复关节损伤。

附图说明

图1为本发明制备骨-软骨双向功能支架的流程图。

图2为实施例1制备的骨-软骨双向功能支架的外观图。

图3为实施例1制备的骨-软骨双向功能支架的扫描电镜图。

图4为实施例1制备的骨-软骨双向功能支架的荧光染色实验图。

图5为实施例1制备的骨-软骨双向功能支架的细胞增殖速率图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例中的原料均可通过市售得到；除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1

一种骨-软骨双向功能支架的制备方法，包括如下步骤：

s1.配置成骨墨水基质和成软骨墨水基质，消毒后备用；其中，成骨墨水基质包括如下质量百分数的组成：介孔生物玻璃粉末10%，海藻酸钠5%，明胶5%，余量为水；

成软骨墨水基质包括如下质量百分数的组成：海藻酸钠10%，明胶2.5%，余量为水。

s2.将骨髓间充质干细胞（bmscs）和柚皮苷（naringin）加入成骨墨水基质中，得到成骨墨水；成骨墨水中，bmscs的浓度为5×10⁶/ml，柚皮苷的浓度为1×10^-5mol/l。

将bmscs和转化生长因子β（tgf-β）(1×10^-9mol/l)加入成软骨墨水基质中，得到成软骨墨水。成软骨墨水中，bmscs的浓度为5×10⁶/ml，tgf-β的浓度为1×10^-9mol/l。

含骨髓间充质干细胞的悬液与成骨墨水基质或成软骨墨水基质的体积比为1∶4。

s3.分别将成骨墨水和成软骨墨水分别放入不同的打印料筒中，调整相应的打印参数(成骨侧:气压：0.6mpa喷头直径：0.41mm出丝速度：8mm/s成软骨侧:气压：0.3mpa喷头直径：0.41mm出丝速度：6mm/s)，分层打印，得到由成骨侧和成软骨侧组成的支架。

s4.将支架放入1%的cacl2溶液中浸泡5分钟，得到骨-软骨双向功能支架，培养待用。

实施例2

一种骨-软骨双向功能支架的制备方法，包括如下步骤：

s1.配置成骨墨水基质和成软骨墨水基质，消毒后备用；其中，成骨墨水基质包括如下质量百分数的组成：介孔生物玻璃粉末5%，海藻酸钠10%，明胶2.5%，余量为水；

成软骨墨水基质包括如下质量百分数的组成：海藻酸钠10%，明胶5%，余量为水。

s2.将骨髓间充质干细胞（bmscs）和柚皮苷（naringin）加入成骨墨水基质中，得到成骨墨水；成骨墨水中，bmscs的浓度为5×10⁶/ml，柚皮苷的浓度为1×10^-5mol/l。

将bmscs和转化生长因子β（tgf-β）加入成软骨墨水基质中，得到成软骨墨水。成软骨墨水中，bmscs的浓度为5×10⁶/ml，tgf-β的浓度为1×10^-9mol/l。

含骨髓间充质干细胞的悬液与成骨墨水基质或成软骨墨水基质的体积比为1∶5。

s3.分别将成骨墨水和成软骨墨水分别放入不同的打印料筒中，调整相应的打印参数(成骨侧:气压：0.55mpa喷头直径：0.41mm出丝速度：8mm/s成软骨侧:气压：0.25mpa喷头直径：0.41mm出丝速度：6mm/s)，分层打印，得到由成骨侧和成软骨侧组成的支架。

s4.将支架放入3%的cacl2溶液中浸泡5分钟，得到骨-软骨双向功能支架，培养待用。

实施例3

一种骨-软骨双向功能支架的制备方法，包括如下步骤：

s1.配置成骨墨水基质和成软骨墨水基质，消毒后备用；其中，成骨墨水基质包括如下质量百分数的组成：介孔生物玻璃粉末5%，海藻酸钠10%，明胶2.5%，余量为水；

成软骨墨水基质包括如下质量百分数的组成：海藻酸钠10%，明胶5%，余量为水。

s2.将骨髓间充质干细胞（bmscs）和柚皮苷（naringin）加入成骨墨水基质中，得到成骨墨水；成骨墨水中，bmscs的浓度为5×10⁶/ml，柚皮苷的浓度为1×10^-4mol/l。

将bmscs和转化生长因子β（tgf-β）加入成软骨墨水基质中，得到成软骨墨水。成软骨墨水中，bmscs的浓度为5×10⁶/ml，tgf-β的浓度为1×10^-8mol/l。

含骨髓间充质干细胞的悬液与成骨墨水基质或成软骨墨水基质的体积比为1∶5。

s3.分别将成骨墨水和成软骨墨水分别放入不同的打印料筒中，调整相应的打印参数(成骨侧:气压：0.55mpa喷头直径：0.41mm出丝速度：8mm/s成软骨侧:气压：0.25mpa喷头直径：0.41mm出丝速度：6mm/s)，分层打印，得到由成骨侧和成软骨侧组成的支架。

s4.将支架放入3%的cacl2溶液中浸泡5分钟，得到骨-软骨双向功能支架，培养待用。

实施例4

一种骨-软骨双向功能支架的制备方法，包括如下步骤：

s1.配置成骨墨水基质和成软骨墨水基质，消毒后备用；其中，成骨墨水基质包括如下质量百分数的组成：介孔生物玻璃粉末10%，海藻酸钠5%，明胶5%，余量为水；

成软骨墨水基质包括如下质量百分数的组成：海藻酸钠10%，明胶2.5%，余量为水。

s2.将骨髓间充质干细胞（bmscs）和柚皮苷（naringin）加入成骨墨水基质中，得到成骨墨水；成骨墨水中，bmscs的浓度为5×10⁶/ml，柚皮苷的浓度为1×10^-6mol/l。

将bmscs和转化生长因子β（tgf-β）(1×10^-9mol/l)加入成软骨墨水基质中，得到成软骨墨水。成软骨墨水中，bmscs的浓度为5×10⁶/ml，tgf-β的浓度为1×10^-10mol/l。

含骨髓间充质干细胞的悬液与成骨墨水基质或成软骨墨水基质的体积比为1∶4。

s3.分别将成骨墨水和成软骨墨水分别放入不同的打印料筒中，调整相应的打印参数(成骨侧:气压：0.6mpa喷头直径：0.41mm出丝速度：8mm/s成软骨侧:气压：0.3mpa喷头直径：0.41mm出丝速度：6mm/s)，分层打印，得到由成骨侧和成软骨侧组成的支架。

s4.将支架放入1%的cacl2溶液中浸泡5分钟，得到骨-软骨双向功能支架，培养待用。

骨-软骨双向功能支架的表征及性能测试

1、支架外观

图2为实施例1制备的骨-软骨双向功能支架的外观图。图2显示骨-软骨双向功能支架外形良好，孔隙均匀，具有一定的强度和弹性。

2、扫描电镜（sem）观察

通过扫描电镜（sem）观察本发明制备的骨-软骨双向功能支架的表面结构，实施例1的结果如图3所示。成骨侧和成软骨侧的支架表面结构略有不同，在成骨侧支架表面可以观察到均匀分布的介孔生物玻璃粉末。凹凸不平的支架表面利于细胞定植和粘附，成骨侧介孔生物玻璃的加入有利于骨组织的再生。

3、荧光染色实验：

实验步骤：将本发明打印出来的支架（10mm×3mm）分别铺在48孔板底部（三个重复样），并加入相应的诱导培养基，培养7天待用（每2天换液）；用不含ca²⁺、mg²⁺的pbs，漂洗3次，每次3min；按说明书配置相应的染色试剂，每孔加入100μl的染色试剂，避光孵育30min；去除染色试剂，使用不含ca²⁺、mg²⁺的pbs，漂洗3次，每次3min；使用激光共聚焦显微镜观察细胞活性。

实验结果：calcein-am可透过细胞膜，通过活细胞内的酯酶作用脱去am基团，产生的calcein(钙黄绿素)发出强绿色荧光，因此活细胞在荧光显微镜下可被检测到绿色荧光。另一方面pi可以通过受损的细胞膜进入到死细胞内并嵌入细胞的dna双螺旋从而产生红色荧光，因此死细胞会被检测到红色荧光。

通过荧光染色实验观察支架内部细胞活性，图4为实施例1制备的支架的荧光染色实验图。可以观察到绿色的荧光标记，表明支架内的细胞活性良好。

4、cck-8实验：

实验步骤：将本发明打印出来的支架（5mm×3mm）分别铺在96孔板底部（6个重复样），并加入相应的诱导培养基100μl，分别培养1、3、5、7天待用（每两天换液）；去除原培养基，新鲜培养基与cck-8试剂按照10:1混合，每个孔加入130μl，避光孵育2h；每个孔吸取110μl孵育后的液体加入新的96孔板，酶标仪450nm处测定吸光度值。

实验结果：cck-8试剂中含有wst-8，wst-8的化学名称为：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2h-四唑单钠盐。wst-8在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。

通过cck-8实验测定支架中的细胞增殖速率，图5为实施例1制备的支架的细胞增殖速率图。经过7天后，成骨侧及成软骨侧支架的cck-8数值无明显差异，表明支架内细胞数量未出现明显增殖或凋亡。

由此可知，本发明制备的骨-软骨双向功能支架是可以将细胞植入支架内，同时实现骨-软骨的联合再生，又实现了个性化定制。骨-软骨双向功能支架有利于关节的组织再生，从而能够更好地修复关节损伤。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。