一种人工软骨支架的制备方法和应用与流程

本发明涉及整形材料技术领域，尤其是一种人工软骨支架的制备方法和应用。

背景技术：

目前对于鼻整形修复、耳整形修复、颌骨整形修复等手术所用材料，主要来自合成材料、自体软骨、人工软骨修复材料等；其中之一的合成材料，主要包括硅胶、膨体聚四氟乙烯等，硅胶材料植入后有老化、变性、外露、易移位等不足，而膨体聚四氟乙烯(eptfe)则不耐受感染，一旦感染必须完全去除，给爱美者造成较大伤害；二是自体软骨，如取自爱美者自体的肋软骨、耳软骨等，该类材料没有异物排斥反应，但其来源有限、代价高，术者会受到二次伤害；三是人工软骨修复材料，来源于大型动物组织如牛、猪等，经处理修饰后达到植入使用要求，具有来源广、诱导自体组织长入、可生物降解等优点，但也存在免疫原性去除不彻底，容易发生免疫排异现象。

当前市场急需一种临床效果较好的人工软骨修复材料出现，而异种软骨具有其天然的优势，如能很好地克服其存在的免疫原性，则可很好地应用于临床中。因异种软骨原材料非常致密且软骨细胞分布较多，难以进行彻底去除其异种免疫原性。现有处理技术均存在不足之处，如简单的脱细胞技术去除不够彻底，深冷技术无法完全脱出细胞碎屑。

技术实现要素：

基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种人工软骨支架的制备方法，该方法原材料来源广，经一系列工艺处理后，所得人工软骨支架植入后无免疫原性反应，与机体组织具有很好的生物相容性，且能在体内生物降解，参与自体组织重建，是自体软骨的很好的替代产品。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括：

在第一个方面，本发明提供了一种人工软骨支架的制备方法，包括如下步骤：

(1)预处理：取新鲜的动物软骨组织，洗净、消毒，并去除脂肪组织、纤维和绒毛组织，然后打孔，孔径为30～100微米，孔间距0.5～2.0毫米，孔深度50～200微米，得到打孔后的软骨组织；

(2)脱脂：去除步骤(1)所得软骨组织中的脂肪及脂溶性杂质，得到脱脂后的软骨组织，使得脱脂率为99％以上；

(3)脱细胞：在超声条件下酶解步骤(2)所得软骨组织内细胞，并使用无菌超纯水清洗动物软骨，得到软骨支架；

(4)去除抗原：在ph值7.0～8.0条件下，用活性剂与步骤(3)所得软骨支架反应30～40小时，再加入强氢键试剂，反应30～40小时，得到去除抗原后的软骨；

(5)交联固定：在ph值7.0～8.0、搅拌条件下，用1.0～4.0％(w/w)的非醛类交联剂溶液，与步骤(4)所得去除抗原后的软骨反应2～8天，超声条件下清洗，即得所述人工软骨支架。其中，动物软骨组织来源包括猪或牛的耳软骨、肋间软骨、鼻尖软骨、肩胛软骨。

需要说明的是，动物软骨打孔后，可在其表面形成一定密度圆孔，有利于后续的脱细胞工艺；同时，动物软骨支架植入体内后有利于自体细胞和纤维长入，提高支架植入后的稳定性，避免移位；本发明的人工软骨支架具有120～180°的天然弧度，接近鼻梁和鼻翼的天然弧度，减少临床医生削剪，缩短手术时间。

优选地，所述步骤(2)中软骨组织的脱脂方法为超临界二氧化碳萃取或有机溶剂抽提萃取。

优选地，所述步骤(2)中，脱脂后的软骨组织上残留脂肪质量比为0～0.5％。

优选地，所述步骤(3)中，采用表面活性剂和蛋白酶的混合溶液对步骤(2)所得软骨组织内细胞进行酶解。由此处理后，本发明的人工软骨支架所含有宿主细胞残留在0～5个/显微视野范围内。

优选地，所述表面活性剂为小分子有机酸酐、酰氯、酰胺、环氧化物和卤甲烷中的至少一种。

优选地，所述混合溶液中表面活性剂的终浓度为0.2～0.3％(w/w)，蛋白酶的终浓度0.15～0.25％(w/w)。

优选地，所述步骤(4)中，所述活性剂为小分子有机酸酐、酰氯、酰胺、环氧化物和卤甲烷中的至少一种；所述强氢键试剂为胍类化合物。需要说明的是，去除抗原后，本发明的人工软骨支架所含有宿主的dna含量为0～80ng/mg，α-gal抗原去除率为95～100％。

优选地，所述步骤(5)中，非醛类交联剂为环氧化物、二酰二胺、二异氰酸酯、聚乙二醇和碳化二亚胺试剂中的至少一种。

在第二个方面，本发明提供了上述方法制得的人工软骨。

在第三个方面，本发明提供了上述人工软骨作为整形修复材料的应用。

优选地，所述整形包括耳廓重建，鼻整形，下颌骨整形和面部凹陷部位的充填整形，其中，鼻整形包括鼻中隔、鼻翼、鼻尖重建及整形。由此，本发明的人工软骨支架可应用于包括在鼻翼、鼻尖、鼻中隔、耳廓骨、颌面骨、面部凹陷部位等处植入，植入后软骨支架材料会随着缺损组织的修复而逐渐降解，且降解时间可控，无任何残留毒性，具有较好塑形与支撑作用。

综上所述，本发明的有益效果为：

(1)本发明的人工软骨支架材料具有天然弧度，应用于鼻翼、鼻尖和鼻中骨等处时，可以减少修剪，简化手术过程，缩短手术时间；

(2)本发明的人工软骨支架材料具有特有的韧性和力学强度，具有较好弹性，避免植入后局部塌陷、变形等，具有良好的塑形和支撑作用；

(3)本发明的人工软骨支架材料表面具有一定密度和深度的圆孔，有利于脱细胞、去除抗原等工艺，更彻底的去除免疫原等；同时，孔洞有助于自体组织细胞和纤维的长入，提高支架植入后的稳定性，避免位移；

(4)本发明的人工软骨支架植入后会被体内蛋白酶等水解，与自体组织进行重建；

(5)本发明的人工软骨支架通过交联固定工艺，可以调控支架的生物降解性，可根据不同手术需求，定制不同降解速率的个性化支架产品，降解后无任何残留毒性。

附图说明

图1为软骨组织脱细胞前后的显微镜照片，其中，左图为脱细胞前，右图为脱细胞后。

具体实施方式

本发明涉及人工生物软骨支架材料，取材于动物软骨组织，具有天然软骨的韧性和力学性能，植入后避免局部变形、塌陷；同时，本发明的人工生物软骨支架经打孔工艺处理后，利于软骨内部细胞及细胞碎屑等免疫物质的洗脱，同时支架上具有一定密度的圆孔，有利于自体细胞和纤维长入，能提高支架植入后的稳定性，避免支架外漏和移位。本发明从原材料的获取上进行了精确筛选，选择与自体软骨修复部位解剖结构相接近的材料，同时在免疫原性物质去除技术上进行了改进，并使用组织交联固定技术进行处理，可以保证人工软骨支架材料在体内的长期稳定性，并可根据使用要求进行体内降解时间的控制。

在一些实施例中，本发明的人工软骨支架的制备方法包括预处理、打孔、脱脂、脱细胞、去除抗原、交联固定等步骤，具体的，包括如下步骤：

a.预处理：取新鲜的动物软骨组织，洗净，消毒，并去除脂肪组织、纤维和绒毛组织；

b.打孔：采用机械或激光打孔，孔径为30～100微米，孔间距0.5～2.0毫米、孔深度50～200微米；

c.脱脂：动物组织采用超临界二氧化碳萃取、或有机溶剂抽提萃取方法，去除脂肪及脂溶性杂质，脱脂率达到99％以上，残留脂肪质量比在0～0.5％；

d.脱细胞：使用表面活性剂溶液(小分子有机酸酐、酰氯、酰胺、环氧化物和卤甲烷中一种或两种以上)并结合蛋白酶溶液，控制表面活性剂的质量终浓度为0.2～0.3％，蛋白酶的质量终浓度0.15～0.25％，在超声条件下进行酶解软骨组织内细胞，使用无菌超纯水超声条件下清洗动物软骨；经处理后支架所含有宿主细胞残留在0～5个/显微视野范围内；

e.去除抗原：使用活性剂(小分子有机酸酐、酰氯、酰胺、环氧化物和卤甲烷中一种或两种以上)，在ph值7.0～8.0条件下与动物软骨反应30～40小时，然后用强氢键试剂—胍类化合物，在ph值7.0～8.0条件下与动物软骨反应30～40小时，得到彻底去除抗原后的生物膜材—软骨支架材料；经处理后支架无细胞毒性，支架所含有宿主的dna含量为0～100ng/mg，α-gal抗原去除率为95～100％；

f.交联固定：使用质量浓度为1.0～4.0％的非醛类化学交联剂(环氧化物、二酰二胺、二异氰酸酯、聚乙二醇和碳化二亚胺试剂中的一种或两种以上)溶液，在ph值7.0～8.0搅拌条件下，与经过去除抗原处理后的生物软骨支架反应2～8天，超声条件下清洗，即得本发明的人工生物软骨支架材料。

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

本发明的人工软骨支架的制备方法的一种实施例，包括如下步骤:

a.预处理：取新鲜的动物软骨组织，洗净，消毒，并去除脂肪组织、纤维和绒毛组织；

b.打孔：采用机械打孔，孔径为30微米，孔间距0.5毫米、孔深度50～200微米；

c.脱脂：动物组织采用超临界二氧化碳萃取方法，去除脂肪及脂溶性杂质，脱脂率达到97％，残留脂肪质量比在0.15％；

d.脱细胞：使用表面活性剂—有机酸酐溶液并结合蛋白酶溶液，控制表面活性剂的质量终浓度为0.2％，蛋白酶的质量终浓度0.25％，在超声条件下进行酶解软骨组织内细胞，使用无菌超纯水超声条件下清洗动物软骨；经处理后支架所含有宿主细胞残留在0～5个/显微视野范围内；

e.去除抗原：使用活性剂有机酸酐，在ph值7.0条件下与动物软骨反应40小时，然后用强氢键试剂—胍类化合物，在ph值8.0条件下与动物软骨反应30小时，得到彻底去除抗原后的生物膜材—软骨支架材料；经处理后支架无细胞毒性，支架所含有宿主的dna含量为80ng/mg，α-gal抗原去除率为95.01％；

f.交联固定：使用质量浓度为1.0～4.0％的非醛类化学交联剂—二异氰酸酯溶液，在ph值7.2搅拌条件下，与经过去除抗原处理后的生物软骨支架反应8天，超声条件下清洗，即得本发明的人工生物软骨支架材料。

实施例2

本发明的人工软骨支架的制备方法的一种实施例，包括如下步骤:

a.预处理：取新鲜的动物软骨组织，洗净，消毒，并去除脂肪组织、纤维和绒毛组织；

b.打孔：采用激光打孔，孔径为66微米，孔间距1.2毫米、孔深度50～200微米；

c.脱脂：动物组织采用有机溶剂抽提萃取方法，去除脂肪及脂溶性杂质，脱脂率达到99％，残留脂肪质量比在0.05％；

d.脱细胞：使用表面活性剂溶液(酰氯和酰胺的混合溶液，其中酰氯和酰胺的质量比为1:3)并结合蛋白酶溶液，控制表面活性剂的质量终浓度为0.3％，蛋白酶的质量终浓度0.2％，在超声条件下进行酶解软骨组织内细胞，使用无菌超纯水超声条件下清洗动物软骨；经处理后支架所含有宿主细胞残留在0～5个/显微视野范围内；

e.去除抗原：使用活性剂酰氯，在ph值7.4条件下与动物软骨反应35小时，然后用强氢键试剂—胍类化合物，在ph值7.6条件下与动物软骨反应33小时，得到彻底去除抗原后的生物膜材—软骨支架材料；经处理后支架无细胞毒性，支架所含有宿主的dna含量为50ng/mg，α-gal抗原去除率为97.93％；

f.交联固定：使用质量浓度为1.0～4.0％的非醛类化学交联剂—聚乙二醇溶液，在ph值8.0搅拌条件下，与经过去除抗原处理后的生物软骨支架反应6天，超声条件下清洗，即得本发明的人工生物软骨支架材料。

实施例3

本发明的人工软骨支架的制备方法的一种实施例，包括如下步骤:

a.预处理：取新鲜的动物软骨组织，洗净，消毒，并去除脂肪组织、纤维和绒毛组织；

b.打孔：采用机械打孔，孔径为100微米，孔间距2.0毫米、孔深度50～200微米；

c.脱脂：动物组织采用超临界二氧化碳萃取方法，去除脂肪及脂溶性杂质，脱脂率达到99.5％，残留脂肪质量比在0.025％；

d.脱细胞：使用表面活性剂—卤甲烷溶液并结合蛋白酶溶液，控制表面活性剂的质量终浓度为0.25％，蛋白酶的质量终浓度0.15％，在超声条件下进行酶解软骨组织内细胞，使用无菌超纯水超声条件下清洗动物软骨；经处理后支架所含有宿主细胞残留在0～5个/显微视野范围内；

e.去除抗原：使用活性剂卤甲烷，在ph值8.0条件下与动物软骨反应30小时，然后用强氢键试剂—胍类化合物，在ph值7.0条件下与动物软骨反应30小时，得到彻底去除抗原后的生物膜材—软骨支架材料；经处理后支架无细胞毒性，支架所含有宿主的dna含量为20ng/mg，α-gal抗原去除率为99.75％；

f.交联固定：使用质量浓度为1.0～4.0％的非醛类化学交联剂—碳化二亚胺溶液，在ph值7.0搅拌条件下，与经过去除抗原处理后的生物软骨支架反应2天，超声条件下清洗，即得本发明的人工生物软骨支架材料。

实施例4本发明的人工软骨支架的dna残留量和α-gal抗原去除率

(1)dna残留量测试方法：具体参照yy/t0606.25-2014的荧光染色法方法。

取交联固定步骤前的软骨半成品作为样品(因交联后的终产品不易被酶消化)，称重并记录，剪成尽量小碎片后放入无菌离心管中，加入蛋白酶k溶液于56℃水浴消化完全，至无可见颗粒为止即为完全消化；然后对dna进行纯化，包括加入裂解液，漂洗液，溶出液等，最后对纯化后的dna采用荧光染色法测定含量，取dna标准品坐标准曲线和回收率实验，结果如下表1所示。

表1dna残留量

(2)α-gal抗原检测方法：具体方法参照yy/t1561-2017标准方法(或参照相应elisa试剂盒方法)。

取交联固定步骤前的软骨样品称重并裁剪为小碎块，加入裂解液消化至无可见固态物质存在，然后加入m86抗体孵育(样品中的α-gal抗原与此抗体特异性结合)，然后对剩余的m86抗体量进行检测，结合标准曲线进而推算出样品中与m86抗体结合的α-gal抗原量，通过检测处理前后的样品α-gal抗原含量，计算其去除率，结果如表2所示。

表2α-gal去除率

实施例5本发明的人工软骨支架的韧性测试

韧性测试采用软骨压缩强度表征，具体方法为，将软骨裁剪为长宽10毫米×8毫米，厚度4毫米，然后将材料放置于两压板之间，调整试验机使样品端刚好与压板接触，试验速度为5毫米/分钟，测试其压缩强度。

结果显示，实施例1～3的人工软骨支架的压缩强度依次为12mpa、15mpa、17mpa。其中，据文献资料^[1,2]人鼻软骨压缩弹性模量在1～8mpa。

实施例6本发明的人工软骨支架的弹性测试

弹性测试采用软骨拉伸强度表征，具体方法为，将软骨裁剪为长宽20毫米×4毫米，厚度1～2毫米的哑铃状，然后将材料夹在拉力测试机上，应变速率为10毫米/分钟，测试其拉伸强度。

结果显示，由于样品个体间的差异性，实施例1～3的人工软骨支架最大拉伸应力依次为13mpa、16mpa、17mpa。其中，据文献资料^[1,2]人鼻软骨拉伸弹性模量在4～9mpa。

参考文献：

[1]聂兵,江华.整形外科常用软骨生物力学研究进展[j].医用生物力学,2016,31(2):177-181；

[2]董雷,王盛章,宋建星.鼻部软骨弹性模量的测定[j].组织工程与重建外科,2014(3):152-155。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。