一种菊花总黄酮及其制备方法和应用与流程

本发明涉及天然药物提取技术领域，尤其涉及一种菊花总黄酮及其制备方法和应用。

背景技术：

随着肥胖率急剧增加，肥胖已经成为一个全社会共同关注的营养问题。肥胖与高脂饮食有关，这是由于能量摄入和消耗之间的不平衡，造成体内脂肪的积累引起的，并且与糖尿病、高血压和高脂血症密切相关。高血脂症是由于脂肪代谢或运转异常使血浆一种或多种脂质高于正常，脂质不溶或微溶于水必须与蛋白质结合以脂蛋白形式存在，因此，高脂血症常为高脂蛋白血症，表现为高胆固醇血症、高甘油三醋血症或两者兼有。高血脂会带来很多的危害，此为诱发糖尿病、动脉粥样硬化、冠心病、胆石症等疾病的基础诱因。

目前市场上大部分减肥产品是含有泻药成分，人体失水了肯定可以减轻体重，但会使身体电解质紊乱，导致更为严重的疾病，此外有些减肥产品是让人产生饱腹感，以减少进食量来减肥。但长期不吃或少吃会引起营养不良，从而引发新的疾病。高脂血症的治疗主要采用他汀类、贝特类等化学药物，但这些药物副作用较大。因此从天然植物化学物成分中寻求具有调减肥、降脂作用的物质已成为目前研究的热点之一。

菊花属于药食两用多年生的草本植物，是我国传统中医的常用药材之一。杭白菊，又名甘菊、白菊花、茶菊、药菊不但具有有很高的药用价值，而且还具有延年益寿的功效。《补农书》载：“甘菊性甘温，久服最有益。”，元代《本草衍义补遗》说：“菊花能补阴”，李时珍《本草纲目》道：菊能利五脉，调四肢，治头风热补。菊花的主要成分有挥发油、腺嘿吟、胆碱、水苏碱、菊普及黄酮类化合物。现代药理学研究表明，菊花具有抗氧化、清除自由基、抗炎、抗肿瘤、调节血糖血脂等作用。黄酮类化合物被认为是菊花中主要的活性成分，具有广谱抗炎、抗过敏、清除氧自由基、增加冠脉血流量、抗氧化、降血压等多种生物活性。此外，含有菊花黄酮成分的中成药和单方制剂已在临床广泛应用。

技术实现要素：

本发明为了解决现有降脂、减肥的药物副作用较大问题，提供了一种具有降脂、减肥作用的菊花总黄酮及其制备方法，可有效降低血脂和体重。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种菊花总黄酮的制备方法，包括以下步骤：

(1)将菊花与质量百分比为70～85％的乙醇水溶液混合，水浴，得到提取混合物；

(2)对提取混合物超声后固液分离，得到菊花浸提液；

(3)以大孔吸附树脂对菊花浸提液进行分离纯化，洗脱溶剂为质量百分比20～40％的乙醇水溶液，收集洗脱液，干燥，得到菊花总黄酮。

优选的，步骤(1)中，所述菊花的质量与质量百分比70～85％的乙醇水溶液的体积之比为1g:28～33ml。

优选的，步骤(1)中，所述水浴的温度为65～85℃，水浴的时间为20～25min。

优选的，步骤(2)中，所述超声的功率为150～300w，超声的提取时间为15～35min。

优选的，步骤(2)中，所述固液分离包括离心分离和真空抽滤，将离心分离得到的上清液进行真空抽滤，得到菊花浸提液。

优选的，所述大孔吸附树脂的上样量与柱体积之比为1:8～15。

优选的，所述干燥包括浓缩和热风干燥，所述热风干燥的温度为45～60℃

本发明提供了上述技术方案所述方法制备得到的菊花总黄酮。

本发明提供了上述技术方案所述菊花总黄酮在制备降脂药物中的应用。

本发明提供了前述技术方案所述菊花总黄酮在制备减肥药物中的应用。

本发明取得的有益效果：

本发明提供了一种菊花总黄酮的制备方法，将菊花与质量百分比为70～85％的乙醇水溶液混合，水浴，得到提取混合物；对提取混合物超声后固液分离，得到菊花浸提液；以大孔吸附树脂对菊花浸提液进行分离纯化，洗脱溶剂为质量百分比20～40％的乙醇水溶液，收集洗脱液，干燥，得到菊花总黄酮。本发明利用超声提取法辅助提高有效成分的提取率，制备得到的菊花总黄酮纯度可达到84.5％，菊花总黄酮的提取率可达到5～7％。

本发明实施例的试验表明，采用本发明所述方法制备得到的菊花总黄酮能够降低高脂诱导的大鼠血清tg、tc、ldl-c、nefa水平，升高血清hdl-c水平，降低血脂和体重，提高保护性因子的作用，能通过影响脂代谢相关的酶(lpl)等改善脂代谢紊乱状态，在促进脂类分解等途径上都发挥了显著作用；组织病理形态学上看，菊花总黄酮能减轻高脂引起的肝脏病变，减少肝脏中脂质的积累。因此，菊花黄酮具有明显的减肥和降脂作用。

附图说明

图1为实施例2中不同组别给药后的大鼠肝脏病理切片。

具体实施方式

本发明提供了一种菊花总黄酮的制备方法，包括以下步骤：

(1)将菊花与质量百分比为70～85％的乙醇水溶液混合，水浴，得到提取混合物；

(2)对提取混合物超声后固液分离，得到菊花浸提液；

(3)以大孔吸附树脂对菊花浸提液进行分离纯化，洗脱溶剂为质量百分比20～40％的乙醇水溶液，收集洗脱液，干燥，得到菊花总黄酮。

本发明将菊花与质量百分比为70～85％的乙醇水溶液混合，水浴，得到提取混合物。

在本发明中，所述菊花原料优选的按照以下标准挑选：朵大肥厚，玉白色；花心较大，黄色；气味清香，味微苦；无霜打花、生花、杂质、虫蛀霉变等。在本发明中，用于制备菊花总黄酮的菊花的含水量优选的不超过8％，控制菊花原料的含水量能够延长原料的保质期并增加菊花总黄酮的得率；当菊花原料的含水量高于8％时，本发明优选的采用低温干燥的方式降低菊花原料的含水量，所述低温干燥的干燥温度优选为50～65℃，更优选为55～60℃；所述低温干燥的干燥时间优选为4～6h，更优选为4.5～5.5h。在本发明中，所述菊花原料的含水量优选的采用水分测定仪测定。

在本发明中，所述菊花优选的进行粉碎后再与质量百分比70～85％的乙醇水溶液混合；进一步的，菊花粉碎后的粒度优选为80～200目，更优选为100～150目。本发明对所述粉碎菊花的方式无特殊限定，采用本领域常用的粉碎方式即可，比如粉碎机粉碎。

在本发明中，所述菊花的质量与质量百分比70～85％的乙醇水溶液的体积之比为1g:28～33ml；更优选为1g:30～32ml。本发明优选的采用质量百分比75％的乙醇水溶液进行提取。

在本发明中，所述水浴的温度优选为65～85℃，更优选为70～75℃；所述水浴的时间优选为20～25min，更优选为22～24min。本发明采用水浴的方式辅助加热以加速黄酮提取的过程，提高黄酮的得率。

得到提取混合物后，本发明对提取混合物超声后固液分离，得到菊花浸提液。为了进一步提高菊花总黄酮的提取率，本发明采用超声提取方式进行辅助提取。

在本发明中，所述超声的功率优选为150～300w，更优选为200w；所述超声的提取时间优选为15～35min，更优选为10～25min。

在本发明中，所述固液分离优选包括离心分离和真空抽滤两个步骤，将离心分离得到的上清液进行真空抽滤，得到菊花浸提液。在本发明中，所述离心分离的转速优选为6000～8000r/min；所述离心分离的时间优选为10～12min。在本发明中，所述真空抽滤的真空度优选为0.85～0.95mpa，抽滤的目的是为了进一步去除残留的菊花颗粒。

得到菊花浸提液后，以大孔吸附树脂对菊花浸提液进行分离纯化，洗脱溶剂为质量百分比20～40％的乙醇水溶液，收集洗脱液，干燥，得到菊花总黄酮。

在本发明中，所述大孔吸附树脂优选为ab-8大孔吸附树脂。在本发明中，所述洗脱液优选为质量百分比30％的乙醇水溶液。

在本发明中，所述大孔吸附树脂的上样量与柱体积之比优选为1:8～15，更优选为1:10～12。

在本发明中，所述干燥包括浓缩和热风干燥；本发明通过先浓缩再热风干燥的方式将含有菊花总黄酮的洗脱液中水分完全挥发。在本发明中，所述浓缩优选的将所述洗脱液浓缩至原体积的1/5；浓缩方式优选为旋转蒸发。在本发明中，所述热风干燥的温度优选为45～60℃，更优选为50～55℃；所述干燥至水分完全挥发，即得菊花总黄酮。利用nano2-al(no3)3-naoh比色法测定菊花总黄酮的纯度，可得到84.5％以上，按照本发明所述方法制备菊花总黄酮的提取率在5～7％。

本发明还提供了通过上述技术方案所述制备方法得到的菊花总黄酮。

本发明还提供了上述技术方案所述菊花总黄酮在制备降脂药物中的应用。试验表明，本发明提供的菊花总黄酮降低高脂诱导的大鼠血清tg、tc、ldl-c、nefa水平，升高血清hdl-c水平，提高保护性因子的作用，能通过影响脂代谢相关的酶(lpl)等改善脂代谢紊乱状态，在促进脂类分解等途径上都发挥了显著作用。组织病理形态学上看，本发明提供的菊花总黄酮能减轻高脂引起的肝脏病变，减少肝脏中脂质的积累。

本发明还提供了上述技术方案所述菊花总黄酮在制备减肥药物中的应用，试验表明，服用菊花总黄酮后的高脂大鼠模型体重有显著降低，表明本发明提供的菊花总黄酮具有显著的减肥作用，可用于减肥药物的制备中。

本发明优选的，所述降脂药物或减肥药物中包括本发明制备得到的菊花总黄酮和药学上可接受的药用辅料；所述降脂药物或减肥药物的剂型包括但不限于口服液、片剂、粉剂或胶囊剂；具体剂型的制备和药用辅料的选择按照本领域已知的制剂形式即可。

在本发明中，所述菊花总黄酮作为降脂药物或减肥药物中的有效活性成分，优选的可以作为唯一有效活性成分。在本发明中，所述降脂药物或减肥药物中，菊花总黄酮纯度优选的在75～85％，更优选为80～85％；在本发明中，所述菊花总黄酮的施用量优选为50～100mg/bw·kg·d。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1、材料与方法

1.1、材料与试剂

杭白菊：盐城洋马镇；乙醇；氢氧化钠；亚硝酸钠；硝酸铝；芦丁标准。

1.2、仪器与设备

超声波清洗机；紫外可见分光光度计；万能粉碎机；分析天平；旋转蒸发仪；真空抽滤装置；离心机；干燥箱；恒温水浴锅等。

1.3、实验方法

1.3.1、黄酮提取流程

菊花→烘干→粉碎→过筛→称取→浸泡→超声辅助提取→离心分离→真空抽滤→纯化→旋转蒸发→干燥→菊花总黄酮

1.3.2、操作要点

菊花：选择朵大肥厚，玉白色。花心较大，黄色。气味清香，味微苦。无霜打花、生花、杂质、虫蛀霉变等。

烘干：利用水分测定仪测定菊花原料的初始水分含量，要求水分含量控制在8％以内，如含水量超过8％，采用干燥温度和时间进行干燥：干燥温度为50～65℃，干燥时间4～6h，直至到水分含量达到要求。

粉碎：利用万能粉碎机对干燥后的菊花进行粉碎，粉碎时间5min，粉碎粒度达到200目。

过筛：利用筛分设备对粉碎后菊花进行过筛，筛子的目数为200目。

浸泡：称取的过筛后菊花样品与75％乙醇按照料液比为1g:30ml的比例混合，置于75℃温水浴中浸泡20～25min。

超声辅助提取：超声功率为200w，超声提取时间为20min。

离心分离：离心机转速6000-8000r/min，时间10min，通过离心分离得到上清液。

真空抽滤：对上清液进一步抽滤处理，真空度设置为为0.9mpa。

纯化：采用ab-8大孔吸附树脂对菊花黄酮粗提物进行的分离纯化。在上样量与柱体积之比约为1:10，30％乙醇进行洗脱条件下进行纯化。

旋转蒸发：利用旋转蒸发仪，对纯化后的提取液进行减压浓缩，旋转蒸发的温度为78℃，浓缩后体积变为原来1/5。

干燥：对浓缩液采用热风干燥的方式进行干燥(干燥温度为55℃)，待水分挥发完全后得到菊花总黄酮，利用nano2-al(no3)3-naoh比色法测定菊花总黄酮的纯度，可以达到84.5％，而菊花总黄酮提取率可以达到6％。

实施例2

1、菊花黄酮对高脂诱导的大鼠模型的作用

(1)试验动物及方法

50只雄性sd大鼠(160～190g)在实验前适应性喂养一周后，禁食12～14小时，于晨间断尾取血，测定血清总胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)并称体重。根据tc水平随机分为阴性对照组、高脂模型组、菊花黄酮低剂量组、菊花黄酮中剂量组，菊花黄酮高剂量组5个组，每组10只。阴性对照组饲以基础饲料，其余各组均饲以高脂饲料。

受试物各组分别给予实施例1制备得到的菊花总黄酮25、50、100mg/bw·kg·d灌胃，阴性对照组和高脂模型组给予蒸馏水灌胃。各组动物自由摄食饮水，连续喂养8周。

(2)观察指标

每天观察动物一次，观察动物精神状况、行为、毛色有无异常，每周称量动物体重并记录，了解动物体重增长情况；血脂相关指标：总胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)、低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)、游离脂肪酸(nefa)、脂蛋白脂酶(lpl)；肝脏he病理切片。

2、试验结果

(1)菊花总黄酮对大鼠一般情况的影响

表1菊花总黄酮对大鼠体重(g)的影响(n＝10)

注：a与阴性对照组相比p<0.05；b与高脂模型对照组相比p<0.05

整个实验期间，动物毛色正常，未见行为异常。实验期间每周称量各组大鼠体重，试验开始至第6周，各组体重差异无显著性，第8周时高脂模型组与阴性对照组体重相比有显著差异，受试物中剂量组、高剂量组与高脂模型组有显著差异(p<0.05)，说明菊花总黄酮具有明显的减肥作用，见表1。

(2)菊花总黄酮对大鼠血清tg的影响

自试验第4周起，与阴性对照组比，高脂模型组tg水平显著升高，差异具有显著性，提示造模成功。试验第6周开始，菊花总黄酮受试物各组tg水平均低于高脂模型对照组，中剂量组和高剂量组明显降低(p<0.05)，说明菊花总黄酮具有明显的降脂作用，见表2。

表2菊花总黄酮对大鼠血清tg(mmol/l)的影响(n＝10)

注：a与阴性对照组相比p<0.05；b与高脂模型对照组相比p<0.05

(3)菊花黄酮对大鼠血清tc的影响

自试验第4周起，与阴性对照组比，高脂模型组tc水平显著升高(p<0.05)，提示造模成功。试验第6周开始，菊花总黄酮受试物各组tc水平均显著低于高脂模型组(p<0.05)，说明菊花总黄酮具有明显的降脂作用，见表3。

表3菊花总黄酮对大鼠血清tc(mmol/l)的影响(n＝10)

注：a与阴性对照组相比p<0.05；b与高脂模型对照组相比p<0.05

(4)菊花黄酮对大鼠血清hdl-c的影响

自试验第4周起，与阴性对照组比，hdl-c水平逐渐降低(p<0.05)；第6周时，菊花总黄酮高剂量组hdl-c水平与高脂模型组相比有差异，至试验结束时，菊花总黄酮高剂量组hdl-c水平与高脂模型组相比均有差异(p<0.05)，见表4。hdl将胆固醇从周围组织(包括动脉粥样硬化斑块)转运到肝脏进行再循环或以胆酸的形式排泄，此过程称为胆固醇逆转运，正因为hdl参与胆固醇逆转运，发挥降脂的作用。

表4菊花总黄酮对大鼠血清hdl-c(mmol/l)的影响(n＝10)

注：a与阴性对照组相比p<0.05；b与高脂模型对照组相比p<0.05

(5)菊花黄酮对大鼠血清ldl-c、nefa、lpl的影响

菊花总黄酮各剂量组ldl-c、nefa水平明显低于高脂模型组，lpl活性明显高于高脂模型组，见表5。

ldl由vldl转化而来，是血液中胆固醇含量最多的脂蛋白，单纯高胆固醇血症时，血清胆固醇浓度的升高与血清ldl-c水平呈平行关系。lpl是催化与蛋白质相联的甘油三脂水解作用的酶。它位于毛细管内皮的腔面，在甘油三脂代谢中起着关键的作用。它可将血液中的乳糜微粒和极低密度脂蛋白(vldl)所携带的甘油三脂水解成甘油和脂肪酸，使之转变为小分子量的脂肪酸，以供各种组织贮存和利用。

表5菊花总黄酮对大鼠血清ldl-c、nefa、lpl、apob的影响(n＝10)

注：a与阴性对照组相比p<0.05；b与高脂模型对照组相比p<0.0

(4)菊花黄酮对大鼠肝脏病理组织形态的影响

表6菊花总黄酮对大鼠肝脏病理改变

肝细胞脂肪变性程度分级：“无”表示无明显病变，“轻度”肝小叶内肝细胞脂肪变性数占25％，“中度”表示肝小叶内肝细胞脂肪变性数占50％，“重度”表示肝小叶内肝细胞脂肪变性数占75％或以上。

如图1和表1所示，肝脏病理结果显示，阴性对照组大鼠肝细胞内无脂滴分布，未见脂肪变性及坏死，汇管区无炎细胞浸润，小叶结构完整；高脂模型组大鼠肝细胞均出现脂肪变性，胞浆疏松化，肝小叶及汇管区有炎细胞浸润；低剂量组7例重度脂肪变性，细胞内弥散性空泡状脂滴多而大，肝索排列紊乱；中剂量组4例中度脂肪变性，胞浆内有中等细小脂滴；高剂量组4例轻度脂肪变性，胞浆内脂滴明显减少，肝窦较清晰，肝索排列明显恢复(表6和图1)。

卡方检验结果显示，各组大鼠肝脏发生脂肪变性的例数有差异，高脂模型组与阴性对照组相比差异有显著性(χ²值为18.60，p<0.05)，提示高脂饮食引起了肝脏脂肪变性；与高脂模型组相比，中、高剂量组能显著减轻肝脏脂肪变性(χ²值分别为5.20、9.16，p<0.05)，说明菊花总黄酮具有减轻肝脏脂肪变性的作用。

3、结论

菊花总黄酮能够降低高脂诱导的大鼠血清tg、tc、ldl-c、nefa水平，升高血清hdl-c水平，降低血脂和体重，提高保护性因子的作用，能通过影响脂代谢相关的酶(lpl)等改善脂代谢紊乱状态，在促进脂类分解等途径上都发挥了显著作用；组织病理形态学上看，菊花总黄酮能减轻高脂引起的肝脏病变，减少肝脏中脂质的积累。因此，菊花黄酮具有明显的减肥和降脂作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。