一种模拟白细胞的普朗尼克-脂质纳米杂合递药载体及其应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及肿瘤靶向性的仿生化杂合纳米递药载体，具体涉及一种模拟白细胞的普朗尼克-脂质纳米杂合递药载体及其应用，该递药载体用于递送化疗药物并发挥普朗尼克与仿生化膜的生物学功能，在转移性乳腺癌的综合治疗方面具有其潜在的应用价值。

背景技术：

现有技术公开了乳腺癌已成为目前危害女性健康发病率最高的恶性肿瘤，并成为我国女性第六位恶性肿瘤死亡原因。乳腺癌目前的治疗面临着化疗药物带来的严重毒性、肿瘤细胞自身的耐药性以及乳腺癌细胞高度的浸润转移能力等一系列问题，这对递药系统的设计提出了挑战。

业内知悉，构建递药系统的目的之一是实现载体和药物在肿瘤部位的靶向蓄积。研究显示，肿瘤微环境是影响肿瘤进行生长转移的重要生存环境，其特点之一是免疫细胞的浸润。免疫细胞包括白细胞和t细胞，在肿瘤细胞及内皮细胞等分泌的趋化因子的刺激下，沿着趋化因子浓度梯度定向蓄积到肿瘤组织部位；肿瘤部位的炎症内皮细胞和肿瘤细胞相应地上调了粘附因子如icam-1的表达，粘附因子与免疫细胞膜上的受体如lfa-1特异性结合，使得免疫细胞可以跨越内皮细胞进入肿瘤细微环境，并与粘附因子上调的肿瘤细胞在配体-受体的介导下相互作用；基于此，研究人员关注设计类似免疫细胞的载体，利用其对肿瘤细胞的定向粘附性实现递药载体在肿瘤部位的蓄积。

有研究对纳米粒进行红细胞膜包衣或中性粒膜包衣，延长纳米粒在体内的循环时间，通过肿瘤的高通透性和滞留效应(epr效应)增加纳米粒在肿瘤部位的蓄积几率；或利用细胞膜上的配体作为制剂靶头，实现纳米粒靶向递送到肿瘤部位；另有研究将免疫细胞的膜蛋白和无机材料或磷脂材料相互结合，构成类白细胞的载体，并通过实验验证了仿生化载体在耳朵炎症部位血管的蓄积；以细胞膜为基础的仿生递药载体的设计为肿瘤递药开辟了新思路。

研究人员关注到，微环境也是影响肿瘤细胞转移的重要因素，例如，浸润的巨噬细胞和中性粒细胞是基质金属蛋白酶家族mmps的主要来源；mmps几乎能降解细胞外基质(ecm)中的各种蛋白成分,破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，并影响组织的重塑，促进乳腺癌的浸润、转移和血管生成，在肿瘤侵袭转移中起关键性作用，因此，减少微环境中mmps的量能够抑制肿瘤的转移。

此外，在针对抗肿瘤转移的机制研究中，有研究发现普朗尼克材料中的p85和p123能有效降低乳腺癌细胞系中mmp-9的表达；普朗尼克作为两亲性的大分子生物材料，具有优秀的自组装功能和良好的生物相容性，常以胶束形式作为载体的递送化疗药物，但有报道发现胶束在进入体内后的完整性不佳，80％的胶束在进入体内后解聚，降低了药物的靶向递送效率。

基于现有技术的基础及研究背景，本申请的发明人拟提供提一种模拟白细胞的普朗尼克-脂质纳米杂合递药载体，将天然来源的白细胞膜蛋白整合到人工构建的普朗尼克-脂质杂合膜中。该种仿生化的杂合递药平台能有效地保留白细胞膜蛋白的功能，发挥其与肿瘤细胞粘附因子特异性结合的特点，实现化疗药物靶向递送到肿瘤部位；另外杂合膜中普朗尼克p123发挥mmp-9下调功能，在肿瘤部位高效保护基底膜免受mmp-9的降解作用，避免肿瘤细胞从原位逃逸到远端器官形成转移灶，从而实现对乳腺癌的转移抑制治疗作用。

技术实现要素：

本发明的目的在于基于现有技术的基础及研究背景，设计一种基于仿生学原理设计的模拟白细胞的普朗尼克-脂质纳米杂合递药载体，提供了一种模拟白细胞的普朗尼克-脂质纳米杂合递药载体，本发明以多种人工脂质材料构成膜的主要成分，普朗尼克p123嵌入其中，与多种磷脂成分一起构成杂合膜，同时膜上负载天然的白细胞膜蛋白成分，包载化疗药物紫杉醇，制成模拟白细胞的普朗尼克-脂质纳米杂合递药载体。所述的仿生化杂合递药载体利用白细胞膜蛋白中的黏附因子受体与肿瘤部位特异性结合，实现载体在肿瘤部位的靶向蓄积，精准地发挥化疗药物的肿瘤杀伤作用；另一方面利用杂合膜中普朗尼克p123成分的mmp-9下调作用，保护肿瘤部位的细胞基质免受破坏，防止肿瘤细胞从肿瘤部位逃逸到远端器官形成转移灶，有效地抑制转移的发生。

本发明所采用的模型药物为经典化疗药物紫杉醇(ptx)，通过薄膜分散法将其包载于杂合膜疏水区域中。

本发明所采用的杂合膜，包载化疗药物ptx具有良好的稳定性和较高的包封率。制备方法为薄膜分散法。

本发明通过下述方法的构建模拟白细胞的普朗尼克-脂质纳米杂合递药载体：

①采用薄膜分散法将普朗尼克和磷脂成分共同成膜；②体外培养的小鼠单核巨噬细胞j774a.1细胞系，经过梯度离心获取细胞膜蛋白；③将预先制备的普朗尼克-磷脂杂合膜与巨噬细胞细胞膜蛋白共孵育后，挤出过膜，将膜蛋白融合到杂合膜中形成仿生化杂合纳米载体。

本发明所述杂合膜材料主要成分为一类磷脂酰胆碱结构和胆固醇，添加比例dppc：dspc：dopc：胆固醇为5:1:3:1；另外普朗尼克p123嵌入其中，添加比例为p123：磷脂成分的摩尔比为1:10。

本发明所述仿生化杂合载体负载的白细胞膜蛋白，添加比例为膜蛋白：膜成分的质量比为1:30，采用westernblot的方法表征了膜蛋白上粘附因子受体lfa-1的表达。

本发明所述仿生化杂合载体平均粒径为170-180nm，相比于微米尺度的细胞，其比表面积较大，能更高效地发挥膜结构的作用；同时粒径大小适宜，能在体内通过epr效应蓄积在肿瘤部位。

本发明提供了该药物递释载体的制备方法，并提供了该载体药物递送结果的药效学评价以及制剂本身作用机制的考察结果。

本发明通过采用鼠源转移性乳腺癌细胞系4t1作为模型，评价了仿生化杂合纳米载体在抑制细胞动力、侵袭、迁移以及下调mmp-9表达的效果；考察了仿生化杂合纳米载体在肿瘤细胞和正常巨噬细胞中的摄取效率；原位乳腺癌模型的活体成像结果证明，该载体特异性地靶向递送到肿瘤部位，实现制剂在肿瘤部位的定向蓄积和渗透；体内药效学评价显示，相比于游离药物，载药制剂能够显著提高化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用，抑制原位肿瘤的发展，同时显著抑制远端肺部转移灶的形成；结果表明，所制备的药物递释载体具有良好的药物靶向递送效果，能显著增加药物在肿瘤部位的蓄积和渗透从而提高肿瘤杀伤效力，并且能有效防止肿瘤的转移。

附图说明

图1.仿生化杂合纳米递药载体lpl的表征，其中，

(a)三种纳米递药载体的粒径分布图(a)，粒径(b)和zeta电位(c)，仿生化杂合载体(lpl)的对照组为普通空白脂质体(bl)和普通杂合载体(bpl)；

(b)三种纳米递药载体的透射电镜照片，(a)普通空白脂质体即bl，(b)普通杂合载体即bpl，(c)仿生化杂合载体即lpl。标尺：50nm；

(c)sds-page对总蛋白组成分进行表征。lmp为白细胞膜蛋白(leukocytesmembraneprotein)；

(d)westernblot对粘附因子受体lfa-1的表征结果；

(e)红外光谱对载体的普朗尼克p123和膜蛋白的表征结果，(a)bl，(b)lmp，

(c)p123，(d)bpl，(e)lpl。

图2.仿生化杂合纳米递药载体lpl的细胞摄取评价，其中，

(a)4t1细胞和j774a.1细胞对bl、bpl和lpl的摄取情况；

(b)4t1细胞摄取bl、bpl和lpl4小时后的流式细胞术定量结果；

(c)j774a.1细胞摄取bl、bpl和lpl4小时后的流式细胞术定量结果。

图3.仿生化杂合纳米递药载体lpl的细胞水平抗转移评价，其中，

(a)bl，bpl和lpl对4t1细胞划痕愈合能力的定性及定量结果，

(b)bl，bpl和lpl对4t1细胞侵袭和迁移能力影响的定性及定量结果，

(c)bl，bpl和lpl对4t1细胞mmp-9表达水平的影响。

(d)bl，bpl和lpl对4t1细胞侵袭能力影响的定量结果。

图4.仿生化杂合纳米递药载体lpl的体内分布评价，其中，

(a)24h内bpl和lpl在肿瘤中的分布情况以及24h后两种纳米递药载体在脏器中的分布情况，

(b)24h内bpl和lpl在肿瘤中分布的定量结果，

(c)24h后两种纳米递药载体在脏器中分布情况的定量结果，

(d)24h后bpl和lpl在肿瘤组织中的渗透结果。

图5.仿生化杂合纳米递药载体递送紫杉醇(ptx-lpl)的体内药效评价，其中，

(a)多次给药期间每组肿瘤的生长大小变化趋势，

(b)多次给药后每组肿瘤的平均重量结果，

(c)多次给药后每组荷瘤老鼠的体重变化结果，

(d)多次给药后每组肿瘤的离体照片，

(e)多次给药后每组荷瘤老鼠肺部肿瘤转移率统计结果，

(f)多次给药后每组荷瘤老鼠肺部组织病理切片染色(he染色)结果。

具体实施方式

实施例1：仿生化杂合纳米递药载体lpl的制备及表征

按照5:1:3:1的摩尔比例分别称取dppc、dspc、dopc和胆固醇，用三氯甲烷和甲醇的混合溶剂(三氯甲烷：甲醇体积比例3:1)溶解。同时按照普朗尼克：磷脂1:10的摩尔比例加入p123，在40℃条件下旋转蒸发30min除去残余的溶剂。随后加入1ml磷酸盐缓冲盐(pbs)进行水化，在45℃条件下以120rpm震荡30min，得到泛白色乳光的溶液。此后向溶液中加入提取得到的白细胞膜蛋白，37℃孵育半小时后，用挤出仪对整个溶液体系进行挤出使其通过200nm的聚碳酸酯膜，形成模拟白细胞的普朗尼克-脂质纳米递药载体(lpl)，采用马尔文粒径测定仪测定纳米粒的粒径及zeta电位，透射电子显微镜观察其形态。另外利用sds-page以及westernblot技术对lpl的蛋白组成分以及特定的粘附因子受体进行表征，最后通过红外光谱初步证明膜蛋白和普朗尼克p123在载体上的存在。

结果显示：bl、bpl以及lpl的粒径分别为149.4±2.4nm，152.8±1.9nm和175.4±1.1nm，根据图1b(c)的电镜图显示，仿生化后的杂合载体外有一层20-25nm左右的蛋白膜，其电位和bpl的电位相比下降了5mv左右，另外根据图1(a)和图1(b)的结果显示，与无普朗尼克嵌入的普通脂质膜相比，普朗尼克嵌入脂质后构成的杂合膜粒径、电位和形态未见有显著性地改变，表明普朗尼克的嵌入不影响膜的表面物理性质；

图1的sds-page和westernblot结果显示，仿生化杂合载体的蛋白成分和提取的白细胞膜蛋白成分(lmp)基本保持一致，同时也能检测到粘附因子受体lfa-1的表达，证明了提取的白细胞膜蛋白成功地整合到了杂合膜上；

红外光谱的结果显示了磷脂成分、普朗尼克和膜蛋白的特征峰，如图1(e)所示，磷脂酰胆碱分子中磷酸羰基基团的伸缩震动特征峰位于1736cm^-1，叔氨基的不对称震动特征峰位于970cm^-1；普朗尼克p123大分子中c-o-c长链的特征吸收位于1090cm^-1；蛋白分子中酰胺键的羰基的特征吸收峰有两个，分别在1631cm^-1and1551cm^-1，在杂合载体中可以分别检测到磷脂酰胆碱分子的特征吸收峰和普朗尼克特征吸收峰；而在仿生化的杂合载体中可以检测到三种成分的吸收峰，结果进一步证明杂合载体中普朗尼克的成功嵌合以及膜蛋白的成功融合。

实施例2：仿生化杂合纳米递药载体lpl的细胞摄取评价

方法：将生长至对数期的4t1细胞和j774a.1细胞以5×10⁴个细胞/孔的密度接种于24孔板。待孔内细胞密度长至80％左右，弃去培养基，并加入含有0.2mg/mldid染料标记的bl、bpl和lpl的无血清培养基。孵育1h，2h及4h后，吸去细胞上层培养基，用预冷的pbs润洗细胞表面三次，随后用4％的多聚甲醛室温固定15min，并用荧光显微镜拍摄照片；

用流式细胞术对荧光标记的载体的摄取量进行定量。将生长至对数期的4t1细胞和j774a.1细胞以2×10⁵个细胞/孔的密度接种于6孔板。待孔内细胞密度长至80％左右弃去培养基，并加入含有0.2mg/mldid染料标记的bl、bpl和lpl的无血清培养基。孵育4h后，消化离心收集细胞，并用pbs重悬细胞沉淀用于流式细胞仪的分析检测；

结果如图2(a)所示，在4t1细胞和j774a.1细胞中，随着孵育时间的延长，红色荧光越来越强，即被摄取的纳米载体也越来越多，但当孵育时间相同时，相比与其他纳米载体，仿生化的杂合载体能够更多地被4t1细胞摄入，同时也更少地被j774a.1摄取，说明仿生后的纳米载体显著提高了被肿瘤细胞的摄取效率，同时避免了巨噬细胞的吞噬效应，图2(b)和(c)所示流式定量数据进一步应证了该结果，在孵育四小时后，4t1细胞摄取lpl后的红色荧光强度是摄取bpl后的4倍，而j774a.1细胞摄取bpl后的红色荧光强度是摄取lpl后的2倍，与图2(a)所示定性结果一致。

实施例3：仿生化杂合纳米递药载体lpl的细胞水平抗转移评价

划痕实验：4t1细胞以1×10⁵个细胞/孔的密度接种于12孔板，待孔内细胞密度长至90％左右弃去培养基，并用200μl枪头在培养孔中间划出垂直的划痕，随后用pbs洗去漂浮的细胞碎片，并加入含有0.2mg/ml的bl、bpl和lpl的无血清培养基，共孵育24h。在孵育0h和24h后进行拍照，比较划痕的宽度，计算划痕抑制率；

transwell实验：4t1细胞预先用含有0.2mg/ml的bl、bpl和lpl的完全培养基培养24h后，消化并用含有1％胎牛血清(fbs)的培养基重悬，随后接种于transwell小室上部。在迁移实验中，每小室接种数量为100μl的1×10⁶个细胞/ml细胞悬液。在侵袭实验中，小室上部先铺满基质胶matrigel胶以模仿肿瘤组织中的细胞外基质，随后接种2×10⁵个细胞，小室下部浸没在500μl完全培养基中，接种24h后，小室上部的细胞用棉签擦去，下部细胞用pbs冲洗后，用预冷的甲醇-20℃固定20min，随后用0.5％的结晶紫溶液对下室细胞染色，30min后洗净残留的结晶紫溶液，拍照并记录下室细胞数；

westernblot实验：4t1细胞以1×10⁶个细胞/孔的密度接种于6孔板，待孔内细胞密度长至90％左右，弃去上清培养基，并加入含有0.2mg/mldid染料标记的bl、bpl和lpl的无血清培养基，孵育24h后，每孔细胞用pbs洗净并用含有蛋白酶抑制剂的ripa裂解液进行裂解，破坏细胞膜结构，并对裂解后细胞样品的蛋白量进行测定，每孔样品蛋白定量后，取相同蛋白量的细胞样品用10％的分离胶进行分离，随后转移到聚偏二氟乙烯膜(pvdf)膜上用5％的牛奶。最后封闭后的膜先用mmp-9的一抗在4℃孵育过夜，随后用辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育，完成孵育后，对蛋白条带进行成像拍照；

结果如图3(a)所示，在划痕实验中，用bl、bpl和lpl处理后的细胞划痕愈合程度分别为11.36±3.02％,58.23±4.67％,80.85±2.67％，用lpl处理后的4t1细胞划痕愈合程度最小，而用bl处理的4t1细胞划痕几乎痊愈，证明p123对与细胞动力有非常良好的牵制作用，并且仿生化的设计进一步加强了载体被细胞的摄取，从而提高了p123的作用效率；

图3(b)显示了用lpl处理后的4t1细胞迁移到transwell下室的细胞数目最少，而用bl处理后的4t1细胞与对照组未处理的4t1细胞相比，迁移到transwell下室的细胞数目相近；定量计算得到bl、bpl和lpl对4t1细胞的迁移抑制率为8.99±3.06％,70.15±4.37％和84.70±4.16％；对应侵袭抑制率为0.94±5.36％,58.15±12.07％和90.93±3.87％。这一结果和划痕实验结果一致，p123在纳米载体中的存在有效地降低了4t1细胞的迁移侵袭能力；

westernblot实验对不同纳米载体处理后的4t1细胞中的mmp-9的表达水平进行了评价，如图3(c)所示，用lpl处理后的4t1细胞其mmp-9条带非常浅，定量结果计算mmp-9相对于内参β-action的表达率发现用lpl处理后的mmp-9表达率仅10.31±0.41％，mmp-9作为破坏肿瘤细胞外基质的主要成分，对其进行有效抑制能保护肿瘤细胞外基质的完整性从而避免肿瘤细胞逃逸和转移。因此westernblot实验的结果有力地解释了lpl显著的抑制划痕愈合效果和抑制细胞迁移侵袭效果的原因。

实施例4：仿生化杂合纳米递药载体lpl的体内分布评价

方法：首先用balb/c小白鼠建立原位乳腺癌模型。取对数生长期的4t1细胞用胰酶消化后离心收集，离心后细胞沉淀用pbs清洗细胞两次并计数，将细胞的浓度调整为1×10⁶个细胞/ml，置于冰盒备用，取4-6周的雌性balb/c小白鼠，对其右下腹部进行脱毛，暴露乳腺垫，用注射器吸取100μl肿瘤细胞悬液，从右后肢皮下进针头，待针头到达乳腺垫部位后将注射器内全部细胞悬液推入乳腺垫下方，等待5s后慢慢移出针头，避免带出肿瘤细胞，接种5天后肿瘤体积长至约50mm³进行实验；

考察纳米载体的体内分布情况，将荷瘤小鼠随机分成2组，每组3只，尾静脉注射dir标记的bpl和lpl(dir浓度为0.2mg/kg)，在注射后的1h，2h，4h，8h，12h和24h，用小动物活体成像系统进行荧光成像拍照，注射24h后，麻醉处死荷瘤小鼠，分离主要脏器组织和肿瘤组织并进行离体拍照；

考察纳米载体的肿瘤渗透能力，荷瘤小鼠被随机分成2组，每组3只，尾静脉注射did标记的bpl和lpl(did浓度为0.2mg/kg)，在注射后24h，麻醉处死荷瘤小鼠，分离肿瘤组织进行冷冻切片并染色观察；

结果如图4(a)所示，随着时间的增加，dir标记的lpl和bpl在肿瘤部位的蓄积明显增多，但在8h后lpl处理组明显比相同时间点bpl处理组荷瘤小鼠肿瘤部位的荧光强度更强，图4(b)定量结果显示，在8h，12h和24h，lpl组肿瘤部位荧光强度是bpl组的1.47倍，1.66倍和2.06倍。另外在荷瘤小鼠主要脏器和肿瘤的成像可以发现，lpl组小鼠肝部的荧光强度只有bpl组荧光强度的49.7％，表明lpl在荷瘤小鼠体内可以显著地蓄积于肿瘤部位，具有良好的肿瘤靶向性；同时能够避开包括肝脏在内的网状系统(res系统)的清除作用，延长在体内的循环时间；

图4(c)显示了对24h分离的肿瘤组织进行了冷冻切片染色，蓝色荧光表示细胞核结果，红色荧光表示did标记的lpl或bpl，显示bpl仅分布于肿瘤组织的外周，很少渗透到肿瘤内部，而lpl从外周到肿瘤内部都用大量地分布，表明lpl能有效地渗透到肿瘤组织内部，有利于所载药物发挥药效。

实施例5：仿生化杂合纳米递药载体lpl的体内药效学评价

方法：首先通过薄膜分散法将紫杉醇(ptx)载入纳米载体，构成载药的纳米载体即ptx-bl，ptx-bpl，ptx-lbl(无p123杂合的仿生化载药脂质体)和ptx-lpl。将乳腺癌原位荷瘤裸鼠随机分为6组，每组六只，每两天通过尾静脉注射一次紫杉醇注射剂(taxol)，ptx-bl，ptx-bpl，ptx-lbl和ptx-lpl(ptx10mg/kg)，共给药5次，对照组给予相同体积的pbs，给药过程中，每两天监测一次肿瘤的体积和荷瘤老鼠的体重，给药周期结束后，对每组的老鼠麻醉处死，取出主要脏器进行石蜡切片和he染色，同时取出肿瘤组织进行拍照和称重；

结果如图5(a)的肿瘤体积曲线显示，与游离药相比，所有载药制剂都可以抑制肿瘤组织的生长，但是白细胞仿生化的纳米递药载体lbl和lpl的抑制作用能够最为显著地抑制肿瘤的生长，图5(b)和(d)的肿瘤离体拍照和称重结果也表明，在给药结束后，用仿生化递药载体(ptx-lbl和ptx-lpl)处理后的荷瘤老鼠的肿瘤组织在形态上最小，瘤重最轻，说明经过仿生化设计的递药载体由于其肿瘤靶向性良好，化疗药物能够定向蓄积并进一步渗透到肿瘤组织中，更高效地发挥肿瘤杀伤作用从而显著抑制肿瘤的生长；图5(c)显示每个给药组的荷瘤老鼠体重没有特别显著地变化，证明游离药物的给药剂量对老鼠本身毒性较小，四种纳米载体作为药物递送系统在体内应用相对安全；图5(e)和(f)显示对递药载体抑制肿瘤体内转移作用的初步评价，根据肺部he的切片结果，以健康老鼠的肺部结构为参照，pbs组、ptx组和ptx-bl组的荷瘤老鼠肺部形成非常大面积的转移灶，肺部整体非常致密，肺部组织受到肿瘤的挤压失去原本的空泡结构，相较这三组，lbl组的肺部转移程度有些许好转，可观察到一定的肺泡结构，但肺泡周围仍然浸润了大量的肿瘤细胞，这可能是由于ptx-lbl能有效地杀死原位肿瘤细胞，初步遏制原位细胞向远端的转移；但肿瘤部位的mmp-9仍然高度表达，破坏了细胞外基质，为肿瘤细胞的逃逸仍然提供了机会；bpl组和lpl组的肺部转移情况和其他几组相比有非常显著的缓解，证明普朗尼克p123在体内能够显著抑制肿瘤细胞的转移；lpl的白细胞仿生化行为有利于杂合递药载体更多地蓄积在肿瘤部位，更充分地发挥p123的抗转移效果。

上述结果表明，白细胞仿生化的普朗尼克-磷脂杂合纳米载体ptx-lpl具有较好的安全性，良好的体内肿瘤抑制作用以及最显著的肿瘤转移阻断作用。