本发明属于中药组合技术领域，尤其涉及一种四黄祛痘复方的筛选方法。
背景技术：
痤疮问题已经成为年轻人最大的困扰之一，中医认为痤疮的发病原因可概括为肺热、血热、湿热、风热、风邪外袭、阴虚血淤、阴阳失调、气血不和、胃肠积热、冲任失调等，多属于热症。祛痘古方中应用最多的是三黄敷、三黄散、三黄膏，其中的三黄分别为黄连、黄芩、黄柏，或是黄连、黄柏、大黄。黄连、黄柏、黄芩属于清热药，大黄属于泻下药，四味中药均具有清热、凉血、解毒、泻火的作用，对于人体内部各种热性疾病具有较好的疗效。
现代科学研究表明，痤疮的发病与机体内的雄激素水平过高相关。在人体血液中具有生理活性的雄激素睾酮(t)，在经体内5α-还原酶催化后会产生活性更强的二氢睾酮(dht)。5α-还原酶作为依赖于还原性辅酶ⅱ的膜蛋白酶，其主要功能是将睾酮还原为二氢睾酮。5α-还原酶基因表达过程中，受前列腺和肝脏组织中雄性激素的调节，在几种由内分泌紊乱而引发的疾病中发挥影响，如前列腺增生、多毛症、秃顶等。由于痤疮患者体内的雄性激素水平过高会使皮脂分泌异常，当过度分泌的皮脂集聚在皮肤表面会被空气中的氧气氧化，随之就会为微生物(最主要的是痤疮丙酸杆菌和金黄色葡萄球菌)的繁殖提供合适的生存环境，使其大量繁殖；微生物大量繁殖后产生的脂酶会引起炎症反应，加重皮损症状。
对于痤疮产生机理的分析中可以发现，传统中药材要想达到较好的祛痘效果需要针对痤疮发病的各个阶段都要发挥一定的作用，但传统配方中各类药材的复配比例对祛痘复方的祛痘功效有怎样的影响还没有具体的研究，使得人们对于所使用的中药复方的祛痘功效并没有明确的认识。因此，研究黄连、黄柏、黄芩、大黄的添加量对于四黄复方的祛痘功效的影响就具有了一定的意义。
技术实现要素：
本发明的目的就是为了弥补已有技术的缺陷，提供一种四黄祛痘复方的筛选方法。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
一种四黄祛痘复方的筛选方法，包括以下步骤：
(1)四黄的中草药水提液的制备：将黄连、黄柏、黄芩、大黄四种中草药分别置于电热恒温干燥箱中，40℃下干燥24h，用粉碎机将其分别粉碎，准确称取各类中草药粉末10g装入无纺布袋中，置于干燥的烧杯中，加入100ml水，沸水浴1h，倒出水提液，烧杯中继续加入100ml水，沸水浴1h后取出药包，合并两次水提液，水浴加热浓缩至100ml以下，移入100ml容量瓶中，用水定容至刻度，制得各中草药提取液，原药含量为100mg/ml，再将其稀释得到原药含量分别为50mg/ml和75mg/ml的溶液；
(2)四黄复配水提液的制备：以黄连、黄柏、黄芩、大黄4种中草药水提液作为正交试验的四个因素，分别命名为a、b、c、d；另外分别取4种中草药水提液的不同浓度50mg/ml、75mg/ml、100mg/ml作为因素的三水平，列出筛选实验中的四因素三水平，选取l9(34)正交试验的方法，进行等体积复配，得到由4种中草药的不同浓度的水提液复配的y-1到y-9的9组复配液；
四因素三水平表和正交试验方案见表1和表2：
表1.四因素三水平表
表2.正交试验方案表(3)功效测试：分别对表2中的各组复配液进行dpph·自由基清除率和透明质酸酶抑制率的测定、金黄色葡萄球菌抑菌实验、睾酮转化率测试；
(4)最优组合的筛选：对步骤3测试结果进行分析，由每个指标的测试结果选出一个优质组合，再通过正交试验，根据各自的k值选出一个优质组合，最后通过矩阵计算结合所有的指标计算出一个优化的组合，再将初步选出的组合分别按照步骤3再进行一轮功效测试，通过对实验结果的分析得到一个最优的复配组合。
本发明的优点是：
本发明在祛痘古方三黄敷的基础上，选择黄连、黄柏、黄芩、大黄的中草药水提液作为祛痘功效成分，采用四因素三水平的正交试验方法进行复配，通过现代测试方法分析各复方对dpph·自由基清除能力，对透明质酸酶、5α-还原酶活性的抑制能力及对金黄色葡萄球菌的抑制作用，从抗氧化、抗炎、抑菌、抑制5α-还原酶活性四个方面进行科学的综合比较，确定其最佳的复配比例，为四种中草药各自的添加量对于复方祛痘功效的影响提供了科学的依据，同时由于四黄来源天然，符合现代人安全护肤的理念，相较于市场上的祛痘药物与祛痘化妆品，在应用方面更有优势。本发明为古方今用以及对四黄复配祛痘产品的研发也提供了较好的技术支持。
具体实施方式
以下结合具体的实例对本发明的技术方案做进一步说明：
实施例
所用试剂：黄连、黄柏、黄芩、大黄，购自合肥百姓缘大药房；对-二甲氨基苯甲醛、还原性辅酶ⅱ(nadph，95％)，睾酮(98％)，阿拉丁试剂(上海)有限公司；三羟甲基氨基甲烷(tris，99.9％生物技术级)，考马斯亮蓝g-250(ar，无蛋白酶)，10mg/ml牛血清蛋白标准溶液(分析标准品)，上海麦克林生化科技有限公司；牛肉膏，北京奥博星生物技术有限责任公司；氯化钠、蛋白胨，国药集团化学试剂有限公司；爱普列特(5mg/片，有效成分含量)，江苏联环药业股份有限公司；5α-还原酶提取液，实验室提取，浓度为0.29mg/ml。
一种四黄祛痘复方的筛选方法，包括以下步骤：
(1)四黄的中草药水提液的制备：将黄连、黄柏、黄芩、大黄四种中草药分别置于电热恒温干燥箱中，40℃下干燥24h，用粉碎机将其分别粉碎，准确称取各类中草药粉末10g装入无纺布袋中，置于干燥的烧杯中，加入100ml水，沸水浴1h，倒出水提液，烧杯中继续加入100ml水，沸水浴1h后取出药包，合并两次水提液，水浴加热浓缩至100ml以下，移入100ml容量瓶中，用水定容至刻度，制得各中草药提取液，原药含量为100mg/ml，再将其稀释得到原药含量分别为50mg/ml和75mg/ml的溶液；
(2)四黄复配水提液的制备：以黄连、黄柏、黄芩、大黄4种中草药水提液作为正交试验的四个因素，分别命名为a、b、c、d；另外分别取4种中草药水提液的不同浓度50mg/ml、75mg/ml、100mg/ml作为因素的三水平，列出筛选实验中的四因素三水平，选取l9(34)正交试验的方法，进行等体积复配，得到由4种中草药的不同浓度的水提液复配的y-1到y-9的9组复配液；
四因素三水平表和正交试验方案见表1和表2：
表1.四因素三水平表
表2.正交试验方案表(3)功效测试：分别对表2中的各组复配液进行dpph·自由基清除率和透明质酸酶抑制率的测定、金黄色葡萄球菌抑菌实验、睾酮转化率测试；
(4)最优组合的筛选：对步骤3测试结果进行分析，由每个指标的测试结果选出一个优质组合，再通过正交试验，根据各自的k值选出一个优质组合，最后通过矩阵计算结合所有的指标计算出一个优化的组合，再将初步选出的组合分别按照步骤3再进行一轮功效测试，通过对实验结果的分析得到一个最优的复配组合。
功效测试过程：
1、dpph·自由基清除率的测定
分别取待测样品溶液和物质的量浓度为2.00×10-4mol/l的dpph·乙醇溶液各3ml加入同一具塞试管中，摇匀，避光放置30min后，用紫外-可见分光光度计测定混合溶液在517nm处的吸光度ai，同时测定3ml的纯水与3ml浓度为2.00×10-4mol/l的dpph·乙醇溶液混合后的吸光度a0和3ml待测样品溶液与3ml无水乙醇混合后的吸光度aj，根据式(1)计算清除率p：
p＝[1－(ai－aj)/a0]×100％(1)
2、透明质酸酶抑制率的测定
(1)溶液的配置
醋酸缓冲溶液的配制：分别取113ml0.2mol/l醋酸钠溶液和12ml0.2mol/l的醋酸溶液至250ml容量瓶中，调节ph至5.6，并用蒸馏水定容。
0.5mg/ml透明质酸钠溶液的配制：准确称取透明质酸钠50mg，以醋酸缓冲溶液溶解，定容至100ml容量瓶中。
1mg/ml的透明质酸酶溶液的配制：准确称取透明质酸酶50mg，以醋酸缓冲溶液溶解，定容至50ml容量瓶中。
埃尔利希试剂的配制：准确称取对二甲氨基苯甲醛0.8g，分别加入15ml无水乙醇、15ml浓hcl溶解，得到埃尔利希试剂。
其余溶液的配制仅用水作溶剂。
(2)实验操作
取0.25mmol/l的cacl2溶液0.2ml和1mg/ml透明质酸酶溶液1ml，37℃保温培养20min；加入样品溶液1ml，37℃保温培养20min；加入0.5mg/ml透明质酸钠溶液1ml，37℃保温40min；加入0.4mol/l氢氧化钠溶液0.2ml，冰水浴8min；加入1mg/ml硼酸溶液0.2ml,沸水浴10分钟后立即冰水浴8min终止反应，加入埃尔利希试剂4.0ml，37℃保温放置5min显色，以去离子水作为参比，紫外-可见分光光度计在585nm下测定吸光度。按公式(2)计算透明质酸酶抑制率i：
i＝[1－(c－d)/(a－b)]×100％(2)
式中：a为对照溶液吸光度值(用溶剂代替样品溶液)；b为空白对照溶液吸光度值(用溶剂代替样品溶液，ph＝5.6的醋酸缓冲溶液代替透明质酸酶溶液)；c为样品溶液吸光度值；d为样品对照溶液吸光度值(ph＝5.6的醋酸缓冲溶液代替透明质酸酶溶液)。
3、金黄色葡萄球菌抑制实验
(1)溶液的配制
牛肉膏蛋白胨培养基(液体)：于1000ml烧杯中，称取牛肉膏3g，氯化钠5g，蛋白胨5g，加入水950ml，于电炉上加热溶解，随之将其冷却，定容至1000ml(ph于7.2-7.4之间)，再将其分装于10支规格为250ml三角瓶内，用牛皮纸包扎。
菌种及菌液制备：金黄色葡萄球菌4℃冷藏，菌种接种于50ml的液体牛肉膏蛋白胨培养基中，37℃培养24h活化，冰箱冷藏。
抑菌四黄复方的筛选：将菌液用液体培养基稀释为104cfu/ml，取灭菌ep管9支，每支管中加入1ml液体培养基，再分别向管中加入复配液y-1至y-9各1ml，充分混合后，37℃下进行培养。
实验所需的对照组包括接种了同数量的菌液且不加抗菌药的培养物对照和不接种菌液也不加抗菌药的培养基对照。当培养物对照中的颜色变成了桔黄色，而培养基对照没有发生颜色变化时，记下发生颜色变化的管数，以此来筛选出具有抑菌作用的中草药复配液。
将培养基放置37℃下培养3天，持续观察颜色变化，得到具有抑菌能力的复配组合。
4、睾酮转化率的测定
(1)色谱条件
色谱柱：waterssunfiretmc18柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相：甲醇-水(70:30，v/v)，双泵；检测波长：242nm；流速：1.0ml/min，进样量20.00μl，柱温30℃。
(2)反应物溶液及阳性对照药系列浓度的配制
以甲醇为溶剂配制1.0mg/ml的睾酮溶液，以0.1mol/ltris缓冲液为溶剂配制4.25mg/ml的nadph溶液。
阳性对照药系列浓度的配制：取25片爱普列特片放入研钵中，充分研磨至粉末后倒入烧杯中。加适量甲醇(50％)充分溶解，转入25ml容量瓶中，定容，摇匀得浓度为5mg/ml的爱普列特溶液，再将其稀释后分别得到0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/ml系列浓度的阳性对照液。
(3)睾酮标准曲线的制备
准确移取1.0mg/ml的睾酮溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8ml于5ml的容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀静置待用。按4(1)中色谱条件进样，保留时间t＝10.3min。以睾酮含量为x，峰面积为y，绘制标准曲线，计算得其标准曲线方程为y＝7.50×104x－88.5(r＝0.999)。
(4)反应体系的建立
将睾酮、nadph溶液、5α-还原酶提取液、爱普列特溶液、tris缓冲液、中草药水提液按表3中组合依次加入反应体系，分别设为阳性对照组、空白对照组、反应组，放入温度为37℃的恒温培养箱中反应。
表3体外反应体系(5)睾酮转化率的测定
表3的体外反应进行1h后，将反应液从恒温培养箱中取出，加入2ml的甲醇，终止反应。将反应体系充分摇匀，以4000r/min离心2min，取上清液。用微孔有机滤膜(0.45um)过滤上清液，将过滤后的反应液进样。用高效液相色谱仪检测反应后的溶液，将睾酮的峰面积代入睾酮标准曲线中，算出未反应的睾酮的含量x1，睾酮的原始含量为x0，根据公式计算出睾酮转化率t。
t＝(1-x1/x0)×100％(3)
测试结果分析：
对于痤疮产生机理的分析中可以发现，四黄复方要想达到较好的祛痘效果需要针对痤疮发病的各个阶段都要发挥一定的作用，其中就包括抑制5α-还原酶活性来减少睾酮的转化率、预防皮脂氧化、抑制金黄色葡萄球菌的大量繁殖以及减轻皮肤的炎症反应这四个方面。因此，祛痘复方抑制5α-还原酶的能力、抗氧化能力、对金黄色葡萄球菌的抑菌能力以及抗炎能力与最终四黄复方的确定都有着很大的关联。
选择对dpph·自由基的清除率p(越高越好)、透明质酸酶抑制率i(越高越好)、抑菌效果和睾酮转化率t(越低越好)作为正交试验筛选复配组合的四个指标来选择最优组合。
通过对正交试验表中九组复配组合的实验结果进行汇总可以得到表4。在抑菌实验中，发现9个组合对金黄色葡萄球菌均有抑制作用，抑菌实验对9组复方没有选择性。因此，正交试验只有对dpph·自由基的清除率p、透明质酸酶抑制率i和睾酮转化率t三个指标。
在对9组复方组合的dpph·自由基的清除率p测试结果进行比较后，可以发现其中清除率最高的组合是a2b3c1d2。再对九组结果进行正交试验的分析，由四因素的极差可以得出四黄对dpph·清除率影响主次分别为大黄>黄芩>黄连>黄柏，根据k值的比较选出一个复配组合a2b3c3d2。
四黄对透明质酸酶的抑制率影响主次分别为黄柏>黄芩>黄连>大黄，从测出的九组数据中可以选出抑制率最高的组合a2b1c2d3，由k值选出一个复配组合a2b1c3d2。
四黄复配液对睾酮转化率的影响主次分别为黄连>大黄>黄柏>黄芩，从测出的九组数据中可以选出抑制率最高的组合a1b2c2d2，由k值选出一个复配组合a1b1c2d2。
“+”表示有菌生长，不抑菌；“-”表示无菌生长，有抑菌作用。
表4正交试验结果
最后，以上作为筛选最优组合的三个因素，利用矩阵分析法对实验进行优化，通过计算得到一个复配组合a1b1c3d2。
综合以上对实验结果影响因素的分析及矩阵分析法计算的优化选择得到最后的七个组合，分别为a2b3c1d2、a2b3c3d2、a2b1c2d3、a2b1c3d2、a1b2c2d2、a1b1c2d2、a1b1c3d2。
通过以上正交试验的选择得到了7组复配组合，再对选出的7个组合按照功效测试中的测试方法进行实验，得到了对dpph·的清除率、透明质酸酶抑制率、睾酮转化率及抑菌效果。实验发现7个组合对金黄色葡萄球菌都具有很好的抑制作用，如表5所示。
表5复方组合功效测试结果
通过对表5中的实验结果进行分析后发现，实验的7个组合中对dpph·清除效果可以看出较好的组合分别是a2b3c1d2、a1b1c3d2、a2b3c3d2；在对透明质酸酶的抑制实验中，效果较好的分别是a2b1c2d3、a1b1c3d2、a2b1c3d2；在对5α-还原酶的抑制实验中，睾酮转化率较低的分别是a1b1c3d2、a1b2c2d2、a2b1c2d3。
通过以上的测试数据可以发现在以上的7个复配组合中，抗氧化、抗炎、抑制5α-还原酶能力的综合结果比较好的是a1b1c3d2。因此，四黄复配的最优组合是由50mg/ml的黄连、50mg/ml的黄柏、100mg/ml的黄芩、75mg/ml的大黄等体积混合复配出的混合液，它在祛痘的四个阶段均能发挥较好的作用。
通过各组复配组合之间的祛痘功效对比后可以发现，四黄的复配比例对其去祛痘功效的影响并没有明确的规律可循，由于四种中草药水提液的成分比较复杂，而且各种水提液之间也可能存在相互的作用，可见复方中某种中草药水提液的浓度并非越高越好，因此科学的筛选复配组份含量对于提高复配产品的功效具有至关重要的作用。