紫花香茅萃取物用于治疗肺组织损伤及抑制肺纤维化的用途的制作方法

本发明是关于一种植物萃取物的保健用途，特别是关于一种紫花香茅萃取物用于制备治疗肺组织损伤及抑制肺纤维化的医药组合物的用途。

背景技术：

肺是呼吸器官也是过滤器官。肺部平时会分泌黏液以形成保护层，阻止吸入空气中的病原(如病毒、细菌、真菌)或悬浮微粒吸附至肺脏。但是，肺的异物清除能力有限，部分异物可能穿透此保护层而感染或损伤肺部，进而引起肺部发炎。此外，肺挫伤、败血症、出血性休克等会引起严重肺部发炎。多种参与发炎反应的免疫细胞(如巨噬细胞、嗜中性球)及被刺激分泌的促发炎细胞激素(如介白素、肿瘤坏死因子-α(tnf-α))可能造成肺部再次损伤，包括肺泡损伤、微血管通透性增加、微血栓，严重时甚至引发肺水肿、急性呼吸窘迫症等。前述造成肺组织损伤的因子可能连同发炎反应一起造成特发性肺纤维化(idiopathicpulmonaryfibrosis)，症状包含干咳与渐进性呼吸困难，最终可能导致呼吸衰竭及死亡。

为维持肺脏正常功能，应尽可能减少接触空气污染物与病原的机会以避免肺组织损伤及肺纤维化发生。可行方法包括避免吸烟、戴口罩、使用空气净化装置。另外，若肺组织损伤已经形成，应服用能够促进损伤愈合或抑制发炎的药物。然而，目前已知可有效抑制特发性肺纤维化发展的药物有限，且有研究显示抗发炎药物未必能抑制肺纤维化恶化。因此，开发一种能有效促进肺组织损伤愈合、抗肺部发炎反应、及抑制肺纤维化的新颖组合物，实有其必要。

技术实现要素：

缘此，本发明的一目的在提供一种紫花香茅(elsholtziaciliatahylander)萃取物用于制备治疗肺组织损伤及抑制肺纤维化的医药组合物的用途，其中该紫花香茅萃取物是以一溶剂萃取一紫花香茅而获得。

在本发明的一实施例中，该溶剂与该紫花香茅的重量比范围为20：1至2：1，且该萃取是在50℃至100℃进行。

在本发明的一实施例中，该溶剂为水，且该紫花香茅萃取物的浓度为0.25至1mg/ml。

在本发明的一实施例中，该紫花香茅萃取物促进一肺上皮细胞的创伤修复力。

在本发明的一实施例中，该紫花香茅萃取物抑制一肺上皮细胞分泌一促发炎细胞激素，例如介白素-8(interleukin-8，il-8)。

在本发明的一实施例中，该紫花香茅萃取物促进一肺上皮细胞表现一e钙黏蛋白(e-cadherin)。

在本发明的一实施例中，该紫花香茅萃取物抑制蛋白质醣化。

本发明紫花香茅萃取物能改善肺组织的创伤修复能力，同时抑制肺组织分泌促发炎细胞激素与促进其表现e钙黏蛋白，并且能抑制醣化蛋白质生成，最终达到减少肺组织损伤、抗发炎、及抑制肺纤维化的功效，因此有助于维持肺功能。故，本发明提供紫花香茅萃取物用于制备治疗肺组织损伤及抑制肺纤维化的医药组合物的用途。该医药组合物可为粉末、颗粒、溶液、胶体或膏体，藉由口服与经呼吸道吸入等方式给予一个体。

以下将配合图式进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明的发明特点及应用，而非以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。

附图说明

图1a显示单层人类肺上皮细胞在有或无紫花香茅萃取物处理0小时及16小时的显微照片；

图1b显示单层人类肺上皮细胞在有或无紫花香茅萃取物处理16小时后的伤口愈合百分比；

图2显示受脂多醣(lipopolysaccharide，lps)刺激的人类肺上皮细胞在有或无紫花香茅萃取物处理后的il-8分泌量；控制组细胞未以脂多醣及紫花香茅萃取物处理；

图3显示受脂多醣的人类肺上皮细胞在有或无紫花香茅萃取物处理后的荧光显微照片；控制组细胞未以脂多醣及紫花香茅萃取物处理；

图4显示紫花香茅萃取物对胶原蛋白醣化的抑制作用。

具体实施方式

本发明提供一种紫花香茅萃取物用于制备治疗肺组织损伤及抑制肺纤维化的医药组合物的用途。本发明的紫花香茅萃取物是以一溶剂萃取一紫花香茅而获得，其中，该溶剂较佳为水，该溶剂与该紫花香茅的重量比范围为20：1至2：1，且该萃取是在50℃至100℃进行。以下实施例显示该紫花香茅萃取物明显改善肺上皮细胞的创伤修复能力，并且在发炎刺激下显著抑制肺上皮细胞分泌促发炎细胞激素以及促进抗肺纤维化的e钙黏蛋白表现。此外，紫花香茅萃取物尚能抑制胶原蛋白醣化终产物生成，因此有利于预防肺纤维化发生。

定义

本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在20％的范围内，较佳为在10％的范围内，最佳为在5％的范围内。

本文所述「治疗肺组织损伤」是指减少肺组织(包括肺泡)整体的损伤程度，其判断指标包括肺部发炎的程度减轻及肺创伤修复的速度增加。熟习技艺人士当可依据本技术领域已知技术，例如本文所述生化及细胞培养技术，去评估肺组织损伤。

材料与方法

细胞培养

以下实施例使用购自美国典型培养物保存中心(americantypeculturecollection，atcc)的人类正常肺上皮细胞株beas-2b(atcccrl-9609)。该细胞是在37℃、5％二氧化碳的条件下培养于支气管上皮基础培养基(lonza^tmbronchialepithelialcellbasalmedium；thermofisherscientific)，简称bebm培养基。

il-8定量分析

利用酵素结合免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay，elisa)套组(humancxcl8/il-8elisakit；r&dsystems)测定il-8的蛋白质含量。依据厂商使用说明，将固着有捕捉抗体的96孔盘以含1％牛血清蛋白(bovineserumalbumin，bsa)的磷酸缓冲盐溶液(phosphatebufferedsaline，pbs)于37℃下阻断(blocking)3小时，再以清洗溶液予以清洗。将固定量的前述1％bsa溶液及100μl/孔的待测样品或标准品加入该96孔盘并在37℃反应2小时。其后，将100μl/孔的侦测抗体加入清洗后的该96孔盘内并在37℃反应2小时。最终，将100μl/孔的链霉亲和素-山葵过氧化酶(streptavidin-horseradishperoxidase(hrp))溶液加入清洗后的该96孔盘并在室温反应20分钟，再将100μl/孔的受质溶液加入清洗后的该96孔盘并在室温进行呈色反应20分钟，即停止该反应。利用elisa读盘机(biotek)侦测该96孔盘在450nm的吸光值。

抗肺纤维化指标蛋白的免疫荧光染色

为评估肺纤维化的发生，利用免疫荧光染色法测定肺上皮细胞中作为抗纤维化指标的e钙黏蛋白(e-cadherin，又名cd324)的表现量，其步骤简述如下。依据厂商使用说明，以pbs溶液(thermofischerscientific)清洗待测细胞，再以含4％甲醛的pbs溶液将其在室温下固定15分钟。经过pbs溶液清洗后，被固定细胞以含0.5％曲拉通x-100(tritonx-100)的pbs溶液在室温处理3至5分钟，再以pbs溶液清洗以供免疫染色。该细胞在含1％bsa的pbs溶液中于室温下阻断1小时，再与稀释于该1％bsa溶液中的小鼠抗人类e钙黏蛋白抗体(anti-humancd324antibody；biolegend)于室温反应2小时。经pbs溶液清洗后，该细胞与稀释于1％bsa溶液中的红色荧光标记山羊抗小鼠免疫球蛋白g二级抗体(alexaflour^tm594goatanti-mouseigg；thermofischerscientific)于室温反应30分钟，再以pbs溶液清洗。最终，利用dna荧光染剂(hoechst33342；thermofischerscientific)在室温下对细胞染色3至5分钟。该细胞于清洗以荧光显微镜观察其红色荧光分布。

统计分析

统计上的显著差异是使用excel软件中的学生t检定进行判定。

实施例1

紫花香茅萃取物的制备

紫花香茅(elsholtziaciliatahylander)又名香薷、蜂蜜草，是一年生草本植物，主要分布于亚洲。该植物已知可用于治疗急性呕吐腹泻及中暑，且有利尿效果。

为取得紫花香茅萃取物，首先，洗净及干燥紫花香茅的全植株，并使用粉碎机将其粗碎。其后，以水为溶剂对紫花香茅粗碎物进行萃取。该溶剂与该紫花香茅粗碎物混合的重量比范围为20：1至2：1。萃取温度为介于50℃至100℃，较佳为80℃至90℃。以下实施例2-5中紫花香茅萃取物皆为以水萃取，萃取时间为0.5至3小时。

经上述萃取步骤所得紫花香茅萃取物冷却至室温后，可以400目(mesh)的滤网过滤，以移除残余固体物。该过滤后的紫花香茅萃取物可进一步在45℃至70℃进行减压浓缩而获得一浓缩产物。为获得固态的紫花香茅萃取物，可将前述经浓缩的紫花香茅萃取物以例如冷冻干燥、喷雾干燥等干燥方式去除溶剂，因此获得紫花香茅萃取物的干燥产物。

实施例2

紫花香茅萃取物促进肺上皮细胞的创伤修复力

为研究紫花香茅萃取物是否影响肺组织的创伤修复能力，本实施例利用显微镜观察人类肺上皮细胞株beas-2b的细胞单层经紫花香茅萃取物处理后的伤口愈合状况变化。简言之，将细胞依1.5×10⁵个细胞/孔接种于含有bemb培养基的24孔盘，在37℃隔夜培养以形成一细胞单层。其后，于该细胞单层中形成一伤口，移除培养基并以pbs溶液清洗细胞，再以1ml含0.25mg/ml紫花香茅萃取物的bemb培养基处理细胞，或者仅以bemb培养基处理细胞以作为控制组。该二组细胞单层(三重复试验)于伤口形成后(0小时)及于37℃培养16小时后用显微镜(zeiss)观察及拍摄照片。

图1a显示该二组细胞单层在0小时及16小时的显微照片(放大倍率50x)；图1b是依据图1a计算而得的伤口愈合百分比，其值是各组在16小时的伤口区域总细胞面积相对于0小时的伤口区域总细胞面积的百分比。依据图1a-1b，紫花香茅萃取物的处理增加肺上皮细胞所修复伤口区域的面积达约30％。此结果说明紫花香茅萃取物促进肺上皮细胞的创伤修复力，因此具有治疗肺组织损伤的功效。

实施例3

紫花香茅萃取物抑制肺上皮细胞分泌促发炎细胞激素

为探讨紫花香茅萃取物是否对肺组织有抗发炎作用，本实施例以脂多醣(lps；sigma)刺激人类肺上皮细胞株beas-2b的发炎反应，并利用elisa测量该细胞经紫花香茅萃取物处理后的il-8分泌量变化。简言之，将beas-2b细胞依5×10⁴个细胞/孔接种于24孔盘，各孔含有添加1％青霉素/链霉素(penicillin/streptomycin)及10％胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)的500μldmem培养基(dulbecco'smodifiedeagle’smedium；thermofisherscientific)，以下称dmem细胞培养基。在37℃培养细胞24小时后，移除培养基，并以下列方式处理各孔细胞：(a)施以500μldmem细胞培养基(控制组)；(b)施以500μldmem细胞培养基，其含有1mg/ml脂多醣(lps组)；或(c)施以500μldmem培养基，其含有1mg/ml脂多醣及0.25mg/ml紫花香茅萃取物(lps+紫花香茅萃取物组)。各组细胞(三重复试验)于37℃培养2小时后，更新dmem细胞培养基再培养24小时，即收集其上清液120μl以进行il-8定量分析。

图2显示前述各组肺上皮细胞的il-8分泌量；^***表示相比lps组为p<0.001。依据图2，相比控制组，脂多醣的处理引发il-8的大量分泌，但是同时施予0.25mg/ml紫花香茅萃取物使肺上皮细胞的il-8分泌明显下降约60％，甚至略低于控制组细胞的il-8分泌量。此结果说明紫花香茅萃取物能抑制肺组织(如肺上皮细胞)发生发炎反应，因此减少个体肺脏因发炎(特别是慢性发炎)而进一步受损的可能性。

实施例4

紫花香茅萃取物抑制肺纤维化

先前研究指出与维持细胞正常型态相关的e钙黏蛋白在肺纤维化细胞中的表现量减少，因此e钙黏蛋白被视为一种抗肺纤维化指标蛋白。为检验紫花香茅萃取物是否阻止肺纤维化发生，本实施例以脂多醣刺激人类肺上皮细胞株beas-2b的发炎反应及纤维化型态，并利用免疫荧光染色法测定该细胞经紫花香茅萃取物处理后的e钙黏蛋白表现量。简言之，将beas-2b细胞依2×10⁴个细胞/孔接种于含有bebm培养基的24孔盘。在37℃隔夜培养细胞后，移除陪养基，并以下列方式处理各孔细胞：(a)施以500μldmem细胞培养基(控制组)；(b)施以500μldmem细胞培养基，其含有1mg/ml脂多醣(lps组)；或(c)施以500μldmem细胞培养基，其含有1mg/ml脂多醣及0.25mg/ml紫花香茅萃取物(lps+紫花香茅萃取物组)。各组细胞(三重复试验)于37℃培养2小时后，更新dmem细胞培养基再培养24小时，即于pbs溶液清洗后用于免疫荧光染色。

图3显示前述各组肺上皮细胞的荧光显微照片(放大倍率100x)；红色荧光指示e钙黏蛋白，蓝色荧光指示细胞核。依据该照片，控制组细胞表现大量红色荧光，但脂多醣的处理令红色荧光几乎消失，显示发炎刺激会抑制肺上皮细胞中e钙黏蛋白表现，使肺上皮细胞向纤维化型态转变。然而，同时施予0.25mg/ml紫花香茅萃取物回复e钙黏蛋白的表现。此结果说明紫花香茅萃取物能直接抑制肺上皮细胞向肺纤维化发展，因此具有抑制肺纤维化所导致肺功能失调的潜力。

实施例5

紫花香茅萃取物抑制蛋白质醣化

身体内蛋白质的醣化反应会导致蛋白质功能缺失，进而导致组织或器官(例如肺脏)退化。另外，有研究提出蛋白质醣化终产物与肺纤维化的发展相关。为探讨紫花香茅萃取物是否能抑制蛋白质醣化，本实施例以抗醣化分析测定1mg/ml紫花香茅萃取物对猪胶原蛋白醣化反应的抑制作用。简言的，利用200mm磷酸盐缓冲溶液(ph7.4)配制60mg/ml胶原蛋白溶液(含0.06％迭氮化钠)及1.5m果糖溶液。为进行胶原蛋白醣化反应，将0.2ml胶原蛋白溶液与0.2ml果糖溶液的混合物与0.2ml的紫花香茅萃取物样品或去离子水(控制组)均匀混合，于50℃反应24小时，再添加胺基胍(aminoguanidine，ag，购自sigma)以中止醣化反应。使用分光荧光计(spectrofluorometer，flx800，biotek)测量前述反应液(0.1ml)在0小时与24小时的荧光强度(激发波长360nm，放射波长460nm)，并依下列公式计算蛋白质醣化终产物生成率：[(样品荧光强度24小时-样品荧光强度0小时)/(控制组荧光强度24小时-控制组荧光强度0小时)]×100％。

图4显示紫花香茅萃取物对胶原蛋白醣化的抑制作用。依据该图，0.25mg/ml紫花香茅萃取物减少胶原蛋白醣化终产物生成达约33％。此结果说明紫花香茅萃取物因为减少蛋白质醣化终产物而有抑制肺纤维化的功效，并且能透过抑制体内蛋白质醣化而推迟器官退化。

综上所述，紫花香茅萃取物能改善肺组织的创伤修复能力，同时抑制肺组织分泌促发炎细胞激素与促进其表现e钙黏蛋白，并且能抑制醣化蛋白质生成，最终达到减少肺组织损伤、抗发炎、及抑制肺纤维化的功效，因此有助于维持肺功能。故，本发明提供紫花香茅萃取物用于制备治疗肺组织损伤及抑制肺纤维化的医药组合物的用途。该医药组合物可为粉末、颗粒、溶液、胶体或膏体，藉由口服与经呼吸道吸入等方式给予一个体。