本发明涉及抗病毒药物，具体涉及利巴韦林衍生物制剂及其制备方法。
背景技术：
利巴韦林是一种抗病毒药物。已发现利巴韦林可用于治疗婴儿呼吸系统合胞体病毒(rsv)、流感病毒、甲型肝炎(hav)与乙型肝炎(hbv)及拉沙热病毒(lfv)、汉坦病毒(htnv)与引起sars(严重急性呼吸器官综合症)的呼吸系统病毒。
但是在实践中特别是静脉注射时发现该药物的毒副作用很明显，长期或大剂量使用可导致严重溶血性贫血，在儿童中使用风险尤其明显。此外，利巴韦林在人体中只能通过肾脏代谢，在人体残留时间较长，因此，亟需一种无溶血副作用且用量少、效果好的制剂。
技术实现要素：
本发明的目的是为了克服现有技术存在的溶血副作用、在人体人残留时间较长的问题，提供了利巴韦林衍生物制剂及其制备方法。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种利巴韦林衍生物制剂，该制剂含有如式(i)所示的活性组分、缓冲系统和注射用水，
其中，式(i)的r为磷酸酯基团，具有以下结构：
式(ii)至式(iv)中，*表示r在式(i)中连接的位置，r1选自c1-c8的烷基或氢；r2选自c1-c8的烷基或具有8-18碳原子的低聚乙二醇，r3选自氢、c1-c8的烷基或具有8-18碳原子的低聚乙二醇，r4、r5可以相同或不同，各自独立地选自c1-c15的烷基；k为1-50的整数，z为2-6的整数，t为1-50的整数。
本发明第二方面提供了本发明第一方面所述的利巴韦林衍生物制剂的制备方法，所述方法包括：
(1)将如式(i)所示的活性组分溶解于注射水中，向其中加入适量的活性炭和/或分子筛，并加入缓冲系统，调节ph为4-6.5，将得到的混合物在30-40℃下搅拌，过滤至澄清，
(2)将步骤(1)所得澄清溶液进行除菌处理，ph检测，并分装。
本发明第三方面提供了本发明第一方面所述利巴韦林衍生物制剂在抗病毒方面的应用。
本发明所述利巴韦林衍生物制剂在同时具有较好抗病毒效果的情况下，可以有效地缓解或消除溶血副作用，而且药效较长，在使用较少活性组分的情况下，可以实现有效地抑制病毒的效果。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明第一方面提供一种利巴韦林衍生物制剂，该制剂含有如式(i)所示的活性组分、缓冲系统和注射用水，
其中，式(i)的r为磷酸酯基团，具有以下结构：
式(ii)至式(iv)中，*表示r在式(i)中连接的位置，r1选自c1-c8的烷基或氢；r2选自c1-c8的烷基或具有8-18碳原子的低聚乙二醇，r3选自氢、c1-c8的烷基或具有8-18碳原子的低聚乙二醇，r4、r5可以相同或不同，各自独立地选自c1-c15的烷基；k为1-50的整数，z为2-6的整数，t为1-50的整数。
在一种实施方式中，式(i)所示的活性组分中，r具有式(ii)所示结构，r1选自c1-c8的烷基或氢，例如可以为氢、甲基、乙基、丙基、丁基、己基、庚基或辛基，优选地r1选自氢、甲基、乙基或丙基；k为1-50的整数，例如k可以为4、7、9、12、15、20、25、30、35、40、45、50以及上述数值中任意两值中的任意整数，优选地k为4-30的整数。
在一种实施方式中，式(i)所示的活性组分中，r具有式(iii)所示结构，其中，r2选自甲基、乙基、丙基、己基、庚基、辛基或具有10-18个碳原子的低聚乙二醇，z为2-6的整数，例如z为2、3、4、5或6，优选地z为2-4的整数；t为1-50的整数，例如t为1、2、3、4、5、6、8、12、15、17、20、25、30、35、40、45或50，以及上述数值中任意两个数值所组成范围中的任一整数，优选地t为1-20的整数。
在一种实施方式中，式(i)所示的活性组分中，r具有式(iv)所示结构，其中，r3选自氢、甲基、乙基、丙基、己基、庚基、辛基或具有10-18个碳原子的低聚乙二醇，r4、r5可以相同或不同，各自独立地选自c1-c15的烷基；优选地r3选自甲基、乙基、丙基，r4、r5可以相同或不同，各自独立地选自c3-c12的烷基。
在本发明所述的利巴韦林衍生物制剂中，所述活性组分具有以下结构：
在本发明所述的利巴韦林衍生物制剂中，还含有缓冲系统，所述缓冲系统以保证制剂的ph为4-6.5。优选地，所述缓冲系统选自柠檬酸-柠檬酸钠、醋酸-醋酸钠、磷酸二氢钠、酒石酸-酒石酸钠或富马酸-富马酸钠。
在一种实施方式中，所述制剂还含有抗氧化剂，合适的抗氧化剂可以包括但不限于α-生育酚，抗坏血酸，棕榈酸抗坏血酸酯，丁羟茴醚，硫代甘油，偏重亚硫酸钾，棓酸丙酯，抗坏血酸钠，焦亚硫酸钠，亚硫酸钠，麝香草酚或它们的混合物，优选地，所述抗氧化剂选自α-生育酚、棕榈酸抗坏血酸酯、丁羟茴醚、抗坏血酸或硫代甘油。
在本发明所述的利巴韦林衍生物制剂中，式(i)所示结构的活性组分具有与利巴韦林相似的抗病毒药效，并且式(i)所示结构的活性组分不能形成三磷酸盐代谢物，不会出现溶血现象，同时式(i)中r具有一定的位阻，在一定程度上延长了活性组分的作用时间，使药效延长。因此，本发明所述的利巴韦林衍生物制剂，在使用较少量的活性组分的情况下，即可实现较好的抗病毒效果。相对于1l的注射用水，所述式(i)所示活性组分的用量为0.05-1.5g，例如可以为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1、1.3、1.5以及上述数值中任意两个所组成范围中的任意一值，优选为0.1-0.8g。
本发明所述利巴韦林衍生物制剂不仅可以实现抗病毒的效果，而且可以有效地缓解或消除溶血副作用，同时本发明所述利巴韦林衍生物制剂药效较长，可以在较少量活性成分的情况下达到抗病毒的效果。
式(i)所述活性组分可以按照以下工艺来制备，工艺中涉及的反应都为实验室中常见的反应，反应条件并无太大差别，可以参照相关现有技术文献来进行。
式(viii)所示工艺中所使用的利巴韦林为根据现有技术公知的方法制备所得产物，例如cn102286046b中所公开的方法。
以r具有式(ii)所示结构的活性组分为例，roh可以通过以下工艺制备：
该工艺可以参照“水溶性聚乙二醇磷酸酯的合成及润滑与腐蚀性能研究”，(赵伟，袁帅，于萍，罗运柏，润滑与密封，2015，40(02):64-66)中的方法。
以r具有式(iii)所示结构的活性组分为例，roh可以通过以下工艺制备：
该工艺可以参照文献“聚磷酸酯的合成及在生物医用材料中的应用”(胡健，何金林，张明祖，倪沛红；高分子通报，2015(10):51-65)中的方法。
以r具有式(iv)所示结构的活性组分为例，roh可以通过以下工艺制备：
该工艺可以参照文献“新型磷酸酯表面活性剂的合成及在农药制剂中的应用”(庞文文，上海师范大学，2014)中的方法。
本发明第二方面提供了本发明第一方面所述利巴韦林衍生物制剂的制备方法，所述方法包括：
(a)将如式(i)所示的活性组分溶解于注射水中，向其中加入适量的活性炭和/或分子筛，并加入缓冲系统，调节ph为4-6.5，将得到的混合物在30-40℃下搅拌，过滤至澄清，
(b)将步骤(a)所得澄清溶液进行除菌处理，ph检测，并分装。
在本发明所述方法中，在步骤(a)中，所述活性炭和/或分子筛的用量为式(i)所示活性组分用量的0.1wt％-2wt％，优选地0.1wt％-0.5wt％。在此，“wt％”表示重量百分数。在此，活性炭和/或分子筛用于除去制剂中色素、较小固体颗粒等杂质的成分。由于加入活性炭进行净化时，在一定程度上活性炭会吸附一定量的活性组分，从而造成活性组分的流失，影响最终所得制剂的药效。而分子筛例如氢型分子筛，由于与式(i)所示活性组分之间存在电荷相斥作用，不会吸附或较少地吸附活性组分。优选地，将如式(i)所示的活性组分溶解于注射水中，向其中加入适量的分子筛。优选地，所述分子筛为氢型分子筛。
在本发明所述方法中，优选地，在步骤(a)中，将如式(i)所示的活性组分溶解于注射水中，向其中加入适量的活性炭和/或分子筛，并加入缓冲系统，调节ph为5-6.5。
在本发明所述方法中，步骤(a)中，所述过滤的技术手段可以根据现有技术来选择，例如通过钛滤器过滤等，在此不再赘余。
在本发明所述方法中，步骤(b)中，所述除菌处理、ph检测、分装都可以根据现有技术来选择，在此不再赘余。
本发明第三方面提供了本发明第一方面所述利巴韦林衍生物制剂在抗病毒方面的应用。
优选地，所述利巴韦林衍生物制剂主要用于呼吸道合胞病毒引起的病毒性肺炎与支气管炎和流行性出血热以及拉沙热等症候的预防和治疗。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
实施例中使用的利巴韦林注射液购自国药集团容生制药有限公司，国药准字h19993467。
实施例1-3是为了说明式(i)所示结构的活性组分(a1、a2、a3)的制备。
实施例1
按照以下方法制备活性组分a1。
按照式(xii)所示工艺制备活性组分a1，即化合物3。
将购得的十二甘醇甲醚(化合物1，0.5mol)按照文献“水溶性聚乙二醇磷酸酯的合成及润滑与腐蚀性能研究”(赵伟，袁帅，于萍，罗运柏，润滑与密封，2015，40(02):64-66)中的方法制备化合物2。
用50ml无水吡啶处理化合物2(0.1mol)两次，蒸发浓缩。在室温下将残余物溶于60ml无水吡啶中，在氮气下用2,4,6-三异丙基-苯磺酰氯(0.15mol)处理，并在25℃下搅拌4小时。然后立即加入利巴韦林(0.1mol)，并将反应在氮气下搅拌14小时。通过加入20ml水进行水解。将混合物中的溶剂蒸发。将得到粗物质通过制备型hplc纯化，通过核磁测试和飞行时间质谱测试([m+1]+＝881.6，找到881.5的峰)显示得到产物即为化合物3。
实施例2
按照以下方法制备活性组分a2。
按照式(xiii)所示工艺制备活性组分a2，即化合物6。
参照文献“聚磷酸酯的合成及在生物医用材料中的应用”(胡健，何金林，张明祖，倪沛红；高分子通报，2015(10):51-65)中的方法由化合物4制备化合物5。
用50ml无水吡啶处理化合物5(0.1mol)两次，蒸发浓缩。在室温下将残余物溶于60ml无水吡啶中，在氮气下用2,4,6-三异丙基-苯磺酰氯(0.15mol)处理，并在25℃下搅拌4小时。然后立即加入利巴韦林(0.1mol)，并将反应在氮气下搅拌14小时。通过加入20ml水进行水解。将混合物中的溶剂蒸发。将得到粗物质通过制备型hplc纯化。通过核磁测试和飞行时间质谱测试([m+1]+＝2315.1，找到2315的峰)显示得到产物即为化合物6。
实施例3
按照以下方法制备活性组分a3。
按照式(xiv)所示工艺制备活性组分a3，即化合物10。
参照文献“新型磷酸酯表面活性剂的合成及在农药制剂中的应用”(庞文文，上海师范大学，2014)的方法制备化合物7。
将化合物7(0.8mol)与乙醇在酸性条件下发生酯化反应，并提纯得到化合物8。
将化合物8(0.5mol)与k2co3(5mol)溶于50ml的四氢呋喃，并向其中加入1-碘癸烷(0.5mol)，在80℃条件下反应12h，蒸发溶剂，提纯、酸化得到化合物9。
用50ml无水吡啶处理化合物9(0.1mol)两次，蒸发浓缩。在室温下将残余物溶于60ml无水吡啶中，在氮气下用2,4,6-三异丙基-苯磺酰氯(0.1mol)处理，并在25℃下搅拌4小时。然后立即加入利巴韦林(0.1mol)，并将反应在氮气下搅拌14小时。通过加入20ml水进行水解。将混合物中的溶剂蒸发。将得到粗物质通过制备型hplc纯化。通过核磁测试和飞行时间质谱测试([m+1]+＝764，找到764.2的峰)显示得到产物即为化合物10。
实施例4-6
实施例4-6是为了将活性组分a1、a2、a3分别制成制剂b1、b2、b3。
实施例4
(a)将活性组分a1(0.5g)溶解于注射水(1l)中，向其中加入适量的分子筛(2.5mg)，并加入缓冲系统(柠檬酸-柠檬酸钠)，调节ph为5.5，将得到的混合物在40℃下搅拌，过滤至澄清；
(b)将步骤(a)所得澄清溶液进行除菌处理，ph检测，并分装，得到制剂b1。
实施例5
参照实施例4制备制剂b2，不同的是，在步骤(a)中，将活性组分a2(0.8g)、抗坏血酸(抗氧化剂，0.01g)溶解于注射水(1l)中，向其中加入适量的分子筛(2.4mg)，并加入缓冲系统(柠檬酸-柠檬酸钠)，调节ph为6，将得到的混合物在35℃下搅拌，过滤至澄清。最终得到制剂b2。
实施例6
参照实施例4制备制剂b3，不同的是，在步骤(a)中，将活性组分a3(0.3g)溶解于注射水(1l)中，向其中加入适量的分子筛(1.5mg)，并加入缓冲系统(柠檬酸-柠檬酸钠)，调节ph为6.5，将得到的混合物在30℃下搅拌，过滤至澄清。最终得到制剂b3。
实施例7
实施例7是为了说明制剂b1、b2、b3的抗病毒效果。
将培养成单层的hep-2细胞用胰酶消化后，接种于96孔板中，长成单层备用。将呼吸道合胞病毒(rsv)接种于hep-2细胞上，加无血清1640培养液后置37℃、5％co2条件下培养，出现10％左右的病变时，反复冻融3次后吹打离心，定量分装，–80℃冰箱冻存备用。将上述制剂b1、b2、b3连续10次2倍比稀释，然后分别接种于96孔中的单层细胞上，2列为制剂b1，4列为制剂b2，6列为制剂b3，并用病毒维持液设置对照(列8)，将利巴韦林注射液设置于列10，于37℃、5％co2条件下培养。每小时观察病变，连续观察24h(rsv)。在显微镜下观察细胞融合、坏死、脱落、漂浮、死亡等细胞病变。病变程度表示为0-25％(+)，25％-50％(++)，50％-75％(+++)，75％-100％(++++)，待对照组(病毒感染未处理组)达到+++或++++时终止实验。
实验结果：对照组达到+++或++++时，制剂利巴韦林、b1、b2、b3列均仅有轻微细胞病变，病变情况较轻(+)。
上述结果初步证明了本发明所述制剂具有抗呼吸道合胞病毒的效果，抗病毒效果与利巴韦林类似。
实施例8
实施例8是为了说明制剂b1、b2、b3无溶血副作用。
取10ml试管5支，各加入新配置的2％家兔血生理盐水混悬液2ml，第1管加生理盐水2ml作为对照管，第2管加利巴韦林注射液，第3-5管分别加入2ml制剂b1、b2、b3，摇匀，置37℃静置，观察1h。第1、3-5管中血红细胞形成沉淀，上清液呈无色透明，表明无溶血情况发生。第2管的溶液澄明成棕色，管有少量红细胞残留，说明出现部分溶血。
实施例9
实施例9是为了说明制剂b1、b2、b3的药效。
将家兔以制剂活性组分10mg/kg经耳缘静脉注射制剂b1、b2、b3以及利巴韦林注射液，测得血浆药物消除半衰期分别为3.6h、4.5h、4h、2.5h。
通过上述实施例可以看出，采用本发明所述利巴韦林衍生物制剂具有与利巴韦林类似的抗病毒效果，并且没有溶血副作用，此外，相对于市场上的利巴韦林注射液而言，本发明所述的利巴韦林衍生物制剂具有明显较长的药效，这样一来，就可以实现使用较少量的活性组分，而达到良好的抗病毒效果。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。