一种戊糖片球菌表面蛋白在抑制食源性致病菌中的应用的制作方法

本发明属于戊糖片球菌新应用技术领域，具体涉及一种戊糖片球菌表面蛋白在抑制食源性致病菌中的应用。

背景技术：

益生菌(probiotics)又称微生态调节剂、活菌制剂，是一类能够对宿主生理功能产生有益作用的活性微生物，具有调节肠道微生态、改善肠道内环境、调节肠道菌群、抑制致病性菌等作用，主要包括双歧杆菌、乳酸菌和酵母菌。戊糖片球菌(pediococcuspentosaceus)隶属链球菌科片球菌属，为革兰氏阳性菌，因其能发酵葡萄糖产生乳酸而属于乳酸菌的一种，广泛分布于泡菜、干酪、香肠等传统发酵食品中，对提高发酵食品的风味、营养及安全性具有重要作用，同时具有免疫调节能力、促进健康以及抵抗病原菌侵袭等多种益生功能。

乳酸菌的多种益生功能与其表面活性因子的存在密不可分。黏附是乳酸菌发挥益生作用的第一步，乳酸菌依靠其表面的蛋白、多糖等黏附宿主肠上皮细胞并定植，分泌代谢产物等，进而发挥抑制致病菌黏附和抑制致病菌生长等重要生理作用。在乳酸菌表面黏附众多黏附因子当中，乳酸菌表面蛋白是其主要黏附因子，与黏附相关的表面蛋白主要包括s-层蛋白、引物酶sortase依赖蛋白、黏膜结合蛋白、黏附胞外间质的表面蛋白等。目前有关乳酸菌表面蛋白的结构与功能研究主要集中在乳酸杆菌中，包括罗伊氏乳杆菌的粘液结合蛋白(mub)、卷曲乳杆菌的胶原结合表层蛋白(cbsa)和s-层蛋白(slpb)、植物乳杆菌nl42的细胞壁固定蛋白(cwaa)等，而有关乳酸球菌表面蛋白的研究报道相对较少。

技术实现要素：

发明目的：针对上述技术问题，本发明提供了一种戊糖片球菌表面蛋白在抑制食源性致病菌中的应用，从戊糖片球菌pediococcuspentosaceusf28-8(以下简称p.pentosaceusf28-8)提取的表面蛋白对食源性致病菌有明显的抑制作用。

技术方案：为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种戊糖片球菌表面蛋白在抑制食源性致病菌中的应用，所述戊糖片球菌表面蛋白是从戊糖片球菌中提取的表面蛋白。

优选：

所述戊糖片球菌为戊糖片球菌p.pentosaceusf28-8，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心，保藏日期为2014.11.13，保藏编号为cgmccno.9956。

所述表面蛋白提取方法包括以下步骤：

1)取戊糖片球菌p.pentosaceusf28-8，按2-4％的接种量接种于mrs液体培养基中，恒温培养12-20h，离心收集菌体；

2)取上述菌体，加licl溶液作用0.3-0.7h，离心，弃上清，再用盐酸胍溶液重悬混匀，恒温培养0.5-1.5h，离心，收集上清；

3)将步骤2)所得上清进行透析，离心取上清，冻干，即得所述戊糖片球菌表面蛋白。

步骤1)中恒温培养的温度为37℃。

步骤2)中每克菌体中加入10ml的5mol/l的licl溶液，温育的条件为：37℃温育20～40min；每克菌体加入5ml的4mol/l的盐酸胍溶液，恒温培养的条件为：37℃恒温培养0.5-3h。

步骤3)中透析袋的分子截留量为14kda，透析条件为：4℃去离子水中透析48h。

所述戊糖片球菌表面蛋白在应用时直接使用，或者制成菌剂使用。

本发明还提供了所述戊糖片球菌表面蛋白在制备能预防和控制食源性致病菌污染的抗菌剂中的应用。

优选，所述食源性致病菌包括革兰氏阳性菌(如金黄色葡萄球菌等)和革兰氏阴性菌(如沙门氏菌等)。

本发明通过特定的方法从戊糖片球菌p.pentosaceusf28-8提取出表面蛋白，实验证明，通过将提取的戊糖片球菌表面蛋白作用于食源性致病菌，具有一定的抗菌性能，不论是在食品行业还是医药行业，都是一种更加安全可靠的潜在的绿色抗菌剂。利用戊糖片球菌p.pentosaceusf28-8表面蛋白，可以增强对食品工业常见食源性致病菌的抑制作用，为开发新型绿色安全的抗菌剂以及拓展乳杆菌表面蛋白的应用提供信息参考。并且该方法为生产抗菌蛋白提供了一个新的途径和方法，具有分离提取率高、成本低的优点，可应用于大规模地从戊糖片球菌中分离纯化抗菌蛋白的生产。

技术效果：相对于现有技术，本发明应用中，戊糖片球菌表面蛋白的提取方法投入低、操作简单、抗菌蛋白得率高，所得戊糖片球菌p.pentosaceusf28-8表面蛋白，对于食源性致病菌抗菌效能优异，为戊糖片球菌表面蛋白在抗菌剂及抗菌材料领域的潜在应用提供理论依据。

附图说明

图1为戊糖片球菌p.pentosaceusf28-8的生长曲线及其产酸情况；

图2为戊糖片球菌p.pentosaceusf28-8表面蛋白的透射电镜图，其中，a：未处理的p.pentosaceusf28-8，箭头：表面结构；b：licl处理的p.pentosaceusf28-8；

图3为戊糖片球菌p.pentosaceusf28-8licl提取物的sds-page，其中，m：标准蛋白marker；1：戊糖片球菌表面提取物。

图4为戊糖片球菌p.pentosaceusf28-8表面蛋白对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌生长的影响，其中，(a)：戊糖片球菌表面蛋白对沙门氏菌生长的影响；(b)：戊糖片球菌表面蛋白对金黄色葡萄球菌生长的影响。

具体实施方式

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例所用材料和设备如下：

1、材料与试剂

p.pentosaceusf28-8，扬州大学食品科学与工程学院食品微生物实验室专利保藏菌株(中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.9956)；金黄色葡萄球菌staphylococcusaureuscicc22936、沙门氏菌salmonellacicc21513，购置于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

lb液体培养基的配制：胰蛋白胨10g·l^-1、酵母提取物5g·l^-1、氯化钠10g·l^-1、蒸馏水1l，121℃湿热灭菌15min。

2、仪器与设备

sx—500型高压蒸汽灭菌锅，日本tommy公司；tecnai—12透射电镜，荷兰phlilps公司；alphai-2ldplus冷冻干燥机，德国christ公司；5800超高分辨飞行时间生物质谱仪，美国absciex公司。

3、菌株活化方法

取-20℃甘油管保存的戊糖片球菌按2％(v/v)的接种量接种于mrs液体培养基中，37℃恒温培养20h后，再按2％(v/v)的接种量活化于mrs液体培养基中，37℃恒温培养20h，备用。

取-20℃甘油管保存的金黄色葡萄球菌和沙门氏菌按2％(v/v)的接种量接种于lb液体培养基中，37℃恒温摇床培养14h后，再按2％(v/v)的接种量活化于lb液体培养基中，37℃恒温摇床培养14h，备用。

实施例1：戊糖片球菌的生长情况及产酸情况

以2％接种量取-70℃甘油贮存液接种于mrs培养基中，37℃恒温培养24h，每隔2h测其od600nm值与ph值并绘制生长情况与产酸能力曲线图。

结果如图1所示，随着培养时间的增加，戊糖片球菌的生长速度逐步增快并在4h左右开始进入对数生长期，培养12h后达到稳定期，生长减缓。而在戊糖片球菌的适应期和对数期，培养基中的ph值一直在下降，从5.64下降到4.14，并在12h趋于稳定。在酸性条件下仍然保持生长稳定，说明戊糖片球菌具有较强的酸适应能力，能够在较低ph条件下存活。

实施例2：戊糖片球菌p.pentosaceusf28-8表面蛋白的提取与分析

(1)表面蛋白的提取方法：

菌株接种mrs培养基，37℃恒温培养18h，8000rpm离心收集菌体，pbs洗涤2次离心。对照组将菌体重悬于pbs，处理组菌体加5mol/llicl溶液(每克菌体中加入10ml)37℃作用0.5h，离心(8000r/min，15min)，弃上清，4mol/l盐酸胍溶液(每克菌体加入5ml)重悬混匀，于37℃恒温培养箱中处理1h，离心(8000r/min，15min)，收集上清。将上清移入14kda分子截留量的透析袋中，4℃去离子水中透析48h后，离心(12000r/min，15min)取上清，即为戊糖片球菌表面蛋白。

(2)表面蛋白的分析

将licl处理前后的菌体重悬于pbs后，分别滴至专用铜网上，自然晾干10min后，2％磷钨酸染色2min，滤纸吸除多余染液，用灯烘干。将样品装入样品台，放入样品室进行透射电子显微镜(tem)观察。同时将licl提取物采用12％分离胶的sds-page进行电泳分析。将电泳胶上的条带进行割胶后，采用pbs洗净，经胰蛋白酶酶解后进行maldi-tof-ms质谱分析，并应用mascot软件搜索ncbi数据库以获得蛋白信息。

戊糖片球菌f28-8在37℃恒温培养18h后，透射电镜结果显示分离株的细胞形态为四联球，并存在表面结构(图2a)，经licl处理之后，菌株表面基本脱落(图2b)。对licl提取的表面蛋白进行了电泳分析，如图3所示，戊糖片球菌的licl提取物在分子量45-116kda之间存在主要蛋白条带a和b。

将条带a和b分别进行割胶回收，胶内酶解，利用maldi-tof-ms进行蛋白鉴定，通过mascot数据库搜索比对，条带a被鉴定为n-乙酰基胞壁酰-l-丙氨酸酰胺酶(n-acetylmuramoyl-l-alanineamidase)，理论相对分子量为83.5kda(表1)。条带b被鉴定为含有lysm肽聚糖结合蛋白(lysmpeptidoglycan-bindingdomain-containingprotein)，理论相对分子量为51.1kda(表1)。

表1蛋白质谱鉴定结果

实施例3：戊糖片球菌p.pentosaceusf28-8表面蛋白的抑菌应用

取活化好的金黄色葡萄球菌(或沙门氏菌)菌悬液接种入lb液体培养基中，接种量为2％(v/v)，实验组同时加入戊糖片球菌表面蛋白(终浓度为10μg/ml)，而对照组只接种金黄色葡萄球菌(或沙门氏菌)，37℃摇床振荡培养10h，每2h测一次od600nm值。绘制生长曲线图。同一培养时间，实验组的吸光度值记为at，对照组的吸光度值记为ac，按照公式计算金黄色葡萄球菌(或沙门氏菌)的生长抑制率。

数据统计分析：采用spss13.0软件对数据进行统计分析，用duncan’s多重分析进行组间显著性检验，显著水平为p＜0.05。

结果如图4所示，在培养10h时，相比对照组，添加表面蛋白的处理组对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为31.5％和15.6％。结果表明，戊糖片球菌表面蛋白对沙门氏菌的抑菌效果稍强于金黄色葡萄球菌，原因是licl提取物中除了能有效抑制革兰氏阳性菌的抑菌因子外，还存在能抑制革兰氏阴性菌的其他抑菌因子。