本发明涉及医药
技术领域：
：，具体涉及青蒿素b对阳性药顺铂抗肿瘤作用的增效减毒方面的应用。
背景技术：
：：黄花蒿(artemisiaannual.)是菊科蒿属的一年生草本植物，又名香蒿、草青蒿、臭青蒿，其分布广泛、适应性强，具有解暑、退热、治感冒等功效，是我国传统的中草药。青蒿素(artemisinin)是我国药学工作者于1972年从黄花蒿中提取得到的具有抗疟活性的倍半萜内酯类化合物。临床上，青蒿素及其衍生物能够快速杀死疟原虫，疗效显著且无明显副作用。此外，近年来研究表明，除抗疟活性外，青蒿素类化合物还具有抗内毒素、免疫调节、抗变态反应及抗肿瘤等多种药理作用，是一类具有良好临床应用前景的中药活性成分。其中，青蒿素类化合物的抗肿瘤活性在近年来得到了广泛而深入的研究。我们的研究结果显示，青蒿素类化合物具有多种抗肿瘤活性，尤其在肺癌治疗中极具研究开发价值。青蒿素类化合物不仅自身具有抗肺癌作用，且同某些治疗手段或治疗药物联用时可获得与单药用药相比更强的的肺癌抑制活性，如dha与顺铂在抑制a549及a549顺铂耐药株增殖方面就具有协同作用，可通过调节血管生成的机制增强顺铂的抗肿瘤效果。缝隙连接(gapjunction，gj)是位于相邻细胞间的一类由蛋白质组成的连接通道，系细胞间进行物质信息交换的重要通道。其由细胞gj所介导的缝隙连接细胞间通讯(gapjunctionintercellularcommunication，gjic)决定着细胞之间各类因子的传递与平衡，对细胞的生长分化、内环境稳定及组织的免疫修复等均具关键性作用。缝隙连接蛋白(connexin，cx)是一种膜蛋白，作为连接蛋白之一，是形成gj结构和功能性的基础，cx的表达水平高低是gj功能正常与否的关键因素。此外，受多种因素与机制调控的cx表达水平一旦改变便会影响到由其所构成的gj通道，导致gj功能异常，并引起细胞间通讯传递的障碍进而引发包括肿瘤等多种疾病的发生。青蒿素b(arteannuinb)为青蒿素类化合物，本课题组前期研究发现青蒿素b在体外对多种肿瘤细胞株都具有较好的抗肿瘤活性，能够抑制肿瘤的增殖和转移。cx43在肺癌的发生发展中具有重要的调节作用，是一个极具潜力的肿瘤抑制因子，在肺癌的临床治疗方面具有较大的应用前景，值得全面深入的研究。经查阅文献未见青蒿素b对肺癌细胞通讯及阳性抗肿瘤药物顺铂抗肿瘤作用方面的相关报道，其具有作为抗肿瘤及辅助药物的潜在开发价值。技术实现要素：本发明对青蒿素b能否影响人非小细胞肺癌a549细胞的gj功能及cx43表达进行研究，并考察了青蒿素b与化疗药顺铂体内外联合应用对肿瘤细胞的增殖抑制作用。此研究旨在为青蒿素类化合物的进一步开发及抗肿瘤作用机制的研究提供新资料。本发明是通过如下技术方案实现的：采用parachuteassay、westernblotting、qrt-pcr、细胞免疫荧光等技术研究青蒿素b对缝隙连接的影响；mtt、annexinv-fitc/pi双染等检测方法考察青蒿素b与ddp的体外联合作用；通过建立a549细胞的裸鼠移植瘤模型考察青蒿素b与ddp的体内联合作用；采用westernblotting法实验进一步研究青蒿素b与ddp体内外联合对cx43的调节所涉及的信号通路相关机制。本发明相对于已有技术，其创新性在于：(1)本论文首次证实青蒿素b能够对非小细胞肺癌a549细胞通讯中cx43的表达及gj功能进行调节，且具有良好的浓度依赖性；(2)本研究首次证实青蒿素b与ddp在体外联用对a549细胞的增殖抑制活性具有相加及协同作用。(3)青蒿素b与ddp在体内联合使用能有效抑制裸鼠异种移植瘤的增殖并延缓顺铂毒性的发生，青蒿素b体内外调节cx43的机制涉及mapks信号通路的激活；(4)本发明为研制新的抗肿瘤辅助药物提供了新的科学依据，对开发利用传统中药具有重要意义。附图说明图1-4为实施例1中探究青蒿素b对缝隙连接的影响。图5-7及表1-2为实施例2中考察青蒿素b与ddp的体外联合作用。图8-12及表3-6为实施例3中考察青蒿素b与ddp的体内联合作用。图13-16为实施例4中探究青蒿素b与ddp体内外联合对cx43的调节机制。具体实施方式：下面结合技术方案和图表详细说明本发明的具体实施例。以下实验所用的青蒿素b是系发明人从黄花蒿中提取分离所得。实施例1青蒿素b对缝隙连接的影响(1)parachuteassay1)细胞接种：取对数生长期的细胞，消化后用培养基重悬计数，将细胞密度调整至1.5×105cell/ml后接种于12孔板，置于37℃、5％co2培养箱中孵育48h进行后续实验。2)配制负载液：取12.5μlcalcein-am(1mg/ml)加入至487.5μl无血清培养基中吹打混匀，使calcein-am的终浓度为25μm。3)制备“供体细胞”：选择1孔细胞作为“供体细胞”，弃上清，pbs洗涤一次，加入上述已配制好的负载液500μl。12孔板置于37℃、5％co2培养箱中继续孵育30min。吸弃负载液，pbs洗涤3次，每次5min。胰酶消化“供体细胞”孔后离心，用无血清培养基重悬计数，将细胞浓度调整为500cell/ml，制成“donorcell”液。4)处理“受体细胞”：光学显微镜下观察高密度接种的细胞，挑选生长良好且有gj形成(细胞之间出现融合)的细胞作为“受体细胞”。在选择的“受体细胞”孔中分别加入已配制成不同药物浓度的“donorcell”液1ml/孔，于37℃、5％co2培养箱中培养4h。5)倒置荧光显微镜观察：利用倒置荧光显微镜对细胞间的gj功能进行观察，计数一个“供体细胞”周围含有calcein-am的“受体细胞”的数目，以其作为gj功能的指标。结果显示：随着青蒿素b作用浓度的增加由gj介导的细胞间的荧光传递也随之增强，且在6.25μm及12.5μm时青蒿素b显著增强了细胞间的荧光传递。相比对照组，浓度梯度的青蒿素b作用下荧光传递的功能分别增加了37.50％±1.53％、100％±2.08％(p<0.05)及187.5％±2.52％(p<0.01)，表明青蒿素b能够增强a549细胞间的gj功能且具有浓度依赖性(图1)。(2)westernblotting1)细胞接种及给药：细胞处于对数生长期且状态良好时进行消化离心，弃上清，完全培养基重悬细胞计数。将细胞悬液密度调整为1×105cells/ml接种至六孔板中，2ml/孔，置于37℃、5％co2的培养箱中孵育24h。24h后，吸弃旧培养液，加入不同浓度青蒿素b药液(青蒿素b浓度分别为3.125、6.25及12.5μm)2ml/孔，阴性对照组加入等体积完全培养基，置于37℃、5％co2细胞培养箱中作用48h。2)提取蛋白：吸弃六孔板中旧培养液，用预冷的pbs洗涤两次，每孔加入300μl的sds裂解液(含1％pmsf和1％na2vo3)冰浴裂解10min。裂解完成后将细胞裂解液转移至1.5mlep管，超声数秒，高速离心机设置4℃，12000rpm离心10min，取上清至已做好标记的对应新ep管，得总蛋白溶液。3)蛋白定量分析：根据bca蛋白定量试剂盒说明书进行操作。96孔板中加入待测样品及不同浓度梯度的标准品，对应每孔中再加入200μlbca工作液(a液：b液＝50:1，临用前混匀)，在37℃条件下孵育30min。利用酶标仪于562nm条件下检测od值，绘制标准曲线计算样品蛋白含量。调整各样品蛋白浓度成一致，加入5×buffer混匀后变性(100℃煮沸10min)，-20℃保存待用。4)制胶与上样：将洗净晾干的玻璃板对齐后垂直卡入制胶器中准备灌胶。根据目的蛋白分子量配制10-15％的分离胶(配方见tab.2.1)，蒸馏水压胶。分离胶凝好后配制5％浓缩胶(配方见tab.2.2)，滤纸吸干玻璃板中蒸馏水后补加浓缩胶至玻璃板顶部，插入梳子待浓缩胶凝固。将制好的胶放入灌有电泳液的电泳槽中，小心拔出梳子，根据蛋白浓度确定上样体积，每孔确保30-50μg的总蛋白上样量。table2.1theformulaofseparationgel(10ml)table2.2theformulaofconcentrationgel(4ml)5)电泳：上样完成后，接通电泳仪电源，在60v稳压下进行电泳，待彩虹marker出现分层后，将电压调整为110v，继续电泳，当指示蛋白样品的溴酚蓝跑至分离胶最底端时，即停止电泳。6)转膜：根据蛋白marker所对应的分子量区间，切取目的蛋白胶体，做好标记后置于转膜液中备用。剪取与胶块对应大小的pvdf膜(0.22μm/0.45μm)，放置甲醇中活化。制备转膜“三明治”(阴极—海绵—滤纸—凝胶—pvdf膜—滤纸—海绵—阳极)后装好转膜仪，设定转膜电流(200ma)与转膜时间(由目的蛋白的分子量确定)，转膜仪在恒定电流下冰浴转膜。7)封闭：转膜结束后将pvdf膜取出置于封闭液中，室温摇床封闭2h以上。8)一抗孵育：封闭完成后将条带用1×tbst溶液洗涤一次，之后放入已按最适比例稀释后的一抗溶液中，置于4℃冰箱中孵育过夜。9)洗膜：将pvdf膜取出至1×tbst溶液中，摇床上振荡洗涤三次，每次15min。10)二抗孵育：按适当比例稀释二抗，将洗涤后的pvdf膜放入二抗溶液中，室温摇床上孵育2-3h。11)洗膜：将pvdf膜取出至1×tbst溶液中，摇床上振荡洗涤三次，每次15min。12)显影：配制ecl发光液(a液：b液＝1：1)，滴加至pvdf膜上避光孵育2min，于暗室中用x胶片进行曝光、显影和定影。胶片定影后用水稍加漂洗之后烘干保存。13)条带分析：利用quantityone软件对显出条带进行灰度分析，以内参蛋白的表达量作为参照，得出不同样品目的蛋白的相对表达量。结果显示：青蒿素b能够显著性增强a549细胞中cx43总蛋白的表达，对照组cx43的表达量较低，随着青蒿素b作用浓度的增加，cx43的表达水平也不断上调，青蒿素b对cx43总蛋白表达的正向调节具有浓度依赖性(图2)。(3)qrt-pcr1)总rna的抽提：吸弃六孔板中旧培养液，pbs洗涤一次后加入trizol500μl/孔，轻轻吹打混匀后静止5min。裂解液转移至1.5mlrnasefreeep管中，于冰上保存。加入氯仿200μl/管，涡旋30s后室温静置5min。低温高速离心机设置4℃，14000rpm离心15min，小心吸取上层水相至另一批新rnasefreeep管。加入等体积异丙醇，颠倒混匀数次后室温静置5min。4℃，14000rpm离心15min弃上清，收集沉淀。用75％的灭酶乙醇洗涤沉淀两次，每次洗涤后于4℃，10000rpm离心5min，弃上清，超净台风干。干燥后的rna沉淀用depc水(25μl/管)溶解后至-80℃保存待用。2)rna纯度检测：从保存的rna样品中各取3μl至pcr小管，于核酸蛋白检测仪上进行检测。a260/a280的比值范围在1.8～2.1之间说明制备的rna无污染，可用于后续实验。3)逆转录反应(mrna→cdna)：根据罗氏逆转录试剂盒说明书进行操作。a.按下列组分在rnasefreepcr管中配制相应反应体系：b.将装有反应体系的pcr管放置pcr仪上设置65℃加热10min。c.在pcr管中添加剩余组分：d.用移液枪轻轻混匀逆转录试剂(勿涡旋)，稍离心后放入pcr仪。将反转录程序设定为25℃10min，55℃30min，85℃5min进行逆转录。4)引物序列设计如下：5)实时荧光定量：根据lifetechnologiessybr荧光定量试剂盒说明书进行操作。a.根据所要检测的基因及样品数确定总反应体积。单个反应体系组分添加如下(反应体系设定为10μl)：b.利用移液枪轻轻混匀体系后，分装转移至八连管中(平行设置三个复孔)，盖好管盖，简单离心后放入荧光定量pcr仪中进行监测分析。荧光定量pcr仪程序设置如下：c.反应完成后，拷取数据，利用bio-radcfxmanager软件进行分析。结果显示：不同浓度青蒿素b均能显著性增强cx43的mrna水平，且随着浓度的增大，cx43的mrna水平越高，表明青蒿素b对cx43从转录水平就开始调节，影响着cx43从转录到翻译的全过程(图3)。(4)细胞免疫荧光1)细胞接种及给药：将浓度为2×104cell/ml的细胞悬液接种至共聚焦皿，200μl/皿，置于37℃、5％co2的培养箱中孵育24h。24h后，吸弃旧培养液，加入不同浓度青蒿素b药液2ml/孔，阴性对照组加入等体积完全培养基，置于37℃、5％co2细胞培养箱中作用48h。2)固定与封闭：吸弃共聚焦皿中旧培养液，pbs洗涤一次后用4％多聚甲醛室温固定20min。经pbs洗涤三次，加入0.2％tritonx-100室温孵育5min后吸弃。利用5％bsatbst溶液对样品进行封闭(200μl/皿)，室温摇床孵育2h。3)一抗孵育：吸弃封闭液，加入已按比例稀释的一抗溶液(1:200)在4℃冰箱放置过夜。4)二抗孵育：pbs洗涤小皿三次，加入按适当比例稀释后的荧光二抗于37℃、5％co2的培养箱中孵育2h。5)核染及拍照：pbs洗涤小皿三次，加入dapi200μl/皿染核，于37℃细胞培养箱中作用30min。pbs洗涤小皿三次，每次5min，利用激光共聚焦显微镜观察并拍照。结果显示：随着青蒿素b浓度的增大，代表cx43蛋白的绿色荧光也随之增强，表明青蒿素b能够浓度依赖性的增强a549细胞膜上cx43蛋白的表达(图4)。实施例2青蒿素b与ddp体外联合作用的考察(1)mtt实验1)细胞接种：弃去培养瓶中旧培养液，pbs洗涤一次，加入胰酶消化后离心，离心机设置1000rpm离心5min，弃上清，加入完全培养基重悬，血球计数板计数。将细胞浓度调整至3×104cell/ml进行铺板，96孔板中每孔加入100μl细胞悬液，设置空白对照组，置于37℃、5％co2细胞培养箱中培养24h，使细胞贴壁生长。2)加药处理：24h后，弃上清，在相应96孔板区域加入已配制好的不同浓度药液，阴性对照组加入等体积完全培养基。96孔板放置于细胞培养箱中孵育72h。3)显色反应：避光条件下于96孔板中加入5mg/mlmtt溶液20μl/孔，置于细胞培养箱中孵育4h。小心吸弃上清，加入dmso溶液200μl/孔，置震荡仪上振摇10min，使甲瓒结晶充分溶解。4)比色检测：利用多功能酶标仪在570nm检测条件下对96孔板各孔吸光值(od值)进行检测。根据检测到的od值，计算ya-2对a549细胞的增殖抑制率，公式如下：细胞增殖抑制率(％)＝(对照组od值－实验组od值)/对照组od值×100％。结果显示：a.ddp对a549细胞具有较强的抗肿瘤活性，青蒿素b亦能浓度依赖性抑制a549细胞的增殖，但活性明显弱于ddp。青蒿素b与ddp对a549细胞作用72h的ic50值分别为24.06±13.74μm及2.49±1.24μm(图5及表1)。b.青蒿素b与ddp联合作用的q值范围均在0.85≤q≤1.15及q>1.15的范围之内，说明青蒿素b与ddp联合使用具有相加及协同作用。其中，青蒿素b浓度为6.25μm及ddp浓度为2.5μm时q值最大，表明该浓度下两药联合的协同作用最强(图6及表2)。(2)annexinv-fitc/pi双染实验1)细胞接种：对数生长期的细胞用胰酶消化后离心计数，细胞悬液浓度调整为1×105cell/ml进行铺板，六孔板中每孔加入2ml细胞悬液，置于37℃、5％co2细胞培养箱中培养24h。2)加药处理：实验设置四组分别为青蒿素b单独作用组(6.25μm)、ddp单独作用组(2.5μm)、青蒿素b与ddp联合作用组及对照组。联合作用组对应孔加入青蒿素b与ddp药液各1ml混匀，单独作用组加入青蒿素b或ddp药液2ml/孔，对照组加入等量培养基，置于细胞培养箱中孵育48h。3)收集细胞：药物作用细胞48h后即可进行处理。收集含有死细胞的上清，用不含edta的胰酶消化细胞与上清一同离心，离心机设置1500rpm离心5min，弃上清收集沉淀。4)洗涤：预冷的pbs洗涤细胞三次后，加入200μlbindingbuffer重悬混匀转移至对应ep管中。5)染色：于单细胞悬液中加入annexinv-fitc染色液5μl/管混匀，避光孵育15min，加入pi染液5μl/管同等条件下孵育反应5min。6)检测：将染色完成后的样品用流式细胞仪进行检测，待测样品保证每管细胞数不少于10000个。在检测结果中，q1区表示的是坏死或损伤细胞所占比例，q2区是凋亡晚期细胞所占比例，q3区为正常活细胞比例，q4区则为凋亡早期细胞的比例。结果显示：青蒿素b与ddp单独及联合处理a549细胞48h后的早期凋亡率分别为11.44％、6.61％以及22.53％，表明青蒿素b与ddp联合用药之后诱导a549细胞凋亡的作用要强于两者单独用药(图7)。实施例3青蒿素b与ddp体内联合作用的考察1)肿瘤模型的建立：胰酶消化处于对数生长期的a549细胞，收集于15ml的离心管中；1000rpm离心10min，弃上清，留取细胞沉淀；pbs洗涤一次，1000rpm离心10min，弃上清，加入pbs溶液重悬，轻轻吹打混匀成单细胞悬液；利用血球计数板计数，调整细胞悬液浓度至5×106cell/ml；超净台中用75％酒精消毒裸鼠右侧腋窝，皮下注射0.2ml细胞悬液/只。裸鼠接种肿瘤细胞后每天观察成瘤情况，隔天称重并测量瘤体积，当瘤体积达100mm3时，进行随机分组给药。2)动物分组及给药：给药后每天观察裸鼠摄食、饮水和精神状态等变化，隔天记录裸鼠体重并用游标卡尺测量裸鼠肿瘤的长(a)短(b)径，计算瘤体积(公式：v＝a×b2/2)3)相关指标的计算及检测：a.抑瘤率(％)＝(空白组瘤重-给药组瘤重)/空白组瘤重×100％b.脾脏指数＝小鼠脾重(mg)/小鼠体重(g)肾脏指数＝小鼠肾重(mg)/小鼠体重(g)肝脏指数＝小鼠肝重(mg)/小鼠体重(g)c.相对肿瘤体积(relativetumorvolume，rtv)＝vt(给药后每一次测量所得肿瘤体积)/v0(给药时测量所得肿瘤体积)d.相对肿瘤增殖率t/c(％)＝trtv(治疗组rtv)/crtv(阴性对照组rtv)×100％相对肿瘤增殖率是药物抗肿瘤活性的评价指标，疗效评价标准：t/c％>40％为无效；t/c％≤40％，并经统计学处理p<0.05为有效。e.tunel及肝肾生化检测：由试剂公司进行检测。结果显示：a.青蒿素b与ddp联合用药组的瘤组织坏死程度要大于单独用药组且没有明显的肝肾毒性(图8-9及表3-5)。b.ddp与青蒿素b联用能够有效抑制裸鼠异种移植瘤的增殖并延缓顺铂毒性的发生(图10-11及表6)。c.tunel检测各组间瘤组织的凋亡情况，同一个视野下联合用药组的凋亡面积大于单独用药组，见图12。实施例4青蒿素b与ddp体内外联合对cx43的调节机制(1)westernblotting(体外)1)细胞接种及给药：细胞处于对数生长期且状态良好时进行消化离心，弃上清，完全培养基重悬细胞计数。将细胞悬液密度调整为1×105cells/ml接种至六孔板中，2ml/孔，置于37℃、5％co2的培养箱中孵育24h。24h后，吸弃旧培养液，加入对应浓度药液2ml/孔，阴性对照组加入等体积完全培养基，置于37℃、5％co2细胞培养箱中作用48h。2)其它步骤同实施例1中(2)。结果显示：不同浓度青蒿素b作用a549细胞48h后，jnk、erk以及p38的磷酸化形式均有所上调，且在青蒿素b浓度为12.5μm时，p-jnk、p-erk以及p-p38的表达量最高，表明青蒿素b调节cx43的表达可能与mapks相关信号通路的活化有关；青蒿素b与顺铂体外联用时同样能对cx43的表达进行调节，且正向调节cx43的机制涉及mapks信号通路的激活(图13-14)。(2)westernblotting(体内)1)瘤组织蛋白提取：从-80℃冰箱中取出瘤组织至预冷的研钵中，倒入适量液氮进行快速研磨，期间不断加入液氮直至将瘤组织研磨成细小粉末。每组瘤组织粉末各称取50mg至六孔板中用以提取蛋白，于每孔加入含有1％pmsf及1％na2vo3的ripa裂解液1ml，冰上裂解30min后超声5次，每次5s，低温高速离心机14000rpm离心10min，取上清，得总蛋白溶液。2)bca蛋白定量试剂盒对瘤组织所提蛋白进行定量分析，根据定量分析结果将各样品蛋白浓度调成一致→制胶→电泳(60v恒压至蛋白跑至分离胶，110v恒压至蛋白跑至分离胶底部)→转膜(200ma恒流，根据蛋白分子量大小确定转膜时间)→封闭(室温摇床2h以上)→一抗孵育(4℃冰箱过夜)→洗膜(摇床上振荡洗涤3次，每次15min)→二抗孵育(室温摇床孵育2-3h)→洗膜(摇床上振荡洗涤3次，每次15min)→显影及条带分析。结果显示：青蒿素b组与联合用药组cx43、p-erk、p-jnk及p-p38的蛋白表达水平均高于对照组和ddp组，表明青蒿素b单独或与ddp联合作用均能够增强a549细胞实体瘤中cx43的表达且调节机制与mapks信号通路的活化有关(图16)。(3)免疫组化检测(由试剂公司进行检测)结果显示：模型组与ddp单独用药组几乎未见明显的棕黄色及褐色颗粒，而青蒿素b组及联合用药组则可见大片棕黄色及褐色颗粒的区域，进一步表明青蒿素b能够增加小鼠肿瘤组织中cx43的表达(图15)。当前第1页12当前第1页12