用于3D打印的光敏复合生物墨水及其制备方法与流程

本发明涉及生物材料、含细胞的水凝胶技术领域，具体涉及一种用于3d打印的光敏复合生物墨水及其制备方法。

背景技术：

3d打印是一项新兴的制造技术，该技术指利用三维扫描等手段，建造出结构的三维模型，再通过材料的精确堆积，快速打印出各种结构。目前，金属材料和塑料等传统材料的打印技术，已经广泛的应用于生产和生活之中。生物打印技术特指使用生物相容性的材料构建打印结构，以该结构替代人体的组织或器官，达到精准快速的个性化修复的目的。

目前，已有产品如脑膜、骨缺损替代物等应用于临床中。目前，生物打印材料主要分两类，合成高分子如pcl、plga，此类材料虽然成型良好，但降解缓慢，有报道称会加重炎症反应，且不能负载细胞；天然高分子如海藻酸钠、壳聚糖、透明质酸、明胶等能够负载细胞，但其固化和成型较差，往往难以得到良好的打印结构。含细胞的打印组织移植能够促进组织的再生，已经得到了广泛的认可。部分生物材料具有良好的负载细胞能力，表现为细胞的高成活率和高伸展性，如胶原、纤维蛋白原。但二者由于黏度低，均无可打印性能。

光敏明胶是近年来广泛使用的打印材料，虽然其可打印性能良好，但其凝胶网络过于紧密，细胞增殖受限。除此之外，其传统合成方法改性剂用量大，制备过程气味大，产率低、透析缓慢。因此，开发一种具有一定黏度可打印的、其中的细胞有良好增殖能力和伸展性能的打印材料极为迫切。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于3d打印的光敏复合生物墨水及其制备方法，本发明将不同比例的胶原纤维加入丙烯化光敏明胶中，改变了光敏明胶的凝胶结构，提高了细胞的伸展和增殖能力，所制备的基于光敏明胶和胶原纤维的骨修复凝胶具有良好可打印性和生物活性，且该凝胶具有粘附位点，有利于创面和凝胶外部的结合，也有利于凝胶内部细胞的伸展和增殖。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种用于3d打印的光敏复合生物墨水的制备方法，该方法包括如下步骤：

(1)胶原溶液的制备：

以ⅰ型胶原为原材料，将其溶于浓度0.05-0.5mol/l的酸溶液中，获得ⅰ型胶原含量为1-10mg/ml的胶原溶液；

(2)胶原纤维制备：

在步骤(1)所得胶原溶液中加入0.1mol/l的pbs溶液、1mg/ml的酚红溶液和1mol/l氢氧化钠溶液，通过调整加入量将溶液中和至红色，得到中性胶原溶液；然后将所得中性胶原溶液倾倒入pbs溶液中，于20-37℃水浴中磁力搅拌1-4小时；所得物料经离心分离后，弃去上清液，所得沉淀即为胶原纤维；

(3)改性光敏明胶的制备：

称取一定量的明胶加入pbs缓冲液中，加热至60℃并搅拌至明胶完全溶解，降温至50℃，得到明胶溶液；将甲基丙烯酸酐的丙酮溶液逐滴滴入明胶溶液中，并调节其ph值稳定为8-9后，继续反应1-5小时；将反应产物用大体积蒸馏水透析，透析袋截留分子量为8000da，透析3天后，冻干，得到改性光敏明胶；

(4)将步骤(3)所得改性光敏明胶加入0.01mol/l的pbs溶液中，制备成改性光敏明胶含量为0.05-0.4g/ml的改性光敏明胶溶液，加入光引发剂后，调节溶液ph值为7后，所得混合物料采用孔径0.22μm的微孔滤膜过滤后，获得含光引发剂的改性光敏明胶溶液，备用；

(5)将步骤(2)制备的胶原纤维与步骤(4)制备的含光引发剂的改性光敏明胶溶液按照10:1-1:10的重量比例混合，所得混合物料中加入细胞悬液，即获得所述用于3d打印的光敏复合生物墨水。

上述步骤(1)中，所述ⅰ型胶原为牛胶原、鼠尾胶原或猪胶原；所述酸溶液为乙酸溶液、盐酸溶液或丙二酸溶液。

上述步骤(2)中，所得中性胶原溶液倾倒至pbs溶液中时，所用pbs溶液的浓度为0.001-0.05mol/l，所用pbs溶液的体积为中性胶原溶液体积的5-20倍；所述磁力搅拌的速度为200-5000转/分钟。

上述步骤(3)中，所述甲基丙烯酸酐的丙酮溶液是将改性剂甲基丙烯酸酐按照甲基丙烯酸酐：丙酮＝3：10的体积比例溶解于丙酮中获得。

上述步骤(4)中，所述光引发剂为苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(lap)或2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(i2959)；在改性光敏明胶溶液中加入引发剂，溶液中改性剂的含量为0.5-5mg/ml。

上述步骤(3)和(4)中，采用1mol/lnaoh溶液调节溶液ph值。

上述步骤(5)中，所述细胞悬液的加入体积为混合物料体积的10％。

利用所述方法制备了用于3d打印的光敏复合生物墨水，采用该生物墨水用于3d打印时，采用365-405nm波长、强度1-100mw/cm²的光照射5-200秒，即可得到促分化的复合凝胶。

本发明设计机理如下：

使用一种新的方法制备丙烯化光敏明胶，将改性剂以丙酮为溶剂，并调节反应体系的ph值，提高了丙烯化明胶的产率，降低了交联剂的用量，降低了反应时间和透析时间，节省了合成成本。本专利同时发明了一种制作胶原纤维的新方法，可以控制胶原纤维的尺度，在复合水凝胶中显示出良好的促分化效果。传统的丙烯化光敏明胶具有一定的缺陷，其交联后的分子网络过于紧密，使细胞伸展受限。已经有研究报道使用添加peo或胶原酶等方法，改变其网络结构，以提高细胞的伸展能力。本发明将不同比例的胶原纤维加入丙烯化光敏明胶中，改变了光敏明胶的凝胶结构，提高了细胞的伸展和增殖能力。同时，有研究表明，胶原纤维具有促进干细胞向成骨细胞分化的能力。实验表明，本专利所发明的胶原纤维-光敏明胶材料能够显著促进干细胞的成骨分化，并具有相当的可打印性能。相较于传统的水凝胶，本发明所述的打印墨水成分均来自哺乳动物，具有良好的生物活性，且该凝胶具有粘附位点，有利于创面和凝胶外部的结合，也有利于凝胶内部细胞的伸展和增殖。

本发明的优点和有益效果如下：

1、本发明所述胶原纤维的制作方法，能够得到不同结构尺度的胶原纤维，有利于不同功能强度的水凝胶体系的设计。胶原是一种生物相容性极高的材料，将胶原纤维引入光敏明胶体系后，提高了凝胶的生物相容性。此外，纤维错综分布于凝胶中，破坏了明胶过于紧密的网络结构，更加有利于细胞的伸展和增殖。

2、本发明改进的光敏明胶制作方法中，将甲基丙烯酸酐溶于丙酮中，并调节ph至9。其中丙酮和水和甲基丙烯酸酐均混溶，传统方法直接加入甲基丙烯酸酐，反应过程始终可见不与水混溶的酸酐存在。改进后的方法反应效率提高，同样取代度下，酸酐的用量减少。酸酐和氨基在ph为8-9时，反应效率高，改进法提高了酸酐的反应效率。综上，甲基丙烯酸酐目前较为昂贵，改进法减少了酸酐的用量，减少了成本。此外，较少的酸酐用量，能够大大缩短透析的时间，延长透析袋的使用寿命，并节约大量蒸馏水。

3、本发明所述生物墨水成分来源于哺乳动物，具有良好的生物相容性、可降解性，且自带粘附位点，非常适合细胞的生长、粘附、增殖。

4、本发明所述生物墨水可通过调节胶原纤维和光敏明胶的比例，以及控制打印温度，得到不同力学性能的打印材料，适合3d打印的成型，且可通过光照快速固化。

5、使用诱导培养基在二维环境下诱导间充质干细胞至成骨细胞，时间一般为21天。而在本发明所述墨水中，仅需10天，间充质干细胞即可分化为成骨细胞。本发明所述墨水具有促干细胞向成骨细胞分化的能力。

附图说明

图1为本发明光敏复合生物墨水及3d打印结构；其中：(a)骨髓间充质干细胞在添加胶原纤维的凝胶中的7天的生长状态，染料为钙黄绿素；(b)骨髓间充质干细胞在未添加胶原纤维的凝胶中的7天的生长状态，染料为钙黄绿素；(c)打印骨支架诱导10天后碱性磷酸酶染色；(d)打印骨支架诱导10天后茜红素染色。

具体实施方式

以下通过实施例详述本发明。

以下实施例中，胶原溶液以自提牛跟腱胶原为原材料制备，所述牛跟腱胶原的提取过程如下：

(1)将胃蛋白酶加入浓度为0.1-0.5mol/l的乙酸溶液中，混合均匀后即获得胃蛋白酶的乙酸溶液；该胃蛋白酶的乙酸溶液中胃蛋白酶的含量为1-5mg/ml。

(2)将牛跟腱溶解于含有胃蛋白酶的乙酸溶液中，搅拌72h后，依次进行盐析和乙酸透析过程，透析袋截留分子量为3000-10000da，得到所述牛跟腱胶原。所述盐析过程采用4mol/l的nacl溶液，所述透析过程采用0.1-0.5mol/l的乙酸。该过程均为无菌操作。

实施例1：

胶原溶液的原料为自提牛跟腱胶原，经过脱脂、酶解、盐析等步骤获得，将牛跟腱胶溶解于浓度为0.1mol/l乙酸溶液中，制备得到6mg/ml的酸性胶原溶液。

将上述胶原溶液8.09ml、10倍浓度pbs1ml、1mol/l氢氧化钠0.81ml、0.1ml1mg/ml的酚红混合。此时，将溶液倾倒至10倍体积的0.01mol/l的pbs溶液中，于37℃水浴中磁力搅拌1小时，搅拌转数为1000转/分钟。将上述溶液以10000g离心1h，弃去上清，沉淀即为胶原纤维。以上步骤均为无菌操作。

采用改进的光敏明胶合成方法：称取10g明胶，溶于100ml的pbs中，加热至60度，搅拌至完全溶解，降温至40度，得明胶溶液。将甲基丙烯酸酐3ml加入至10ml丙酮中得甲基丙烯酸酐的丙酮溶液，将丙酮溶液逐滴加入明胶溶液中，并使用1mol/l氢氧化钠溶液维持ph至9。ph值稳定后，继续反应1小时。随后，用蒸馏水透析，透析袋截留分子量为8000da，透析3d后，冻干。

将上述明胶使用0.01mol/l的pbs制备成的明胶溶液，加入3mg/ml的光引发剂苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐。调ph为7，0.22μm孔径滤膜过滤后备用。

将上述明胶溶液和胶原纤维，以1:1的质量比混合，加入十分之一体积的浓度为10⁷/ml的间充质干细胞细胞悬液。5mw/cm²365nm光照射30秒，即可得含细胞的复合凝胶。另设不添加胶原纤维的对照组，其余配比与实验组相同。dmem低糖培养基培养10天后，使用钙黄绿素对两组凝胶中的细胞染色，其中，添加胶原纤维的凝胶为图1(a)，不添加胶原纤维的凝胶如图1(b)。由图可见，添加胶原纤维的凝胶中的骨髓间充质干细胞伸展能力更强。

实施例2：

胶原溶液的制备原料为自提牛跟腱胶原，经过脱脂、酶解、盐析等步骤，得到8mg/ml的酸性胶原溶液，其溶剂为乙酸溶液，浓度为0.1mol/l。将上述胶原溶液8.09ml、10倍浓度pbs1ml、1mol/l氢氧化钠0.81ml、0.1ml1mg/ml的酚红混合。此时，将溶液倾倒至5倍体积的2倍浓度pbs溶液中，于25℃水浴中磁力搅拌2小时，搅拌转数为1000转/分钟。将上述溶液以10000g离心1h，弃去上清，沉淀即为胶原纤维。以上步骤均为无菌操作。采用改进的光敏明胶合成方法。

称取10g明胶，溶于100ml的pbs中，加热至60℃，搅拌至完全溶解，降温至40℃，得明胶溶液。将甲基丙烯酸酐2ml加入至10ml丙酮中得甲基丙烯酸酐的丙酮溶液。将丙酮溶液逐滴加入明胶溶液中，并使用1mol/l氢氧化钠溶液维持ph至9。ph值稳定后，继续反应3小时。随后，用蒸馏水透析，透析袋截留分子量为8000da，透析3d后，冻干。将上述明胶使用0.01mol/l的pbs制备成的明胶溶液，加入2mg/ml的光引发剂苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐。调ph为7，0.22μm滤器过滤备用

将上述明胶溶液和胶原纤维，以2:1的质量比混合，加入十分之一体积的浓度为10⁷/ml的间充质干细胞细胞悬液。可制得含细胞的生物墨水。将该墨水置于3d打印机喷头中，喷头温度22℃，底板温度4℃，执行水凝胶-pcl复合打印程序，打印完成后，使用5mw/cm²365nm光照射打印物30秒，放入培养基中。以成骨诱导培养基培养10天后，碱性磷酸酶染色结果如图1(c)，其中，不透明部分为pcl支撑，使用成骨培养基诱导10天，使用试剂盒进行碱性磷酸酶染色，可见干细胞已经向成骨细胞分化；茜红素染色结果如图1(d)，其中不透明部分为pcl支撑，使用成骨培养基诱导10天，使用茜红素染色，可见干细胞已经向成骨细胞分化。结果可见干细胞部分分化为成骨细胞。