基于具有眼睛保护作用的植物来源有效成分的组合物的制作方法
近年来，植物来源的多酚化合物由于其充当保护剂的能力而受到特别关注，所述保护剂涉及由于衰老引起的视力障碍以及视觉病理学状态(visualpathologies)的治疗和/或预防。其中，许多研究涉及花色素(anthocyanoside)化合物，自然界中各种植物中存在的色素物质(越桔(bilberries)、桑椹(mulberries)、黑莓、橙子、黑土豆(blackpotatoes)、黑玉米(blackcorn)等)。
在60年代和80年代之间，对摄入富集花色素苷(anthocyanin)的食物对视力健康产生的有益影响进行了各种科学研究(kaltw.等，2010)。
到目前为止所获得的结果，即使有时是有争议的，也已经显示出这些物质如何作用于视觉中和不同视觉退化中涉及的一些分子生物化学机制。
在matsumotoh.等人进行的体外研究(matsumotoh.等人，2003)中，具有不同化学结构的花色素化合物在视紫质的再生中进行了评价，视紫质是存在于杆状体中的光敏蛋白，其通过经历从11-顺式-视黄醛形式到11-反式视黄醛形式的构象变化，激活生化事件的级联和负责视觉神经冲动的介质。根据matsumotoh.等人获得的结果，已经观察到在各种花色素化合物中，诸如花青素-3-o-葡糖苷的葡糖基化形式诱导视紫质再生动力学的更大增加，从而改善视觉能力和在黑暗中的适应(nakaishih.等人，2000)。此外，使用细胞模型进行的大量体外研究已经证明了从各种食物来源获得的花色素化合物对由视网膜色素上皮细胞的氧化应激(stress)诱导的损伤的强保护作用(wangy.等人，2015；liuy.等人，2012；sunm.等人，2015)。
事实上，已知视网膜色素上皮细胞(rpe)发挥视网膜活性所必需的功能，并且对眼组织中产生的氧自由基物种引起的损伤特别敏感，其后果可导致各种眼病、例如老年性退行性黄斑病、视网膜脱离或视网膜营养不良。
花色素化合物、特别是花青素-3-o-葡糖苷所产生的对预防和治疗眼睛变性的作用似乎也与这些化合物对另一种重要的眼组织，视网膜神经节细胞所发挥的保护作用有关。
tanaka等人进行的体外和体内研究(tanakaj.等，2013)表明，用来自含有花青素-3-o-葡糖苷的黑米(blackrice)的花色素提取物处理，能够抑制由衣霉素处理诱导的细胞自由基物种的过量产生，并通过抑制半胱天冬酶-3活化过程增加细胞生存力，从而减少由于各种眼病理学状态，例如青光眼、糖尿病性视网膜病变、视网膜缺血导致的潜在细胞死亡(kaltw.等，2010)。
然而，有些研究报告了文献中相互矛盾的数据。事实上，花色素对视力的影响似乎与剂量有关。
根据levyy.&glovinskyy.在一项对16名健康志愿者的研究中，剂量为从蓝莓浆果中提取的12、24和36mg花色素的片剂的给药对改善中间视野或暗视野的中央视觉没有任何效果。类似地，在对18名健康志愿者的研究中，zadokd.等人。确认施用12mg和24mg蓝莓的花色素不会导致视觉改善。muthe.r.等人也证实了花色素(160mg在25％滴定的蓝莓提取物)给药后在对比敏感性和暗视觉的双盲研究中缺乏效果。
毛蕊花苷是一种多酚类化合物，属于类苯基丙烷类(phenipropanoids)，存在于多种植物物种中，如毛蕊花(mullein)和橄榄树，具有已知的抗炎、抗氧化、抗微生物、抗病毒活性等。
最近，只有少数体内和临床研究评估了这种生物活性化合物对视力的潜在保护作用。所得结果表明，该化合物在口服给药后能够保护组织和眼液不受自然氧化过程的影响，而且能够局部促进豚鼠角膜上皮细胞诱导的病变的瘢痕形成(moscam.等，2014；ambrosonel.等，2014)。
现在，就保护作用和视网膜上皮细胞的细胞生存力增加而言，本发明的作者已经鉴定出花青素-3-o-葡糖苷和毛蕊花苷之间令人惊讶的协同作用。
本发明的一个目的涉及用于预防和/或治疗影响视网膜的视力障碍或病理学状态的营养保健组合物或药物组合物，所述营养保健组合物或药物组合物包含花青素-3-o-葡糖苷和毛蕊花苷或植物提取物和/或赋形剂，各自富集花青素-3-o-葡糖苷和毛蕊花苷作为活性成分连同生理学上可接受的辅助剂(adjuvant)。
存在于本发明组合物或组合中的两种活性成分或富集它们的植物提取物的毛蕊花苷：花青素3-o-葡糖苷相互重量比范围为1:1至1:20，优选相互重量比范围为1:4至1:10。
本发明的另一个目的涉及花青素-3-o-葡糖苷和毛蕊花苷或富集花青素-3-o-葡糖苷和毛蕊花苷的植物提取物的组合，用于同时、顺序或分开用于预防和治疗影响视网膜的视力障碍或疾病。
本发明特别涉及花青素-3-o-葡糖苷和毛蕊花苷的组合，其中两种活性成分或两种富集的植物提取物组合施用，保持相互重量比范围为1:1至1:20，优选相互重量比范围为1:4至1:10。
富集花青素-3-o-葡糖苷的植物提取物优选地选自黑米(稻(oryzasatival.))、红橙(甜橙(citrussinensisl.osbeck))、黑桑(morusnigral.)、黑莓(榆叶悬钩子(rubusulmifoliuss.))和黑玉米(blackcorn)(玉蜀黍(zeamaysl.))的提取物，或含有花色素物质的其他植物来源。
根据本发明，也可以使用黑米的杂交变种。
根据本发明，富集花青素-3-o-葡糖苷的植物提取物是指花青素-3-o-葡糖苷含量为2-30％(按重量份计)(w/w)的提取物。
富集毛蕊花苷的植物提取物优选但不限于选自以下的提取物：毛蕊花(毛蕊花属(verbascuml.))、橄榄树(油橄榄(oleaeuropaeal.))或含有毛蕊花苷的其他植物来源。根据本发明，富集毛蕊花苷的植物提取物是指毛蕊花苷含量为0.2-20％(按重量份计)(w/w)的提取物。植物提取物各活性成分的富集优选通过纳米超滤技术或使用吸附树脂进行。
根据本发明的富集毛蕊花苷或花青素-3-o-葡糖苷的植物提取物可以是液体或粉末形式(即干燥的形式或冷冻干燥的形式)。
所述影响视网膜的视力障碍可选自暗视觉、眩光、视网膜光敏性的改变，而所述影响视网膜的视觉病理学状态可选自由黄斑病、视网膜病变、由于衰老和营养不良引起的视网膜变性。所述视觉病理学状态优选为视网膜色素变性、糖尿病性视网膜病变或老年性退行性黄斑病。显然，根据本发明的组合或组合物可用作辅助剂，其用于与特定药物疗法相关的所述视觉病理学状态的治疗。
所述组合物或组合优选适合口服给药，甚至更优选呈口服溶液、口服乳液、口服悬浮液、胶囊、片剂或粉末形式。对于口服给药，两种提取物的优选总浓度范围可以在最终组合物的10％重量至90％重量中变化。
存在于根据本发明的组合物或组合中的活性成分可以在以下每日剂量范围内在一次或多次给药中口服给药：
花青素-3-o-葡糖苷：30mg/天至500mg/天，优选100mg/天
毛蕊花苷：10mg/天至500mg/天，优选25mg/天。
现在根据一些优选实施方案，特别参考附图，描述本发明，这仅用于说明性的目的但非限制性的目的，其中：
-图1显示了与用h2o2处理后和在单独和相互组合的花青素-3-o-葡糖苷提取物、毛蕊花苷提取物存在下视网膜色素上皮细胞的细胞生存力(mtt测定)百分比相关的直方图。
作为实例，但不限制本发明，下文提供了根据本发明的组合物的一些实例及其用途。
实施例1:富集花青素-3-o-葡糖苷和毛蕊花糖苷的提取物的制备
下面描述了示例性的提取方法，用于获得富集花青素-3-o-葡糖苷的花色素植物提取物：
步骤a：(从黑米或黑玉米中提取)：将通过磨损谷物的外表面而单独获得的全谷粒米或玉米或着色的果皮用含有盐酸(0.1％hcl)的在酸ph的水溶液或水醇溶液(10-60％)、在室温下浸渍。浸渍过程也可以借助索氏提取系统实现。
步骤b：(从黑米或黑玉米中提取)：用新的提取溶剂在相同的植物基质上进行第二次提取，以有利于回收存在的活性物质。
步骤c：将获得的提取物在不高于50-60℃的温度下在真空下回收和浓缩，直至完全除去有机溶剂。
步骤d：(来自红橙汁或黑莓汁或桑椹汁的花色素物质或从步骤c获得的来自黑米或黑玉米的提取物的纯化)：通过以下来纯化花色素化合物：将从步骤c获得的汁液或液体产物通过超滤系统(最佳截止10,000道尔顿)和随后通过纳米过滤系统浓缩(建议截止200道尔顿)。
步骤e：通过以下分离花色素物质：在大孔吸附树脂amberlitexad-7或另外的类似的吸附树脂上通过从步骤d获得的产物，采用在酸性ph的含有盐酸(0.1％hcl)的水溶液或水醇溶液(50-90％)洗脱。
步骤f：随后使用麦芽糖糊精或其他技术支持物通过喷雾干燥或冷冻干燥进行干燥。
获得的花色素提取物具有其主要成分花青素-3-o-葡糖苷的含量范围为2-30％w/w。
下面描述示例性提取方法，其用于获得富集毛蕊花苷的多酚植物提取物：
步骤a：(从植物基质中提取)：用水溶液或水醇溶液(10-60％)，ph值约4-5的酸，在40-60℃的温度下浸渍新鲜或干燥的基质。浸渍过程也可以借助索氏提取系统实现。
步骤b：用新的提取溶剂在相同的植物基质上进行第二次提取，以有利于回收存在的活性物质。
步骤c：获得的提取物在不高于50-60℃的温度下在真空下回收和浓缩，直至完全除去有机溶剂。
步骤d：通过以下来纯化类黄酮化合物：在大孔吸附树脂amberlitexad-7或另外的类似的吸附树脂上通过获得的液体产物，采用含有盐酸(0.1％hcl)的在酸性ph的水溶液或水醇溶液(30-70％)洗脱。
步骤e：获得的提取物在不高于50-60℃的温度下在真空下浓缩，直至完全除去有机溶剂，然后通过使用合适的技术支持物，例如麦芽糖糊精的喷雾干燥或冷冻干燥进行干燥。
获得的多酚提取物具有其主要成分毛蕊花苷的含量范围为0.2-20％w/w。
实施例2：制剂实施例
以下举例说明口服使用的不同制剂(片剂、胶囊、粉末)，其包含具有不同相互重量比的花色素提取物(花青素-3-o-葡糖苷)和多酚提取物(毛蕊花苷)的组合。
i)口服使用的制剂实施例
-胶囊(毛蕊花苷：花青素-3-o-葡糖苷提取物之间的比例为1:4)
制备方法
根据几何稀释(geometricdilution)的规则将提取物与乳糖混合，然后在胶囊中进行分配。
制备方法
根据现有技术，混合花色素和多酚提取物，并使用柠檬酸酸化的制粒溶液和阿拉伯胶进行流化床制粒。将颗粒与抗结块剂(滑石粉、二氧化硅、硬脂酸镁)混合；使用压片机对混合物进行压缩。用漆橡胶和滑石应用片剂的第一涂层，并且用改性预胶化淀粉、甘油和滑石应用随后的涂层。
-口服使用粉末(毛蕊花苷：花青素-3-o-葡糖苷提取物之间的比例为1:20)
制备方法
根据几何稀释的规则将提取物与麦芽糖糊精混合，然后在小药囊(sachet)或袋中进行分配。
实施例3：使用体外细胞模型研究花色素提取物(花青素-3-o-葡糖苷)和多酚提取物(毛蕊花苷)的保护活性
该研究的目的是体外评价单独和相互组合的花色素植物提取物(花青素-3-o-葡糖苷)和多酚提取物(毛蕊花苷)对视网膜色素上皮细胞的保护作用。
实验方案提供了能够评估提取物对经受氧化应激状态的视网膜上皮细胞所施加的保护作用的体外细胞模型的用途。
材料和方法
视网膜色素上皮(rpe)由一层色素细胞组成，其牢固地附着于下面的脉络膜和上面的视觉视网膜细胞，具有维持视网膜的生理解剖功能状态所必需的各种功能。各种视觉病理学状态，例如视网膜色素变性(retinitispigmentosa)，由于生理衰老过程引起的视网膜变性，黄斑病和营养不良，衍生自并且可以源自视网膜色素上皮的改变的功能。
arpe-19细胞系(atcccrl-2302)是用作体外研究模型的人视网膜色素上皮(rpe)细胞系。
将这些细胞在5％co2气氛中于37℃在dulbecco改良eagle培养基(dmem)-hamf12中培养，加入10％(v/v)胎牛血清(fbs)和1％(v/v)青霉素/链霉素抗生素。
细胞生存力测定
将rpe细胞用胰蛋白酶消化，在血细胞计数器中计数，在孔上铺板用于mtt测定，并且在37℃下在5％co2气氛中孵育24小时后，将它们用单独使用的每种提取物或在一个组合中使用的每种提取物处理1小时(根据下表1中所示)。随后在37℃下加入0.3mm的h2o2持续24小时。
表1
a：花青素-3-o-葡糖苷提取物；v：毛蕊花苷提取物；c/v：两种提取物的组合
在用h2o2处理后，通过四唑鎓盐的比色测定测量细胞生存力，所述测定评估细胞通过线粒体琥珀酸脱氢酶还原3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓(mtt)的溴化物的能力。mtt进入细胞并进入线粒体，在那里它被还原成有色且不溶的产物甲
结果
从mtt测定获得的数据显示，当单独使用时，花色素提取物(花青素-3-o-葡糖苷)(c)和多酚提取物(毛蕊花苷)(v)能够保护人视网膜色素上皮(rpe)细胞(表1)的生存力免受由h2o2处理诱导的损伤。
用组合使用的两种提取物(c/v)处理rpe细胞引起细胞生存力的显著增加，具有协同型效应(参见图1和表1)。下表2显示了平均细胞增殖值(mtt)，其表示为相对于对照(ctrl)的细胞生存力百分比和与用h2o2处理相比的细胞生存力百分比(rpe)。
表2
*p<0.05vsc和v
实施例4：对健康志愿者的临床研究
在本双盲随机研究中，说明了体内结果，其在口服给药含有100mg纯化的花青素(cyanidin)和25mg毛蕊花苷的制备物后获得，以验证视力、视网膜敏感性和对比视力(contrastvision)的改善。
患者
招募了50名健康志愿者，在确定没有眼病后，通过以下测试选择年龄为30至40岁之间、20名男性和20名女性(平均年龄36岁)的正视者(球面镜片等值0.50屈光度)：
-前段和眼底的裂隙灯检查
-压平眼压测量法
-瞳孔缩小和睫状肌麻痹中的折射
-6米处的未矫正视敏度，采用亮度为400勒克司(lux)的sbisà计算机化试视力字体(optotype)
-6米处的对比视敏度，采用亮度为400勒克司的pelli-robson图表sbisà计算机化试视力字体。
患者分为两组：20名男性和20名女性。将20名女性患者分别分为两组，a组和b组。
a组的20名患者用作对照，因此用含有乳糖(惰性物质)的胶囊制剂治疗4周。
b组的20名患者用含有花青素-3-o-葡糖苷(100mg)和毛蕊花苷(25mg)的胶囊制备物治疗4周。
材料和方法
两组患者接受三组测试。
1)视觉测试。治疗前后的未矫正和对比视敏度，用于评估视敏度的可能变化。
2)对视觉应激抵抗力(resistance)的测试。眩光后测量眩光时间和恢复时间，用于评估适应视觉应激的视网膜能力。
3)视网膜敏感性测试。用白色和蓝黄色刺激检查中央视野。
测试对视觉应激抵抗力
为了评估患者光应激后的视力，在卫生部提供的用于发放驾驶执照的眩光后，对患者进行眩光测试和恢复测试。
在给药根据本发明的组合物之前和之后4周进行以下测试：
-使用标准化的sbisà试视力字体进行眩光测试
-使用标准化的sbisà试视力字体进行眩光后的恢复测试。
视敏度测试如下进行：使用标准化的计算机化sbisà试视力字体，在6米的距离，采用亮度为400勒克司的离屏幕50厘米的snellen图表。
使用标准化的sbisà试视力字体进行眩光测试
两个灯放置在试视力字体的两侧，采用900流明的光发射(用两个20瓦的灯获得)，以允许额外照射到在50厘米处测量的400-500勒克司试视力字体。
在打开两个灯之后，在要求受试者双目视觉中识别至少50％的从1/10向前存在的字母。
用标准化的sbisà试视力字体进行眩光后的恢复测试
以下用于进行测试：sbisà计算机化视力测定法，采用在50厘米处照射300勒克司。当光源相对于勒克司计传感器(即适当的光笔)处于正交位置时，光源在20cm处产生200勒克司的照度。
对两只眼进行单眼测试，可能矫正屈光不正，针对评估考虑了最佳结果。在适应黑暗最长一分钟的时间后，覆盖一只眼睛并将光源放置在距对侧眼睛3cm处10秒钟，邀请受试者凝视它。一旦远光源(highbeamsource)被移除，灯再次打开并且要求受试者立即读取对应于4/10的线，在30秒的最大时间内，如果50％的字母在确定的时间内得到识别，那么该线被认为是读取的。如果在所提供的最大时间内没有读取相对线，则在另一只眼睛上以相同的方式重复该过程。
在不超过30秒的时间内获得最佳结果的眼睛被确认(特定许可证组2，卫生部)。表b表示用秒表测量的读取对应于4/10的线所需的时间，并且其表示为从测试开始计的秒数。
视网膜敏感性测试
为了评估治疗4周之前和之后视网膜敏感性的可能变化，还进行了以下视野测试(octopus311topg32策略，中心30度)。
-白光视野
-蓝黄色视野
在两种类型的视野中，仅分析ms(平均敏感性)，其是在视野的各个点测量的敏感性值与针对年龄校正的正常值之间的差异的算术平均值。
决定进行两个视野以评估光感受器对白色和蓝色-黄色刺激的不同响应。蓝黄色视野检查法的使用源于这样一个事实，即许多研究表明，对蓝色特异性的s锥状细胞是青光眼中早期受影响的那些。事实上，白光使所有锥状细胞的响应饱和：单个锥状细胞系统的响应缺陷可以通过其他锥状细胞系统的响应来补偿。蓝黄色视野反而提供15db的隔离，因此蓝色黄色神经节系统必须在其他细胞类型干预响应蓝色刺激之前失去15db的敏感性。
使用该方法，可以评估视网膜神经节细胞活性的可能增加，以支持和放大光感受器的发光信息。
检查视野的方法
在给药本发明组合物之前和治疗4周后，用octopus311进行检查。在黑暗中适应5分钟后进行检查。为了避免假阳性，初始白光测试重复两次，仅考虑第二视野的视网膜敏感性指数。随后，在正常光照下休息30分钟并在黑暗中进行5分钟的新适应后，进行蓝黄色视野，这通常用于测试视网膜神经节细胞的功能。同样在这种情况下，以10分钟的间隔进行两次检查，并使用通过第二次检查获得的视网膜敏感性指数。
在治疗4周结束时，使用前段和眼底的裂隙灯重新检查所有患者(a组和b组)以确定可能的病理学状态或副作用的发作。
结果
获得的结果总结在下表中。
将给药安慰剂的a组患者与用根据本发明的组合物治疗的b组患者进行比较，持续4周。
结果在给药月末评估。在给药的几周期间，在安慰剂组或用根据本发明的组合物治疗的b组中没有观察到全身副作用或眼部副作用。所有患者都完成了治疗月份。
表3总结了治疗前后未矫正和对比视敏度的变化。
表4总结了在治疗前后用眩光测试测量的视觉应激抵抗力数据和眩光测试后恢复。
表5显示了治疗前后视网膜敏感性的变化。
在这三个表中，服用安慰剂4周的患者a组获得的结果总是并列的。
统计学分析
两组中获得的结果用标准偏差和学生t进行统计学分析。
表3
*p<0,05vs治疗前组
说明：contr.＝对比
视敏度测试实质上表明，使用根据本发明的组合物的治疗不会改善中央视敏度超过十分之十(1.0)，即使在该研究中也不能排除视敏度的改善可以在十分之十以下发生。相反，相对于治疗前测量，治疗4周后对比视敏度改善。
表4
*p<0.05vs安慰剂(a组)
说明：眩光＝眩光测试a组和b组视敏度，以十分之一为单位；rec.＝眩光后恢复测试a组和b组，以十分之一为单位，其针对观察到眩光之前a组和b组的未矫正视敏度4/10(1)线所需的，见表a。
眩光测试后的眩光和恢复表明，用根据本发明的组合物治疗的b组相对于对照a组具有更高的视敏度恢复率。
表5
*p<0.05vs治疗前组
说明：ms＝平均敏感性；b/b＝采用白光刺激的视野；b/g＝采用蓝黄色光刺激的视野。
在白色和蓝色-黄色光视野中，用根据本发明的组合物治疗的b组相对于对照a组显示出视网膜敏感性(ms＝平均敏感性)的改善。
统计学
总之，视觉测试显示对比视力有所改善，从完全健康的受试者样本开始，正常视敏度为十分之十。对比视敏度的最佳感知清楚地表明视网膜敏感性阈值的改善。所治疗的受试者能够感知比用安慰剂治疗的受试者更高的对比色度(contrastshade)。
眩光测试后的眩光和恢复表明，用花青素和毛蕊花苷治疗后，视网膜承受光应激的能力显著改善。通过用根据本发明的组合物治疗后视紫质的更高再生速率来解释这种改善。
视网膜敏感性测试表明，由于视网膜神经节细胞功能更好，杆状体的蓝黄色敏感性得到改善。该数据应与对比视力的改善一起考虑。
在这两种情况下，效果主要是由于视网膜神经节细胞活性的增加，其随着蓝黄色光敏感性的增加并且随着伴有视锥细胞的敏感性的增加的对比视力改善而放大了杆状体的信号。
实施例5：关于具有眼病的患者的临床研究
黄斑水肿是一种由黄斑毛细血管通透性的改变引起的多因素疾病。血管损伤可能是由于全身性疾病，如糖尿病、肾功能衰竭和血液疾病。
一般而言，所有湿性黄斑变性都与黄斑水肿有关，特别是当视网膜色素上皮和布鲁赫薄层(bruchlamina)发生损伤时，其在解剖学上将色素上皮和覆盖在称为毛细血管绒毛膜的层的视网膜层分开。在没有布鲁赫薄层的保护的情况下，该血管层将血液扩散到视网膜层内，将它们分割并将它们彼此分开，直到视敏度严重降低。
在眼病中，由于糖尿病或高血压引起的血管损伤导致血管的透化增加并因此导致血浆从血管壁泄漏。
这种异常在采用视网膜荧光血管造影术的眼科中可容易地被可视化。通过该检查，在注射造影剂(荧光素)后拍摄视网膜血液循环。
血管壁的损伤继续随着毛细血管结构的减弱，所述毛细血管结构由于血压而通过产生微动脉瘤而减少。
在糖尿病性视网膜病变中，渗出物和微动脉瘤总是存在于初始阶段和晚期阶段，其中出现其他血管改变。
在这项研究中，在以下眼病中，单独评估花青素毛细血管保护活性，以及与毛蕊花的抗炎、抗水肿活性和金属蛋白酶的抑制相组合的花青素毛细血管保护活性：
-黄斑水肿
-糖尿病性视网膜病变
-干性黄斑变性
-湿性黄斑变性
材料和方法
对4组50名患者进行随机双盲研究，每组患者年龄相同。
为了评估花青素和花青素-毛蕊花组合的有效性，招募了没有其他眼病和一般血管病理学状态的自愿患者。
为避免血管药理学相互作用，160名患者未接受血管保护剂或抗血小板药物治疗至少3个月。糖尿病患者均接受口服降糖药治疗，空腹血糖不超过200mg/dl至少3个月。
患者的组
4组，每组40名患者，分为以下几组：
a组：多因素黄斑水肿：由于下列疾病，至少6个月前诊断为慢性黄斑水肿影响的平均年龄为58.2岁(15名男性和25名女性)：
10名患者，具有术后黄斑水肿
20名患者，具有来自糖尿病性视网膜病变的黄斑水肿
10名患者，具有因视网膜静脉闭塞导致的黄斑水肿
b组：40名非增殖性糖尿病性视网膜病变患者：平均年龄59.9岁(17名男性和23名女性)
c组：40名干性黄斑变性患者：65.2岁(20名男性和20名女性)
d组：40名湿性黄斑变性患者：平均年龄65.4岁(18名男性和22名女性)
之前针对病理学和诊断选择患者，并使其接受以下眼科检查：
-裂隙灯检查(cso)
-oct(oct-slooptos)
-荧光血管造影术(kowasw50度)
-未矫正和矫正视敏度测试(标准化计算机化sbisà试视力字体)
方案
检查者和患者不知情，每组40名患者，分为：
用仅含赋形剂的安慰剂片剂治疗的20名患者
用花青素-毛蕊花片剂治疗的20名患者(400mg花青素和100mg毛蕊花苷分成两个片剂--1片含有200mg花青素和50mg毛蕊花苷)。
一个片剂针对午餐服用，一个片剂针对晚餐服用，连续三个月。每隔7天，通过电话定期联系患者以确保正确实施治疗。
以下临床参数在4组中进行评估：
-最佳矫正视敏度(bsca)，测量的视敏度以0.1至1.0的小数表示
-具有oct黄斑地形图的黄斑视网膜水肿(sm)的最大厚度
-眼底变化(oct和荧光血管造影术)。
通过在治疗前和治疗结束时比较oct和荧光血管造影术进行该评估。
正面意义上的可能变化用1至5(+符号)的主观量表评估，并且在负面意义上的可能变化用1至5(-符号)的量表评估。不仅评估了视敏度的趋势，而且评估了治疗前后视网膜的外观。
特别地，在患有糖尿病性视网膜病变的患者组中，观察和评估视网膜渗出物和微动脉瘤的数量和大小以及由毛细血管脆性引起的视网膜内微出血的可能减少，并且最后，在荧光血管造影术中，评估在注射荧光素和任何毛细管切断术后3分钟染料从视网膜血管的扩散，诱导增殖性视网膜病变的视网膜缺血的指征。
统计学分析
将治疗组的结果与安慰剂组进行比较，比较治疗前后bcva(最佳矫正视敏度)值与黄斑厚度(sm)的变数的增量(delta)。
从每组(安慰剂组和治疗组)的治疗前和治疗后差异中获得的变数的增量用标准偏差和学生t进行统计学分析。
结果
下表6和7中所示的结果显示，与安慰剂组相比，花青素+毛蕊花苷组合在治疗a组中改善黄斑水肿方面具有明显的活性。
表6
表7
*与相同组的治疗前相比，p<0.05
**与安慰剂相比，p<0.05
毛细管保护和毛细管基底膜修复的作用，花青素的特征以及毛蕊花的抗炎和抗水肿作用，证明水肿的减少。视敏度的改善也通过花青素通过视紫质循环的加速促进视网膜光感受器的代谢的进一步作用来证明。用花青素-毛蕊花组合治疗的组与安慰剂组之间的比较结果显示两种物质组合的明显有效性。
数据统计学分析
对a组中获得的数据的统计学分析显示在治疗之前和之后获得的bcva和ms数据之间的显著差异(p<0.05)，这是在安慰剂组中未观察到的情况。此外，在治疗组中表达为变数的增量bcva和变数的增量ms的bcva和ms的变化与未治疗组(安慰剂)中获得的变化显著不同(p<0.05)。
下表8和9中所示的结果显示，与安慰剂组相比，在治疗b组中，花青素+毛蕊花苷组合在改善非增殖性糖尿病性视网膜病变中具有明显的活性。
表8
*与相同组的治疗前相比，p<0.05
表9
*与相同组的治疗前相比，p<0.05
**与安慰剂相比，p<0.05
在治疗前后，这些改善被认为是视敏度的增加和渗出物、微出血和微动脉瘤数量的减少。事实上，由于花青素所获得的血管通透性的降低减少了血浆通过毛细血管扩散而产生的渗出物的形成，并且与毛蕊花苷的协同作用也减少了糖尿病性视网膜病变典型的视网膜水肿。除了视敏度的改善之外，花青素和毛蕊花苷的作用引起视网膜病变框架的整体改善，其通过对检查者的判断进行的统计学分析证实。
同样在该组中，经受安慰剂的样品没有显示出任何显著的改善，而是由于视网膜病变的进展，存在视敏度降低的情况(负变数的增量值)。统计学数据显示，在治疗组中，治疗后bvca和ms值如何显著改善(治疗后与治疗后比较p<0.05)，这种改善与安慰剂组中观察到的显著不同(变数的增量bcva和变数的增量mv治疗组与变数的增量bcva和变数的增量ms安慰剂相比，p<0.05)。
表10和11中显示的结果表明，在治疗组c中，相对于安慰剂，花青素+毛蕊花苷组合在改善干性黄斑变性方面具有明显的活性。
这种视网膜病变目前代表了西方世界低视力(hypovision)形成的最常见原因，是由目前部分未知的一系列作用机制引起的。
花青素+毛蕊花苷的组合在三个月内获得的视敏度的改善可能是由于视网膜光感受器的代谢改善。然而，用毛蕊花苷证实的强大的毛细血管保护和对视网膜增殖因子(抗vegf)的抑制作用，在这种致残眼病的长期治疗中肯定起到了有益的作用。
表10
*与相同组的治疗前相比，p<0.05
表11
*与相同组的治疗前相比，p<0.05
**与安慰剂相比，p<0.05
治疗组相对于初始值(治疗前)显示出bcva和sm值的显著变化，并且相对于安慰剂(变数的增量bcva和变数的增量ms值)以统计学上显著的方式显示出优异的治疗前后改善。下表12和13中所示的结果显示了花青素+毛蕊花苷组合在改善最致残形式的黄斑变性(湿形式)中的明显活性。
湿形式可在约25％的患有黄斑变性的患者中发现。新的视网膜下血管的形成(典型的湿形式)，导致精细黄斑视网膜结构的完全破坏，加速视网膜光感受器的破坏过程。
表12
表13
*与相同组的治疗前相比，p<0.05
**与安慰剂相比，p<0.05
数据的统计学分析
数据的统计学分析显示如何在治疗前后安慰剂组中没有观察到显著改善，而用正在谈论的组合治疗组中针对bcva和sm参数获得了治疗前和治疗后显著不同的变化(p<0.05)。事实上，在这种情况下，在治疗组中获得的变数的增量bcva和变数的增量sm的值证明与在安慰剂中获得的值显著不同(p<0.05)。
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