包括植物乳杆菌培养物的用于减少皮肤皱纹的化妆品组合物的制作方法

本申请涉及包含单一乳酸培养物的具有胶原合成作用的化妆品组合物，和更具体地，涉及包含植物乳杆菌cjlp133培养物的用于促进胶原合成和改善皮肤皱纹的化妆品组合物。

背景技术：

人体皮肤保护人体免受多种氧化剂、空气污染、重金属、紫外线辐射(uv)等，防止细菌、真菌、病毒等侵入皮肤，并作为保护屏障具有防止水分流失的作用。皮肤的结构大致分为表皮、真皮和皮下脂肪三层，并且占皮肤90％的真皮层由胶原、弹性蛋白、透明质酸和糖蛋白组成。胶原是皮肤的主要组分，是一种重要的纤维蛋白，其约占人体蛋白质总重量的25％。它构成大多数结缔组织，并具有重要作用，例如细胞间基质功能、结构支持功能、诱导细胞分裂和分化、提供皮肤抗张强度等。已知衰老、紫外线、有害氧等可导致胶原生成减少并破坏其结构，因此其与皮肤皱纹的形成密切相关。近年来，恶化的环境因素(例如，细粉尘等)引起皮肤屏障的破坏，并从而通过胶原合成的减少和分解的增加持续促进皮肤老化。

因此，在化妆品中非常重要的问题是最大化每种成分的作用并且最小化其副作用以防止皮肤老化。在这方面，有必要开发一种成本效益的材料和包含该材料的易于使用的化妆品，该材料促进胶原合成且没有副作用。

乳酸菌是在人体中具有有益作用的细菌，其通过碳水化合物或纤维的发酵产生乳酸。迄今为止，已发现约400种乳酸菌，并且已将约18个品种开发为商业产品。

一旦乳酸菌进入人体肠道，它们通过自身的代谢活动分泌特定的物质。由于这些物质对人体具有有益作用，因此关于乳酸菌已经进行了许多研究。已经报道了乳酸菌对抗菌、抗氧化和免疫活性的影响。近年来，研究集中在乳酸菌的增白和保湿作用，并且作为化妆品材料的可能性一直在增加。在乳酸菌中，关于乳杆菌的作用已经进行了许多研究，并且已经报道了增强免疫力、抗菌作用、皮肤增白、改善特应性皮炎等。

其中，植物来源的乳酸菌(polab)是从植物原料的发酵食品(例如腌菜、泡菜等)中分离的乳酸菌，并且与乳制品来源的乳酸菌不同。

植物来源的乳酸菌不仅包括比动物乳酸菌多至少10倍的种类，而且其对外部环境具有极好的适应性。特别是，从具有高盐含量、低ph和高天然抗菌物质含量的泡菜中分离的植物乳酸菌可以在极端环境中生长，并且因此植物来源的乳酸菌具有多种生理活性物质的优异生产力。

代表性的生理活性物质可包括抗菌肽、免疫刺激剂、γ-氨基丁酸(gaba)，它们呈现多种生理功能，包括抗炎和免疫抑制作用等。此外，乳酸菌是热稳定的肽，并产生作为抗微生物剂的细菌素。细菌素是由多种微生物产生的天然抗微生物蛋白质或蛋白质物质，一般是指具有针对细菌菌株的杀菌机制的物质，该细菌菌株在形态和系统发生上类似于产生细菌素的微生物。因此，使用包含这些物质的乳酸菌培养物或乳酸菌发酵的植物提取物等的化妆品材料的开发正在积极的进行中，并且该进展符合有利于环保和安全材料的最新趋势。

现今，消费者不仅期望化妆品中的一般护理效果，而且还需要其多种功能(例如，抗衰老、改善细皱纹、抗刺激性、抗炎、美白效果等)。

近年来，多种植物提取物已用于这些化妆品的目的，并且对基于通过组合多种特性显示出改善的性能特性范围的新概念的产品的期望日益增长。

现有技术文件

专利文件

(专利文件1)kr10-1486999b1(2015.01.21)

技术实现要素：

技术问题

与环保时代相一致，本申请的发明人已努力研究源自泡菜的乳酸菌培养物的化妆品效果，其对皮肤是安全的，没有任何副作用并且通过胶原生物合成可以有效地用于防止衰老、改善皮肤弹性和改善皮肤皱纹，并且此外，研究了其在国内工业化中发展的可能性。结果，发明人确认了植物乳杆菌cjlp133培养物具有改善皮肤皱纹的活性，从而完成了本申请。

技术方案

本申请的目的是提供包含植物乳杆菌培养物的用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物，其中去除了细菌体。

本申请的另一个目的是提供预防或改善皮肤皱纹的方法，其包括向受试者施用其中去除了植物乳杆菌的细菌体的植物乳杆菌培养物。

本申请的仍另一个目的是提供组合物在制备包含植物乳杆菌培养物的用于改善皮肤皱纹的化妆品中的用途，其中去除了植物乳杆菌的细菌体。

本发明的有益效果

本申请提供了使用植物乳杆菌菌株(即，皮肤有益的细菌)制备植物乳杆菌培养物的方法，该培养物对皮肤安全且无副作用，并且还提供了包含植物乳杆菌培养物的用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物。

附图说明

图1是图解植物乳杆菌cjlp133培养物的胶原合成能力的实验结果的图。

具体实施方式

为了实现上述目的，本申请的一个方面提供了包含植物乳杆菌培养物的用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物，其中去除了细菌体。

在下文中，详细解释了本申请的包含植物乳杆菌培养物的用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物。

如本文所用，术语“植物乳杆菌”是指乳杆菌属的一种微生物，其是能够产生乳酸的革兰氏阴性细菌。它在发酵食品例如酸菜、腌菜、泡菜等中发现。

植物乳杆菌菌株可以具体地是植物乳杆菌cjlp133菌株，并且其可以是在注册号kctc11403bp下保藏的菌株。

具体地，植物乳杆菌cjlp133菌株于2008年10月16日保藏在布达佩斯条约下的国际保藏机构韩国生物科学与生物技术研究所(kribb)的韩国典型培养物保藏中心(kctc)，并且分配的注册号为kctc11403bp。

如本文所用，术语“培养物”是指包含通过在培养基中培养微生物菌株而产生的副产物的培养基，其中允许该菌株摄取和代谢培养基中包含的营养物。术语“培养物”包括可以使用培养基(例如，培养基的稀释剂或浓缩液、通过干燥培养基获得的干燥产品、培养基的粗制品或纯化产品、其混合物等)形成的所有制剂。

具体地，培养物可以是通过培养植物乳杆菌菌株获得的培养物，或者可以是通过培养在培养后去除细菌体的菌株获得的培养物。即，可以将去除了细菌体的培养的培养基作为培养物。

更具体地，可以通过包括以下的方法获得培养物：(a)通过接种培养基培养植物乳杆菌菌株；(b)将步骤(a)的所得产物离心；(c)从步骤(b)的所得产物中回收上清液。

在步骤(a)中，培养基可以是本领域中使用的任何培养基，只要该培养基可以培养菌株并在培养后回收培养物，具体地是液体培养基，和更具体地是mrs液体培养基。

为了获得纯的分离菌株，步骤(a)可以进一步包括在步骤(a)之前该步骤将植物乳杆菌菌株平板接种在固体培养基上并培养和收集被确认为纯的分离菌株的那些菌落的步骤。

在步骤(b)中，可以使用高速离心机在1℃至7℃，具体地在2℃至6℃，和更具体地在3℃至5℃下以1,500rpm至3,500rpm，具体地以2,000rpm至3,000rpm，和更具体地以2200rpm至2800rpm的转速进行离心，持续10到30分钟，具体地15到25分钟，和更具体地17到23分钟。

步骤(c)可以进一步包括过滤上清液的步骤。此外，步骤(c)可进一步包括使用冻干机粉碎过滤的上清液的步骤。

如本文所用，术语“皱纹”是指由皮肤老化产生的细纹，并且皱纹可能由基因、皮肤真皮中存在的胶原水平的降低、外部环境等引起。

在本申请中，该组合物可以通过增加胶原合成水平从而防止胶原减少的方法来改善皮肤皱纹。

胶原是一种重要的纤维蛋白，其约占人体总蛋白重量的25％。它占据大部分结缔组织，并具有细胞间基质、结构支撑、诱导细胞分裂和分化、提供皮肤抗张强度等作用。

如本文所用，术语“改善”是指使用本申请的组合物压抑或抑制皮肤皱纹症状、或减轻已在皮肤上出现的皮肤皱纹症状。

在本申请中，化妆品组合物可以以溶液、外用软膏、乳油、泡沫、营养润肤剂、软润肤剂、填充剂(pack)、软水、乳状洗剂、化妆基料、香精、肥皂、液体清洁剂、沐浴剂、防晒霜、防晒油、悬浮液、乳液、糊剂、凝胶、洗剂、粉末、肥皂、含表面活性剂的清洁剂、油、粉底、乳液粉底、蜡粉底、贴剂和喷雾剂的形式配制，但制剂不限于此。

在本申请中，化妆品组合物可进一步包含至少一种化妆品上可接受的载体以并入普通皮肤的化妆品中。作为化妆品上可接受的载体的常规组分，例如，可以适当地混合油、水、表面活性剂、保湿剂、低级醇、增稠剂、螯合剂、颜料、防腐剂、香料等，但组分不限于此。

并入本申请的化妆品组合物的化妆品上可接受的载体可以根据化妆品组合物的制剂而变化。

当本申请的制剂是软膏、糊剂、乳油或凝胶时，可以使用动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅氧烷、膨润土、二氧化硅、滑石粉、氧化锌等作为载体组分，但载体组分不限于此。这些载体组分可以单独使用或者两种或以上组合使用。

当本申请的制剂是粉末或喷雾剂时，可以使用乳糖、滑石粉、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙、聚酰胺粉末等作为载体组分，和具体地，在喷雾剂的情况下，制剂可进一步包含推进剂，例如氯氟烃、丙烷/丁烷和二甲醚，但是载体组分不限于此。这些载体组分可以单独使用或者两种或以上组合使用。

当本申请的制剂是溶液或乳液时，可以使用溶剂、增溶剂或乳化剂(例如水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇油等)作为载体组分，和具体地可以使用棉花籽油、花生油、玉米籽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油、甘油脂族酯和聚乙二醇或脱水山梨醇的脂肪酸酯，但是载体组分不限于此。这些载体组分可以单独使用或者两种或以上组合使用。

当本申请的制剂是悬浮液时，可以使用液体稀释剂(例如水、乙醇或丙二醇)、悬浮剂(例如乙氧基化异硬脂醇(ethoxylatedisostearylalcohol)、聚氧乙烯山梨醇酯和聚氧乙烯脱水山梨醇酯)、微晶纤维素、偏氢氧化铝(aluminummetahydroxide)、膨润土、琼脂、黄蓍胶等作为载体组分，但是载体组分不限于此。这些载体组分可以单独使用或者两种或以上组合使用。

当本申请的制剂是肥皂时，可以使用脂肪酸盐的碱金属盐、脂肪酸的半酯盐、脂肪酸蛋白质水解物、羟乙磺酸盐、羊毛脂衍生物、脂肪族醇、植物油、甘油、糖等作为载体组分，但是载体组分不限于此。这些载体组分可以单独使用或者两种或以上组合使用。

本申请的另一方面提供了用于预防或改善皮肤皱纹的方法，其包括向受试者施用其中去除了细菌体的植物乳杆菌培养物。

改善皮肤皱纹的方法可以是这样的方法，其包括向需要改善皮肤皱纹的受试者施用包含植物乳杆菌培养物和额外的化妆品上可接受的载体的化妆品组合物。化妆品上可接受的载体与上述相同。

受试者可包括或可不包括人类。具体地，受试者可以是包括牛、猪、羊、鸡、狗、人等的哺乳动物；鸟类；等等，并且可以是包括但不限于通过施用上述组合物可以改善皮肤皱纹的任何受试者。

本申请的另一个方面提供了组合物在制备包含植物乳杆菌培养物的用于改善皮肤皱纹的化妆品中的用途，其中去除了植物乳杆菌的细菌体。

实施例

在下文中，将通过示例性实施方式将详细地描述本申请。然而，对于本申请所属领域的技术人员来说显而易见的是，这些示例性实施方式仅用于说明性目的，并不旨在限制本申请的范围。

实施例1.植物乳杆菌cjlp133培养物的制备

将注册号kctc11403bp下保藏的植物乳杆菌cjlp133菌株平板接种在固体mrs培养基(bddifco，乳杆菌mrs琼脂)上，并在37℃下培养约18小时。经确认后，收集纯的分离菌落，并使用铂环将其接种到液体mrs培养基(bddifco，乳杆菌mrs肉汤)中，并在37℃下培养约18小时。在培养完成后，培养物具有1.0×10⁹cfu/ml的浓度。为了从培养物中分离细菌体，使用高速离心机(labogene1248r)在4℃和2500rpm的条件下将培养物进行离心20分钟。过滤培养物的上清液后，使用冻干机(hetopl90000)粉碎过滤的上清液。这样制备的培养物被称为“植物乳杆菌cjlp133培养物”。

实施例2.确认植物乳杆菌cjlp133培养物的胶原合成能力

为了确认实施例1中制备的植物乳杆菌cjlp133培养物的胶原合成作用，测量了皮肤成纤维细胞中胶原表达的量。

将新生的人类真皮成纤维细胞(nhdf)(5×10⁴个细胞/皿)加入24孔板中含有10％胎牛血清的dulbecco修饰的eagle培养基(dmem，gibco)中，并在37℃下培养48小时。对于阳性对照组，以tgf-β(10ng/ml)处理无血清的dmem，和对于实验组，分别以0.25mg/ml、0.5mg/ml和1.0mg/ml的浓度处理mrs培养基和植物乳杆菌cjlp133培养物，并培养48小时。然后，收集每种培养物，并使用具有picpeia试剂盒(前胶原i型c肽酶免疫测定试剂盒，takarabioinc.，日本)的分光光度计在450nm下测量胶原合成能力。

结果，确认了以植物乳杆菌cjlp133培养物处理的组中胶原表达的量以浓度依赖性方式增加。具体地，当以浓度3(1.0mg/ml)处理时，与以mrs培养基处理的实验组相比，在以植物乳杆菌cjlp133培养物处理的实验组中胶原表达的量增加约1.6倍。上述增加等于在阳性对照组(tgf-β)中获得的结果，因此确认了植物乳杆菌cjlp133培养物对于皮肤成纤维细胞具有优异的胶原合成能力。实验结果在表1和图1中显示。

表1

从以上结果中确认了，本申请的植物乳杆菌cjlp133培养物可增加胶原的合成，其中已知胶原的合成在皮肤衰老机制中具有主要作用，其中通过减少构成皮肤的底物蛋白、或增加分解底物蛋白的酶形成皱纹，因此该培养物对于改善皮肤皱纹是有效的。

根据前述内容，本申请所属领域的技术人员将能够理解，在不修改本申请的技术概念或本质特征的情况下，本申请可以以其他具体形式呈现。在这方面，本文公开的示例性实施方式仅用于说明性目的，并且不应被解释为限制本申请的范围。相反地，本申请旨在不仅覆盖示例性实施方式，而且覆盖可以包括在由所附权利要求限定的本申请的精神和范围内的多种替代、改进、等价形式和其他实施方式。

注册号

保藏机构名称：韩国生物科学与技术研究所(kribb)

注册号：kctc11403bp

保藏日期：2008年10月9日