斑蝥素作为miR-214-3p/Wnt/β-Catenin信号通路抑制剂防治骨肉瘤的用途的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及斑蝥素作为mir-214-3p/wnt/β-catenin信号通路的抑制剂在预防和治疗骨肉瘤生长和转移方面的用途。

背景技术：

骨肉瘤(osteosarcoma，os)，是最常见的原发性恶性骨肿瘤，有两个发病高峰，分别为10-14岁处于青春发育期的儿童/青少年和65岁以上老年人，儿童/青少年多发。骨肉瘤临床以疼痛、肿块、肢体活动障碍为主要症状，其临床病理改变为骨质破坏，表现为溶骨性，其病程改变具有恶性度高、异质性高、生长迅速、早期转移的特点。

由于骨肉瘤早期疼痛不明显，呈进展性改变，因此前期经常被误诊而延误病情的诊治。近年来随着新辅助化疗等多样化综合疗法的运用，患者5年生存率提高至60％-70％，但10％-20％骨肉瘤患者在确诊时即为转移性，其5年生存率只有20％，手术治疗后80％的患者出现转移。

由于骨肉瘤恶性程度高、发病因素复杂、发病机制尚不明确、缺乏临床有效治疗药物，以及广泛存在耐药性，对患者、家庭及社会造成巨大的痛苦和经济压力，因此寻找一种毒副作用较小且行之有效的治疗方法极为迫切。

斑蝥素(cantharidin)是一种单萜类衍生物，其分子式为c10h12o4，分子量为196.2，难溶于水，易溶于二氯甲烷、氯仿等有机溶剂，是斑蝥虫体主含化学成分，约为1％～1.2％，是斑蝥抗癌的有效成分和主要毒性成分。

wnt/β-catenin信号通路是一条在生物进化中极为保守的通路。这条包括wnt族基因及其产物与β-catenin基因等构成的极为复杂的信号通路控制了从果蝇到人类胚胎发育、细胞命运及组织器官形态形成以及肿瘤发生的诸多重大事件，wnt/β-catenin信号通路参与多种肿瘤细胞的发生发展。

micrornas(mirnas)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码rna，其大小长约20-25个核苷酸。mirna参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等。最近的研究发现，mirna表达与多种癌症相关，大约50％得到注解的mirnas在基因组上定位于与肿瘤相关的脆性位点(fragilesite)。这说明mirnas在肿瘤发生过程中起至关重要的作用，这些mirnas所起的作用类似于抑癌基因和癌基因的功能。

技术实现要素：

针对现有技术的上述不足，根据本发明的实施例，希望提供一种可用于预防和治疗骨肉瘤(osteosarcoma)发生、发展、转移、耐药的新方法，以有效解决骨肉瘤患者死亡率高、存活期短的问题。

本发明技术方案的提出基于：

1、确定了不同浓度斑蝥素处理骨肉瘤细胞143b和u2os后，斑蝥素抑制骨肉瘤细胞的生物学特性：

(1)通过实时细胞仪检测，发现斑蝥素剂量依赖性抑制骨肉瘤细胞存活率、迁移和浸润；

(2)通过细胞克隆形成检测，发现斑蝥素剂量依赖性抑制骨肉瘤细胞克隆形成；

(3)通过流式细胞仪检测发现斑蝥素剂量依赖性使骨肉瘤细胞的细胞周期阻滞在g2/m期，通过westernblot检测细胞周期关键蛋白表达，进一步确认了斑蝥素使骨肉瘤细胞的细胞周期阻滞在m期；

(4)通过流式细胞仪和westernblot检测细胞凋亡相关蛋白表达，发现斑蝥素剂量依赖性促进骨肉瘤细胞凋亡；

2、确定了斑蝥素对小鼠体内骨肉瘤形成和转移的影响：将143b细胞经胫骨注射入裸鼠骨髓腔，建立原位骨肉瘤和肺转移模型，腹腔注射斑蝥素，观察肿瘤生长情况，用荧光素酶标记检测原位移植瘤生长和肺转移情况。研究发现肿瘤生长明显被抑制，表现为肿瘤体积和肿瘤重量的减少，且肺转移力降低。

3、通过westernblot检测wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达情况，确定了不同浓度斑蝥素处理骨肉瘤细胞143b和u2os后，抑制了wnt/β-catenin信号通路活化。

4、通过rt-pcr检测并确定了人骨肉瘤标本与癌旁组织之间、骨肉瘤细胞与正常人成骨细胞之间mir-214-3p含量差异，发现骨肉瘤人体标本和骨肉瘤细胞中mir-214-3p的表达均上调。

5、通过建立稳定的mir-214-3p过表达和mir-214干扰骨肉瘤细胞株，研究mir-214-3p对骨肉瘤细胞的增殖能力，迁移能力，浸润能力，细胞凋亡和细胞周期及对wnt/β-catenin信号通路的影响。发现mir-214-3p通过活化wnt/β-catenin信号通路促进骨肉瘤发生和转移，抑制mir-214-3p表达，可以灭活wnt/β-catenin信号通路从而达到抑制骨肉瘤生长和转移的目的。

相对于现有技术。本发明提出的斑蝥素作为mir-214-3p/wnt/β-catenin信号通路抑制剂在制备防治骨肉瘤生长和转移药物中的用途，提供了一种可用于预防和治疗骨肉瘤发生、发展、转移、耐药的新方法，可有效解决骨肉瘤患者死亡率高、存活期短的问题。

附图说明

图1显示利用实时细胞仪检测发现斑蝥素呈时间和剂量依赖性抑制骨肉瘤细胞生长。

图2显示利用细胞克隆形成实验检测发现斑蝥素呈剂量依赖性抑制骨肉瘤细胞克隆形成。

图3显示利用流式细胞仪检测发现斑蝥素呈剂量依赖性阻滞骨肉瘤细胞周期于g2/m期。

图4显示利用westernblot检测细胞周期关键蛋白表达发现，斑蝥素呈剂量依赖性使骨肉瘤细胞阻滞于m期。

图5显示利用流式细胞仪及westernblot检测细胞凋亡关键蛋白表达发现，斑蝥素呈剂量依赖性促进骨肉瘤细胞凋亡。

图6显示利用实时细胞仪及westernblot检测emt关键蛋白发现，斑蝥素呈时间和剂量依赖性抑制骨肉瘤细胞迁移和浸润。

图7显示利用移植瘤模型检测发现，斑蝥素抑制异种移植裸鼠原位骨肉瘤生长及肺转移。

图8显示利用westernblot检测发现细胞斑蝥素通过下调wnt/β-catenin信号通路抑制骨肉瘤细胞生长。

图9显示利用实时细胞仪检测发现chir(wnt/β-catenin激活剂)与斑蝥素联合使用可恢复骨肉瘤细胞增殖能力。

图10显示利用实时细胞仪检测发现chir(wnt/β-catenin激活剂)与斑蝥素联合使用可恢复骨肉瘤细胞迁移能力。

图11显示利用rt-pcr检测发现mir-214在骨肉瘤组织和细胞中高表达。

图12显示利用rt-pcr检测发现斑蝥素呈剂量依赖性抑制骨肉瘤细胞mir-214表达水平。

图13显示利用实时细胞仪检测发现斑蝥素通过下调mir-214抑制骨肉瘤细胞生长。

图14显示利用细胞克隆形成实验检测发现斑蝥素通过mir-214抑制骨肉瘤细胞克隆形成。

图15显示利用实时细胞仪检测发现斑蝥素通过mir-214抑制骨肉瘤细胞迁移。

图16显示利用生物信息学软件预测has-mir-214-3p靶基因。

图17显示利用westernblot检测发现mir-214-3p正反馈调控wnt/β-catenin通路关键转录因子lef1表达水平。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修改同样落入本发明权利要求所限定的范围。

(1)xcelligence实时细胞检测仪检测增殖能力

用e-plate板，每孔加100μl含有不同浓度斑蝥素(1.25μm，2.5μm，5μm，7.5μm，10μm，15μm)的含血清完全培养基，dmso(1/10000v/v)作为空白对照，0.5μm多柔比星为阳性对照；设置程序，测background；准备细胞，u2os与143b细胞以20000个/孔的密度接种，每孔100μl；室温孵育30min，上机start实时检测48h，观察不同斑蝥素对细胞的增殖能力的影响。结果发现斑蝥素在1.25-15μm范围内剂量依赖性抑制骨肉瘤细胞存活率(如图1所示)。同样用上述实时细胞仪检测，在有或无chir(wnt/β-catenin激活剂4μm)存在的条件下，用斑蝥素2.5μm处理骨肉瘤细胞，结果发现chir与斑蝥素联合使用可恢复被斑蝥素抑制的骨肉瘤细胞增殖能力(如图9所示)。

(2)细胞克隆实验

取生长状态良好、处于对数生长期的骨肉瘤细胞，消化，电子计数仪计数，12孔板铺板，调整细胞密度至300个细胞/孔(1ml/孔)37℃、5％co2培养箱中培养不少于24h后(细胞贴壁、状态良好)，加入不同浓度斑蝥素(0μm，1.25μm，2.5μm，5μm)，37℃培养箱共同培养，每天显微镜下观察，每两天换一次培养基，7-9天后，吸取旧的培养基，pbs清洗一遍，每孔加入1ml多聚甲醛，放摇床上固定10min后，加入1ml10％的结晶紫染色，摇床上放置10min后，倒置显微镜下拍照，计数。结果发现斑蝥素剂量依赖性抑制骨肉瘤细胞克隆形成(如图2所示)。

(3)流式细胞仪检测细胞周期

u2os与143b细胞以1*10⁵个/ml的浓度接种到6孔板，培养24h，无血清饥饿处理12h后，分别用不同浓度的斑蝥素和dmso(1/10000v/v)处理细胞24h；trypsin消化细胞，收集细胞，用70％冰乙醇固定细胞，4℃过夜；rnasea37℃处理细胞30min；pi4℃避光孵育30min；bdc6流式细胞仪检测细胞周期变化。检测结果发现斑蝥素在1.25-5μm范围内剂量依赖性使骨肉瘤细胞的细胞周期阻滞在g2/m期(如图3所示)。

(4)westernblot检测相关蛋白表达

检测指标有：wnt/β-catenin信号通路有关蛋白β-catenin，gsk-3β，p-gsk-3β，apc；细胞迁移和浸润相关蛋白：e-cadherin，vimentin；细胞周期相关蛋白：c-myc，cyclinb1，cdc2；细胞凋亡相关蛋白：bax，bak，bcl-2，cleavedparp。进一步确认了斑蝥素通过wnt/β-catenin信号通路(如图8所示)使骨肉瘤细胞的细胞周期阻滞在m期(如图4所示)、促进骨肉瘤细胞发生凋亡(如图5所示)、抑制骨肉瘤细胞迁移和浸润能力(如图6所示)。

(5)流式细胞仪检测细胞凋亡

u2os与143b细胞以1*10⁵个/ml的浓度接种到6孔板，培养24h，无血清饥饿处理12h后，分别用不同浓度的斑蝥素和dmso(1/10000v/v)处理细胞24h；trypsin消化细胞，收集细胞，将细胞用annexinⅴ-fitc和碘化丙啶(pi50μg/ml)室温染色15min；bdc6流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果发现斑蝥素在1.25-5μm范围内剂量依赖性促进骨肉瘤细胞凋亡(如图5所示)。

(6)xcelligence实时细胞检测仪检测迁移能力

用特殊的cim-plate板，下室中加入165μl细胞趋化液(含有10％fbs的完全培养基)，上室加40μl含有不同浓度斑蝥素及dmso(1/10000v/v)的无血清培养基，上下室组装，37℃温育30min；设置程序，测background；准备细胞，u2os与143b细胞以20000个/孔的密度接种，每孔100μl(无血清培养基悬浮)；室温孵育30min，上机start实时检测24h，观察不同斑蝥素对细胞的迁移能力的影响。结果发现斑蝥素在1.25-5μm范围内剂量依赖性抑制骨肉瘤细胞迁移能力(如图6所示)。同样用上述实时细胞仪检测，在有或无chir(wnt/β-catenin激活剂4μm)存在的条件下，用斑蝥素2.5μm处理骨肉瘤细胞，结果发现chir与斑蝥素联合使用可恢复被斑蝥素抑制的骨肉瘤细胞迁移能力(如图10所示)。

(7)xcelligence实时细胞检测仪检测浸润能力

此方法检测浸润能力的过程与迁移能力类似，只是在cim-plate板的上室中预先铺上一层matrigel胶，用无血清培养基配制1：40的胶，配好后置于冰上备用；在上室中加50μl配好的matrigel胶，随后吸出30μl(这样形成的胶中没有气泡)；37℃孵育4-5h；后续操作同迁移实验。结果发现斑蝥素在1.25-5μm范围内剂量依赖性抑制骨肉瘤细胞浸润能力(如图6所示)。

(8)斑蝥素体内抗骨肉瘤的作用研究

培养骨肉瘤细胞143b，在细胞融合度达到80％左右时收集细胞，细胞计数使浓度达到1*10⁷个/ml，10μl细胞注射入balb/c裸鼠的左侧胫骨内，以此建立胫骨内原位骨肿瘤模型；选择4周龄balb/c雄性裸鼠40只，spf级，体重18-20g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。给动物进行编号(打耳孔)，采用随机数字表法分为4组，每组10只小鼠，分别用生理盐水，低浓度斑蝥素2.5mg/kg，高浓度斑蝥素以5mg/kg和多柔比星0.5mg/kg100μl/只/天进行腹腔注射4周。4周内每3天测量一次小鼠体重，每7天测量一次肿瘤长与宽，每7天用小动物活体成像系统检测一次胫骨内骨质变化与肺部转移情况。4周后处死小鼠，测量瘤体重量。研究结果发现斑蝥素在体内明显抑制肿瘤生长，表现为肿瘤体积和肿瘤重量减少、且肺转移力降低(如图7所示)。

(9)rt-pcr检测mir-214表达水平

分别将人体组织标本(癌旁组织+肿瘤组织)取大约10mg，加入1mltrizol，用自动组织研磨仪研磨，提取总的rna；将5株细胞以1*10⁵个/ml的密度接种6孔板，每孔2ml，培养48h，每孔加1mltrizol提取总rna。微量分光光度计测定提取样品的rna浓度及纯度，逆转录试剂盒(qiagen,valencia,ca)将rna逆转为cdna，按照20μl体系(10μlsybgreen酶+2μlcdna+0.5μl上游引物+0.5μl下游引物+7μl水)，条件95℃变性20s，56–62℃退火30s，72℃延伸30s，45个循环进行dna的扩增，采用2^-△△ct的计算方法计算不同组间mir-214的含量变化。结果发现骨肉瘤人体标本和骨肉瘤细胞中mir-214-3p表达水平均上调(如图11所示)。

(10)检测mir-214过表达和mir-214干扰对骨肉瘤细胞生物学特性及wnt/β-catenin信号通路的影响。

合成agomir-214n.c、agomir-214、antagomir-214n.c和antagomir-214产物，运用rnaimax试剂转染至骨肉瘤细胞中，pcr检测mir-214过表达和干扰的转染效率，建立其稳定转染细胞株，并检测在mir-214正常、mir-214过表达和mir-214干扰的基础上，用2.5μm处理骨肉瘤细胞，rt-pcr检测结果发现斑蝥素呈剂量依赖性抑制骨肉瘤细胞mir-214表达水平。结果发现斑蝥素可以下调骨肉瘤细胞中mir-214表达(如图12所示)，实时细胞仪检测发现斑蝥素通过下调mir-214抑制骨肉瘤细胞生长(如图13所示)，细胞克隆形成实验检测结果发现斑蝥素通过mir-214抑制骨肉瘤细胞克隆形成(如图14所示),实时细胞仪检测发现斑蝥素通过mir-214抑制骨肉瘤细胞迁移(如图15所示)。

(11)利用生物信息学软件预测发现has-mir-214-3p与wnt/β-catenin信号通路的靶基因lef1和gsk3β有特异性结合位点(如图16所示)。同时通过在mir-214过表达和mir-214干扰的基础上，用2.5μm处理骨肉瘤细胞，用westernblot检测结果发现斑蝥素通过降低mir-214调控wnt/β-catenin通路关键转录因子lef1表达水平(如图17所示)，证明斑蝥素是mir-214-3p/wnt/β-catenin信号通路的抑制剂、通过抑制该信号通路达到防治骨肉瘤生长和转移药物中的用途。