SB203580在制备抗肿瘤药物中的应用及抗肿瘤药物的制作方法

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种小分子化合物sb203580在制备抗肿瘤药物中的应用以及一种抗肿瘤药物。

背景技术：

目前，癌症已超过心血管疾病，成为全球第一大死亡原因。一直以来，手术切除、放疗和化疗仍然是肿瘤临床治疗的主要手段。尽管靶向治疗对乳腺癌、非小细胞型肺癌等部分癌症的治疗取得了重要突破，但是绝大部分肿瘤仍然缺乏有效的治疗手段。2013年度的《科学》杂志将癌症的免疫疗法列为2013年度重大突破之首，2018年诺贝尔生理和医学奖也颁发给了jamesp.allison教授和tasukuhonjo教授以表彰他们在肿瘤免疫治疗方面做出的贡献，因而免疫治疗将有望成为未来治疗肿瘤的手段之一。

新近发现的以产il-9细胞因子为主并具有一定抗肿瘤效应的th9细胞受到广泛关注。回输肿瘤特异性th9细胞可以根除小鼠肿瘤并保护存活的荷瘤小鼠免受肿瘤的再攻击(yongluetal.,2018)。fas信号通路除了介导t细胞凋亡功能，还可以参与t细胞的增殖和活化。已有文献报道fas促进th17细胞极化，抑制th1细胞极化，而fas是否参与th9细胞极化仍不清楚。

p38是一类可由多种应激信号和炎性细胞因子激活的普遍存在于细胞中的蛋白激酶，活化p38激酶导致肿瘤细胞在化疗中存活，因此，抑制p38激酶具有潜在的临床治疗意义。此外，p38信号通路是否参与th9细胞极化仍不清楚，因此，具体研究p38信号途径在th9极化及免疫治疗中的作用可为进一步的肿瘤治疗提供理论指导。

sb203580的分子式为c21h16fn3os，结构式如式(ⅰ)所示。sb203580是一种常用的p38mapk抑制剂。sb203580可以通透细胞，抑制p38mapk(p38mapkinase)，抑制后续mapkapkinase-2和mapkapkinase-3的激活。通过抑制p38mapk，sb203580可以有效抑制一些炎症因子(如il-1β、tnf-α)诱导的部分信号转导。但尚未有关于sb203580抗肿瘤方面的报道。

技术实现要素：

本发明经研究发现p38的小分子抑制剂sb203580具有通过促进th9细胞极化来抑制肿瘤生长的作用。

本发明提供了小分子化合物sb203580在制备抗肿瘤药物中的应用。小分子化合物sb203580是一种p38抑制剂，能够抑制p38的磷酸化，从而抑制p38活性，而p38活性被抑制后，能够提高jo2(fasl)促进cd4⁺t细胞向th9细胞极化，th9细胞是一类能够表达il-9的cd4⁺t细胞，具有抑制肿瘤生长作用。

优选的，所述抗肿瘤药物针对的肿瘤类型为肺癌。

小分子化合物sb203580通过抑制p38活性来提高fasl诱导cd4⁺t细胞向th9细胞极化，从而起到抗肿瘤作用。

本发明又提供了fas或其配体fasl作为靶点在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明经研究发现，fas/fasl通路能够促进cd4⁺t细胞向th9细胞极化，从而起到抗肿瘤作用。所述抗肿瘤药物通过提高fas或其配体fasl活性来促进诱导cd4⁺t细胞向th9细胞极化，从而起到抗肿瘤作用。

优选的，所述肿瘤为肺癌。

本发明还提供了一种抗肿瘤药物，活性成分为小分子化合物sb203580。小分子化合物sb203580是一种p38抑制剂，通过抑制p38的活性，从而提高jo2(fasl)促进cd4⁺t细胞向th9细胞极化。相当于小分子化合物sb203580间接提高了fasl的活性，从而增加cd4⁺t细胞向th9细胞极化，th9细胞增加能够抑制肿瘤生长。

本发明体外实验发现fas缺失的cd4⁺t细胞往th9细胞极化能力减弱，蛋白免疫印迹(westernblot)结果显示fas缺失的th9细胞中磷酸化p38表达减弱，而sb203580联合fasl(jo2)刺激后，jo2促th9细胞极化能力大大增加。通过动物肿瘤模型发现低剂量sb203580就能够明显抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长，延长其生存时间。利用il-9阻断抗体(anti-il-9)和il9r^-/-小鼠进一步分析发现，低剂量sb203580能够抑制荷瘤小鼠的肿瘤主要是通过提高体内il-9⁺cd4⁺t细胞(th9细胞)数目，且无肝肾功能毒性副作用。

本发明具有如下优点：本发明研究发现低剂量p38抑制剂sb203580通过提高体内il-9⁺cd4⁺t细胞数目从而对肺癌具有良好的抑制作用，为抑制剂的新用途提供理论基础，为开发p38抑制剂sb203580的抗癌作用提供了新思路；其次，p38抑制剂sb203580除了具有一定的抗肿瘤作用，其副作用较小，无肝肾功能毒性，具有很好的临床应用前景。

附图说明

图1为fas^lpr小鼠和对照wt小鼠cd4⁺t细胞向th9细胞极化能力检测结果图，其中，图a为流式分析检测il-9⁺cd4⁺t细胞比例，图b为流式分析统计结果，图c为rt-pcr检测il-9的mrna水平，图d为elisa检测il-9的蛋白水平，“***”表示p＜0.001(下同)。

图2为fas^lpr小鼠和对照wt小鼠th9细胞或者jo2刺激wt小鼠th9细胞后p38活化水平的westernblot检测结果，图中iso是isotype，即同型对照抗体，jo2是fasl。

图3为cd4⁺t细胞在jo2和p38抑制剂(sb203580)的共同作用下极化为th9细胞的流式结果图，其中，“ns”表示没有统计学意义(下同)。

图4为sb203580对小鼠肿瘤大小及小鼠生存率变化检测结果图，其中，图a为肿瘤大小结果，图b为生存率变化结果，第一组dmso表示注射dmso和anti-il9的同型对照抗体，第二组sb203580表示注射sb203580和anti-il9的同型对照抗体，第三组dmso+anti-il9表示注射dmso和anti-il9抗体，第四组sb203580和anti-il9表示注射sb203580和anti-il9抗体，“**”表示p<0.01(下同)。

图5为ot-ii小鼠来源的jo2及jo2联合sb203580刺激th9细胞对小鼠肿瘤大小及小鼠生存率变化检测结果图，其中，图a为肿瘤大小结果，图b为生存率变化结果，nt表示未处理组，fasl-th9表示回输jo2单独刺激th9组，fasl+p38i-th9表示回输jo2联合sb203580刺激th9组。

图6为ot-ii小鼠来源的jo2及jo2联合sb203580刺激th9细胞对il9r^-/-小鼠肿瘤大小及小鼠生存率变化检测结果图，其中，图a为肿瘤大小结果，图b为生存率变化结果。

图7为低剂量p38抑制剂对小鼠肝肾功能影响检测结果图，其中，图a为血清检测丙氨酸转氨酶含量，图b为血清检测肌酐含量。

具体实施方式

雌性c57bl/6小鼠(6-8周，以下简称c57小鼠)购买于上海斯莱克实验动物有限公司。fas^lpr小鼠(fas缺失小鼠)及对应的对照wt小鼠(fas正常小鼠，两杂合子小鼠配，繁殖得到fas基因缺失的纯合子小鼠及fas基因正常的小鼠，该正常小鼠作为对照用，其余遗传背景相同。)；ot-ii小鼠(一种cd4转基因小鼠，其tcr(t细胞受体)可被ova323-339所识别。)和il9r^-/-小鼠(il-9受体缺失小鼠)购买于美国jacksonlaboratory，所有小鼠均培育于spf级设施。

小鼠肺癌细胞系llc-ova由南方医科大学杨魏老师赠送。

实施例1

利用体外诱导极化体系，检测fas^lpr小鼠和对照wt(野生型)小鼠cd4⁺t(即初始t细胞)cell向th9细胞极化能力。具体步骤如下：

t细胞分选：

(1)取小鼠脾脏和淋巴结，用注射器活塞挤压以制成组织悬液；(2)转移到15ml圆锥形试管中并使大块沉淀到试管底部或者通过尼龙滤网过滤，得到单细胞悬液；(3)1500rpm，4℃离心沉淀细胞悬液5分钟，弃掉上清；(4)用2mlpbs缓冲液重悬样本，取10μl3％冰醋酸稀释，进行细胞计数；(5)再次离心细胞，弃掉上清，根据计数结果用分选buffer重悬细胞将密度调为1×10⁸个/ml；(6)用cd4阴选试剂盒(easysep^tmmousecd4⁺tcellisolationkit，#19852a)分选出cd4⁺t，再用biotin分选试剂盒(easysep^tmmousebiotinpositiveselectionkit，#18556)分选得到cd4⁺cd62l⁺t细胞，即cd4⁺t细胞。

t细胞体外极化：

在96孔板中，用高压灭菌pbs稀释anti-cd3、anti-cd28至终浓度2μg/ml，按照200μl/孔进行包板，37℃静置2小时以上。分选cd4⁺t细胞，4×10⁵个/孔，进行th9细胞诱导极化。th9细胞极化条件如下所示：

10μg/mlanti-ifnγ、20ng/mlil-4和5ng/mltgf-β。

铺板即极化第0天。第3天，收集细胞和上清，elisa检测上清il-9细胞因子，rt-pcr检测细胞中il-9mrna的表达水平。第4天，细胞加入50ng/mlpma和1μg/mlinomycin作用30分钟，然后加入高尔基体阻断剂bfa继续作用4小时后收样，流式细胞仪检测il-9⁺cd4⁺t细胞。

流式细胞术：

1)表面染色：待检测细胞用pbs洗1次，离心后用pbs重悬。加入荧光素标记流式抗体，冰上或者4℃避光孵育30min后，pbs中和离心2次，弃上清，适量pbs重悬细胞。

2)胞内细胞因子染色：待检测细胞制备成单细胞悬液后，表面染色同前。染色结束pbs洗1次，4℃离心1500rpm，5min。弃尽上清，每管加入icfixationbuffer200μl后，室温避光20分钟。加入1×permeabilizationbuffer缓冲液中和后离心。离心后弃上清，100μl1×permeabilizationbuffer重悬细胞，加入胞内细胞因子检测的流式抗体，4℃避光孵育30分钟后，加入1×permeabilizationbuffer缓冲液中和，洗2遍。弃上清，适量pbs重悬细胞。

上述不同染色处理后的细胞在novocyte流式细胞仪(acea公司)进行流式细胞分析。数据采用flowjo软件进行分析。结果表明，fas促进th9细胞极化(图1a和b)。

酶联免疫吸附实验(elisa)检测上清中细胞因子il-9含量。具体步骤如下：

1)以elisa包被缓冲液为介质，il-9captureantibody作为包被抗体，4℃包被96孔酶标板过夜；

2)含0.05％吐温的pbs缓冲液(pbst)洗板4遍后，用含10％胎牛血清的pbs缓冲液，室温封闭1小时；

3)pbst洗板5次后，加入25μl待检上清，室温2h；

4)pbst洗板5次后，加入1×diluteassay稀释后的il-9detectionantibody，25μl/孔，室温孵育1h；

5)pbst洗板5次后，加入1×diluteassay稀释后的辣根过氧化物酶(hrp)，25μl/孔，室温孵育0.5h；

6)pbst洗板7次后，在检测孔加入反应底物tmb，25μl/孔，室温避光孵育15min；

7)加入elisa终止液，立即将板子在酶标仪450nm测定od值，根据标准曲线将样品od值换算成相应的蛋白含量。结果表明，fas促进th9细胞极化(图1c)。

rna提取和实时荧光定量pcr(qrt-pcr)

1)rna提取：细胞rna按照trizol法进行提取细胞用pbs洗1次，加入500μltrizol；充分混匀后，加入200μl氯仿，剧烈震荡15s，重复三次震荡后，静置于室温10min后离心，4℃12000g离心15min；离心后小心吸取上层透明液相，置于无rnase的1.5mlep管中，加入等体积异丙醇后上下颠倒混匀，室温静置10min后离心，4℃12000g离心10min；离心后弃上清，加1ml75％乙醇(由depc水和无水乙醇配置)洗涤，上下颠倒混匀后离心，4℃12000g离心10min；弃尽乙醇，于空气干燥5min后，加10μldepc水溶液，测定rna浓度和纯度后保存于﹣80℃。

2)逆转录：以提取rna为模板，用康为逆转录试剂盒(hifiscriptcdna第一链合成试剂)逆转录成cdna。

逆转录体系为：

逆转录条件为：42℃，1h；85℃，5min。

85℃失活后保存于﹣20℃备用。

1)qrt-pcr：上述产物采用sybrprimerextagtm(takara)进行定量pcr扩增。

检测小鼠il-9的引物序列为(购自origene公司，货号mp206805)

上游引物：tccaccgtcaaaatgcagctgc，

下游引物：ccgatggaaaacaggcaagagtc；

检测小鼠β-actin的引物序列为(购自origene公司，货号mp200232)

上游引物：cattgctgacaggatgcagaagg，

下游引物：tgctggaaggtggacagtgagg。

反应体系：

sybrtaq(2×)5μl

primermix0.5μl

cdna4.5μl

反应条件为：

50℃孵育2min；95℃预变性10min；95℃变性15sec，60℃退火35sec，共40循环。

rt-pcr结果表明，fas促进th9细胞极化(图1d)。

实施例2

收集fas^lpr小鼠和对照wt小鼠来源的th9细胞，以及收集jo2刺激c57小鼠来源的th9细胞，方法同实施例1。其中，jo2(jo2蛋白即fasl蛋白，购自bd公司，货号554254)刺激是指在t细胞体外极化时，除了加入上述anti-ifnγ、il-4和tgf-β之外，再加入10μg/ml。对照wt小鼠作为fas^lpr小鼠的同型对照；而jo2刺激c57小鼠来源的th9细胞，采用在t细胞体外极化时取代jo2而加入的同型对照抗体(表示为iso，即同型对照抗体)作为对照，该同型对照抗体跟jo2一样也购自bd公司，货号553961，但对cd4⁺t细胞诱导极化成th9细胞无影响。

细胞收集后，采用westernblot方法检测p38蛋白的活化水平，p38蛋白磷酸化后活性增高，即p38磷酸化蛋白(p-p38)量高表示总的活性高，检测p-p38采用的抗体购自cst公司，货号d3f9。

收集细胞，离心，pbs洗涤后加入细胞裂解液1×celllysisbuffer及蛋白酶抑制剂，冰上放置30分钟后4℃12000g离心15min，取上清加入5×sds上样缓冲液，于沸水浴中煮5min，制成蛋白样。蛋白样品用10％sds-page凝胶电泳，恒压80v至预染蛋白marker条带分开后加大电压至160v，待样品上样的蓝色条带到底部停止电泳。将凝胶中的蛋白以300ma恒流作用90min转移至pvdf膜上，用5％脱脂奶粉室温封闭1小时。pbst洗膜3次后，加入相应一抗4℃孵育过夜。次日，pbst洗膜3次，加入相应二抗室温孵育1小时，pbst洗膜3次，加入ecl底物在tanon成像分析系统曝光成像。

westernblot结果如图2所示，与正常小鼠th9细胞相比，fas缺失th9细胞的p38磷酸化蛋白(p-p38)表达降低，而jo2刺激th9细胞的p38磷酸化蛋白表达升高。

实施例3

利用实施例1中相同的体外诱导极化体系，检测联合jo2和sb203580(p38抑制剂)对th9极化影响。采用c57小鼠，t细胞体外极化时，第一组额外加入iso和dmso(溶解小分子sb203580用，此处作为对照)，第二组额外加入jo2和dmso，第三组加入iso和sb203580，第四组加入jo2和sb203580，其中，jo2的加入量为10μg/ml，sb203580的加入量为1μm。

于第四天流式检测il-9⁺cd4⁺t细胞。结果表明，p38被抑制后(加入sb203580)，jo2促th9极化能力大大增加(图3)。

实施例4

c57小鼠皮下注射1×10⁶个llc-ova肺癌细胞，然后分为两组，一组腹腔注射il-9中和抗体(invivomabanti-mouseil-9，bio-x-cellclone：9c1，catalog：be0181)，对照组腹腔注射同型对照抗体(invivomabmouseigg2aisotypecontrol，unknownspecificity，clone：c1.18.4，catalog：be0085)，抗体注射量为100μg/只；然后再每组分成两小组，两小组中一小组再腹腔注射小分子sb203580，另一小组再腹腔注射dmso作为对照，sb203580注射量为0.5mg/kg(按小鼠体重计量)，dmso体积为25μl/只；腹腔注射药物为隔天注射一次，直到第14天，之后不再注射药物，持续观察肿瘤情况。

观察肿瘤大小以及生存率变化。结果如图4所示，肿瘤体积较大，小鼠生存时间较短，注射sb203580后能够抑制肺癌细胞的生长，而使用il-9中和抗体阻断il-9后，注射sb203580不再能够抑制肺癌细胞的生长，说明sb203580体内抑制肺癌生长主要是通过il-9起作用。

实施例5

分别使用实施例1中方法获得ot-ii小鼠来源的jo2刺激th9或是ot-ii小鼠来源的jo2联合sb203580刺激th9细胞。

c57小鼠皮下注射llc-ova肺癌细胞，每只小鼠1×10⁶个肺癌细胞，然后分成三组，每组5只，一组尾静脉回输上述ot-ii小鼠来源的jo2刺激th9，另一组尾静脉回输上述ot-ii小鼠来源的jo2联合sb203580刺激th9细胞，第三组未做处理，作为对照，注射肿瘤细胞后第1天和第6天尾静脉回输th9细胞，每次2×10⁶个细胞每只，观察肿瘤大小以及生存率变化的结果图。

实验结果表明，与未回输细胞组(nt组)小鼠相比较，回输了jo2刺激th9细胞和jo2联合sb203580刺激th9细胞组的小鼠肿瘤体积明显减少，生存时间延长；并且与回输jo2刺激th9细胞相比较，回输了jo2联合sb203580刺激th9细胞组的小鼠肿瘤体积更加显著减少(图5a)，生存时间更长(图5b)，说明jo2刺激后的th9细胞具有抑制肿瘤生长作用，而jo2联合sb203580刺激th9细胞，p38被抑制后，jo2促th9极化能力大大增加，从而th9细胞抑制肿瘤生长作用增强。“ns”表示没有统计学意义。

实施例6

il9r^-/-小鼠实施体内实验，方法同实施例5，仅小鼠来源不同。实验结果表明，三组小鼠肿瘤体积大小(图6a)和生存时间(图6b)无显著差异，表明sb203580体内抑制肺癌生长主要是通过il-9起作用，il-9受体敲除的小鼠，回输jo2刺激th9细胞或jo2联合sb203580刺激th9细胞，肿瘤生长均没有明显被抑制。

实施例7

c57小鼠每组5只，sb203580隔天腹腔注射一次，注射量为0.5mg/kg，22天后取小鼠外周血液检测，对照组每次同步注射25μldmso，检测小鼠外周血清中的丙氨酸转移酶和肌酐的含量，结果如图7所示，实验组和对照组无显著性差异，表明上述剂量下，sb203580副作用较小，无明显肝肾功能毒性。

序列表

<110>浙江大学

<120>sb203580在制备抗肿瘤药物中的应用及抗肿瘤药物

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificial)

<400>1

tccaccgtcaaaatgcagctgc22

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificial)

<400>2

ccgatggaaaacaggcaagagtc23

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<213>人工序列(artificial)

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cattgctgacaggatgcagaagg23

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<212>dna

<213>人工序列(artificial)

<400>4

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