槲皮素及其衍生物在制备抗寨卡病毒药物中的应用的制作方法

本发明涉及槲皮素及其衍生物的应用，尤其涉及槲皮素及其衍生物在制备抗寨卡病毒药物中的应用。

背景技术：

寨卡病毒是一种蚊媒传播病毒，早在1947年就被发现，此后静息多年，最早一次爆发流行是2007年发生在西太平洋密克罗尼亚群岛的雅铺岛，更大的一次流行于2013-2014年发生在大洋洲的法属波利尼西亚，感染了约32000人。引起全世界广泛关注的是2015年的巴西疫情，原因是出现了几千例小头畸形的新生儿。尽管寨卡病毒病的临床症状一般较轻，但由于可以导致胎儿发育异常，甚至与格林-巴利综合征相关，从而造成严重影响，为此，who于2016年2月1日宣布寨卡病毒病为国际关注的突发公共卫生事件。虽然科学家们在快马加鞭地研究相关的诊断试剂盒、疫苗和药物，但目前还没有寨卡病毒疫苗和有效的治疗药物上市。

寨卡病毒属黄病毒科黄病毒属，呈球形，直径约为40～70nm，有包膜。基因组为单股正链rna，长度约10.8kb，有一个开放的阅读框，编码一个含有3419个氨基酸的多聚蛋白。该蛋白裂解成三种结构蛋白，即：衣壳蛋白(c)、膜蛋白前体/膜蛋白(prm/m)、包膜蛋白(e)，以及7种非结构蛋白(ns1、ns2a、ns2b、ns3、ns4a、ns4b和ns5)。3种结构蛋白参与病毒的装配，c蛋白与基因组rna结合构成病毒体的核心；e蛋白介导与宿主细胞受体的结合及与细胞膜的融合，在病毒进入宿主细胞的过程中发挥作用；prm作为一种伴侣蛋白协助e蛋白的折叠，以防止病毒颗粒过早融合，prm为蛋白m的前体，裂解为蛋白m从而促进病毒的成熟。在非结构蛋白中，ns3具有丝氨酸蛋白酶、核苷三磷酸酶及rna解旋酶活性，其中，蛋白酶结构域起切割多聚蛋白前体、形成成熟的病毒蛋白的作用，解旋酶结构域在病毒复制形成双链rna后起解旋作用，ns2b则结合ns3形成稳定的复合物，由于该复合物在病毒复制周期中具有多重功能，ns2b-ns3蛋白可作为抗病毒药物的潜在靶点，而针对该靶点的抗寨卡病毒药物研发还处于起步阶段。

我国地大物博，蕴藏着丰富的天然药物资源，运用天然药物治疗疾病有着悠久的历史记载，为开发抗病毒天然药物提供了物质和理论基础。槲皮素是从槐米中提取的一种黄酮类化合物，具有降血压、降血脂、降胆固醇、免疫抑制、抗过敏、止咳平喘、抗肿瘤等多种功效，但其在抗寨卡病毒药物中未见相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供槲皮素及其衍生物在制备抗寨卡病毒药物中的应用

本发明所采取的技术方案是：

本发明的目的之一在于提供槲皮素及其衍生物在制备抗寨卡病毒药物中的应用。

优选地，上述槲皮素的衍生物为其互变异构体或其药学上可接受的盐。

优选地，上述槲皮素药学上可接受的盐为其碱加成盐，选自钠、钾、钙、镁、铁、亚铁、铵或锌盐；或酸加成盐，选自硫酸盐、醋酸盐、盐酸盐、磷酸盐、草酸盐、马来酸盐、富马酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐或苯甲酸盐。

上述药学上可接受的盐容易分离，可采用常规分离方法提纯，如溶剂萃取、稀释、重结晶、柱色谱和制备薄层色谱等。

优选地，上述寨卡病毒为中国分离株z16006genbank:955589.1。

优选地，上述抗寨卡病毒药物中还包括药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂。

优选地，本发明的化合物可与药学上各种常用添加剂(如稀释剂和赋形剂等)制成药物组合物。根据治疗目的及使用方式，可将药物组合物制成各种类型的给药单位剂型，如口服剂、缓释剂、片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服剂、栓剂和针剂(溶液及悬浮液)等。

为了使片剂形式的药物组合物成形，可使用本领域任何已知的并广泛使用的赋形剂。例如，载体，如乳糖、白糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、碳酸钙、高岭土、结晶纤维素和硅酸等；粘合剂，如水、乙醇、丙醇、普通糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、明胶溶液，羧甲基纤维素、紫胶、甲基纤维素和磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，如干淀粉、藻酸钠、琼脂粉和海带粉，碳酸氢钠、碳酸钙、聚乙烯脱水山梨醇的脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘酯、淀粉和乳糖等；崩解抑制剂，如白糖、甘油三硬脂酸酯、椰子油和氢化油等；吸附促进剂，如季胺碱和十二烷基硫酸钠等；润湿剂，如甘油、淀粉等；吸附剂，如淀粉、乳糖、高岭土、膨润土和胶体硅酸等；以及润滑剂，如纯净的滑石，硬脂酸盐、硼酸粉和聚乙二醇等。如果需要的话，还可以用通常的涂渍材料使片剂作为糖衣片剂、肠衣片剂、涂膜片剂(如涂明胶膜片剂)、双层膜片剂及多层片剂。

为了使丸剂形式的药物组合物成形，可使用本领域任何已知的并广泛使用的赋形剂，例如，载体，如乳糖，淀粉，椰子油，硬化植物油，高岭土和滑石等；粘合剂，如阿拉伯树胶粉，黄蓍胶粉，明胶和乙醇等；崩解剂，如琼脂和海带粉等。

为了使栓剂形式的药物组合物成形，可使用本领域任何已知并广泛使用的赋形剂，例如，聚乙二醇，椰子油，高级醇，高级醇的酯，明胶和半合成的甘油酯等。

为了制备针剂形式的药物组合物，可将溶液和悬浮液消毒，并最好加入适量的氯化钠，葡萄糖或甘油等，制成与血液等渗压的针剂。在制备针剂时，也可使用本领域内任何常用的载体。例如，水，乙醇，丙二醇，乙氧基化的异硬脂醇，聚氧基化的异硬脂醇和聚乙烯脱水山梨醇的脂肪酸酯等。此外，还可加入通常的溶解剂、缓冲剂和止痛剂等。

本发明的另一目的在于提供一种抗寨卡病毒的药物，所述药物包含槲皮素和/或其衍生物。

优选地，上述槲皮素的衍生物为其互变异构体或其药学上可接受的盐。

优选地，上述槲皮素药学上可接受的盐为其碱加成盐，选自钠、钾、钙、镁、铁、亚铁、铵或锌盐；或酸加成盐，选自硫酸盐、醋酸盐、盐酸盐、磷酸盐、草酸盐、马来酸盐、富马酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐或苯甲酸盐。

本发明的有益效果是：

1、经试验证明：槲皮素具有明显的抗寨卡病毒活性，能显著抑制感染寨卡病毒产生的空斑效应、mrna及蛋白表达水平和ns2b-ns3蛋白酶的活性，其作用于寨卡病毒进入阶段，可以达到100％的抑制效果。

2、槲皮素对细胞的毒性较小，在0～12.5μm的浓度范围内对vero细胞基本没有毒性。

3、槲皮素对寨卡病毒的ic50为2.29±0.55μm。

4、本发明开发槲皮素的新用途，提高了槲皮素的经济价值，也为槲皮素在制备抗寨卡病毒药物中的应用提供了理论和实践基础。

附图说明

图1为槲皮素对vero细胞的毒性检测图；

图2为vero细胞中药物处理和病毒感染的流程图；

图3：(a)为不同加药方式的细胞空斑效应图；(b)为不同加药方式的寨卡病毒的mrna表达水平图；

图4为vero细胞与寨卡病毒混合后添加槲皮素的时间与寨卡病毒的相对mrna表达水平的关系图；

图5：(a)槲皮素与寨卡病毒孵育不同时间的空斑效应图；(b)槲皮素与寨卡病毒孵育时间与寨卡病毒ns1蛋白表达水平的关系图；

图6为槲皮素浓度与寨卡病毒ns1蛋白抑制率的关系图；

图7：(a)为ns2b-ns3蛋白酶条带图；(b)为不同处理方式的荧光强度随时间变化图；(c)为槲皮素浓度与寨卡病毒的ns2b-ns3蛋白酶抑制率关系图。

具体实施方式

下面进一步列举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域技术人员根据本发明阐述的原理做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适范围内的选择，而并非要限定于下文示例的具体数据。

本发明所用的细胞为非洲绿猴肾细胞(vero细胞)，在含有10％胎牛血清、100u/l青霉素、链霉素的dmem培养基中培养；

本发明所用的寨卡病毒(zikv，下简称病毒)为中国分离株z16006(genbank:955589.1)，经vero细胞传代扩增，-80℃保存待用；

另：所有与活病毒相关的试验均在生物安全2级的设施中进行；

本发明的槲皮素的化学结构式如下：

1、槲皮素的细胞毒性检测试验：

槲皮素对细胞的毒性检测采用mtt法，具体如下：

将vero细胞按8×10³个/孔接种于96孔板中，在37℃，5％co2的恒温细胞培养箱中培养至密度约为80％，将用dmem梯度稀释的槲皮素加入到96孔板中，每孔200μl，继续培养96h，弃去细胞培养上清液，每孔加入100μl含0.5mg/mlmtt的dmem培养基，37℃继续孵育4h，添加槲皮素的作为试验组，未添加槲皮素的作为对照组，后采用多功能酶标仪(geniospro,tecan,us)检测570nm处的吸光度，以细胞的存活率作为槲皮素对vero细胞的毒性指标，依据公式：细胞存活率(％)＝e/n×100计算细胞存活率，其中，e为试验组的吸光度，n为对照组的吸光度，结果如图1：

由图1可知：槲皮素在0～12.5μm的浓度范围内对vero细胞基本没有毒性，vero细胞的存活率基本维持在100％，这说明槲皮素的生物安全性较高。

2、槲皮素抑制寨卡病毒感染细胞而产生的空斑效应及寨卡病毒的mrna表达水平试验：

为了研究槲皮素作用于寨卡病毒生命周期的阶段，本发明采用如下方法进行研究：

将vero细胞按2×10⁵个/孔接种于12孔板中，在37℃，5％co2的恒温细胞培养箱中培养至密度约为80％，分成4组加药方式：

a组：病毒与槲皮素孵育后再感染vero细胞；

b组：槲皮素与vero细胞孵育后再加入病毒感染vero细胞；

c组：病毒与槲皮素混合后立即感染vero细胞；

d组：病毒感染vero细胞1h后再加入槲皮素；

具体操作如下(见图2)：

a组：将100μm槲皮素先与100tcid50的寨卡病毒等体积混合，在室温下孵育30min，再加入vero细胞中，在37℃，5％co2恒温细胞培养箱中孵育1h后，换成新鲜的不含槲皮素的dmem培养基；

b组：将50μm槲皮素与vero细胞在37℃，5％co2恒温细胞培养箱中孵育1h，弃去槲皮素，加入100tcid50的寨卡病毒在37℃，5％co2恒温细胞培养箱中孵育1h，弃去病毒，换成新鲜的不含槲皮素的dmem培养基；

c组：将100μm槲皮素与100tcid50的寨卡病毒等体积混合后立即加到vero细胞中，在37℃，5％co2恒温细胞培养箱中孵育1h，弃去病毒，换成新鲜的不含槲皮素的dmem培养基；

d组：将100tcid50的寨卡病毒接种于vero细胞，在37℃，5％co2恒温细胞培养箱中孵育1h后，换成新鲜的含50μm槲皮素的培养基；

空白组为不加病毒和药物、只加0.31％的dmso的细胞培养物；病毒对照组为只加病毒和0.31％的dmso、不加药物的细胞培养物；

上述4组槲皮素的终浓度均为50μm。

vero细胞经上述4种加药方式处理后继续培养72h，收集上述4组的上清液做空斑实验检测子代病毒产生情况，具体为：将vero细胞按1.5×10⁵个/孔接种于12孔板中，在37℃，5％co2的恒温细胞培养箱中培养至密度约为80％，上述4组上清液稀释1000倍，加入vero细胞中，在37℃，5％co2的恒温细胞培养箱孵育1h，加入含1.2％甲基纤维素、2％fbs的dmem培养基，感染96h后，弃去培养基，加入2％的结晶紫(4％多聚甲醛配制)，室温下放置30min，在流水下冲洗，洗去未结合的结晶紫染料，最后使用酶联免疫斑点分析仪拍照；同时，提取vero细胞总rna，做qrt-pcr以检测病毒的mrna表达水平，结果如图3：

由图3(a)可知：槲皮素对a组的子代病毒产生的空斑效应有明显的抑制作用，接近100％的抑制效果，对b、c、d三组的子代病毒产生的空斑效应没有抑制作用；

由图3(b)可知：槲皮素能显著降低a组、部分降低c组细胞内的寨卡病毒的mrna的表达量，而对b、d两组细胞内的寨卡病毒的mrna的表达量的影响没有显著性差异，与空斑实验的结果基本一致，这说明槲皮素可能不能吸附到细胞上以及槲皮素不能保护感染病毒后的细胞，同时也说明了槲皮素可能作用于寨卡病毒的进入细胞阶段(简称进入阶段)。

3、确认槲皮素作用寨卡病毒的阶段：

基于上述试验，为了进一步确认槲皮素是否作用寨卡病毒的进入阶段，本发明还进行了下述“加药时间”试验，具体为：

将vero细胞按2×10⁵个/孔接种于12孔板中，在37℃，5％co2的恒温细胞培养箱中培养至密度约为80％，将100tcid50的寨卡病毒加到细胞中，在37℃，5％co2的恒温细胞培养箱中孵育，分别于0(与病毒同时加到细胞中)、1、2、3、4、5、8、12、24h，加入50μm槲皮素，继续孵育1h，弃去上清，加入2ml的dmem培养基，继续培养72h，提细胞总rna，做qrt-pcr以检测寨卡病毒的mrna表达水平，病毒对照组为只加病毒和0.31％的dmso、不加药物的细胞培养物，结果见图4：

由图4可知：病毒感染0h时，槲皮素对寨卡病毒的抑制效果最显著，而当细胞感染寨卡病毒后，槲皮素对寨卡病毒复制的抑制效果较差，这再一次说明槲皮素主要作用于寨卡病毒的进入阶段，与上述寨卡病毒的mrna的相对表达量的试验结果一致。

4、槲皮素与寨卡病毒结合后的起效时间：

为了确定槲皮素与病毒结合后的起效时间，本发明采用空斑实验和ns1elisa实验进行研究，具体方法如下：

(1)空斑实验：将vero细胞按1.5×10⁵个/孔接种于12孔板中，在37℃，5％co2的恒温细胞培养箱中培养至密度约为80％，0.31％的dmso(对照组)或50μm的槲皮素(实验组)分别与病毒混合后，于室温下分别孵育0，1，5，10，30，60，120，240min后加入vero细胞中，在37℃，5％co2的恒温细胞培养箱孵育1h，加入含1.2％甲基纤维素、2％fbs的dmem培养基，感染96h后，实施空斑实验，不加病毒和药物、只加0.31％的dmso的细胞培养物作为空白对照组，结果如图5(a)：

(2)ns1elisa实验：将vero细胞按8×10³个/孔接种于96孔板中，在37℃，5％co2的恒温细胞培养箱中培养至密度约为80％，0.31％的dmso(病毒对照组)或50μm槲皮素(实验组)与病毒混合于室温下分别孵育0，1，5，10，30，60，120，240min后加入vero细胞中，不加病毒和药物、只加0.31％的dmso的细胞培养物作为空白对照组，在37℃，5％co2的恒温细胞培养箱孵育1h，换成新鲜的dmem培养基，继续培养96h，弃去细胞培养上清液，pbs洗涤1次，细胞用4％多聚甲醛在室温下固定20min，弃去多聚甲醛，每孔加入200μl冰冻的无水甲醇，细胞在4℃条件下通透5min，用冷的pbs洗涤1次，每孔加入150μl的2％脱脂牛奶(含0.3％tween20的pbs配制)，在37℃条件下封闭1h，0.3％tween20的pbs洗涤3次，每孔加入50μl的ns1一抗(1：2000)，在37℃条件下孵育1h；0.3％tween20的pbs洗涤3次，每孔加入50μl二抗(1：2000)，在37℃条件下孵育1h；0.3％tween20的pbs洗涤4次，每孔加入50μl的tmb溶液显色5min，最后加入50μl的0.5mol/l的h2so4溶液终止反应，使用酶标仪检测波长为450nm处的吸光度值，根据od450的大小，判断槲皮素抑制病毒进入的活性，结果如图5(b)：

由图5(a)可知：槲皮素与病毒混合后立即(0min)感染细胞，与病毒组相比，基本没有产生空斑效应，对病毒的抑制率几乎100％；

由图5(b)可知：槲皮素与病毒混合后立即(0min)感染细胞，能100％抑制ns1蛋白的表达，与空斑实验的结果一致，这说明，槲皮素与病毒混合后立即起效，抑制率高达100％。

5、槲皮素体外抗寨卡病毒感染的半数有效浓度(ic50)检测：

通过上述实验证实槲皮素作用于病毒进入阶段，为了检测槲皮素抗寨卡病毒感染的ic50，本发明采用ns1elisa检测槲皮素对寨卡病毒感染的活性，具体方法如下：

将vero细胞按8×10³/孔接种于96孔板中，在37℃，5％co2的恒温细胞培养箱中培养至密度约为80％；不同浓度梯度的槲皮素与病毒混合后在室温下孵育30min后加入vero细胞中，在37℃，5％co2的恒温细胞培养箱孵育1h，换成新鲜的dmem培养基，继续培养96h，弃去细胞培养上清，进行ns1elisa检测，结果如图6，根据od450数据用prism软件计算槲皮素抑制病毒感染的ic50大小。

由图6可知：槲皮素对寨卡病毒具有明显的抑制作用，其对病毒的抑制率随槲皮素的浓度的增加而增加，存在明显的量效关系，计算得到：槲皮素对寨卡病毒的半数有效浓度ic50为ic50＝2.29±0.55μm。

6、槲皮素对寨卡病毒ns2b-ns3蛋白酶活性的影响：

ns3对病毒致病性、病毒复制以及蛋白质的加工成熟有着重要的作用。ns3蛋白酶区域是ns3等非结构蛋白合成的重要切割酶，ns3蛋白酶需与ns2b结合成ns2b-ns3蛋白酶复合物才能发挥酶活性作用，所以ns2b-ns3蛋白酶复合物可作为酶抑制剂类的重要靶标，基于此，本发明通过如下方法研究槲皮素对寨卡病毒ns2b-ns3蛋白酶活性的影响：

构建ns2b-ns3蛋白酶原核表达质粒：ns2b-ns3蛋白酶在rosettatm(de3)感受态细胞中表达，在37℃条件下用含100mg/l氨苄青霉素和20mg/l氯霉素的lb培养基扩菌(od值为0.6)，然后加入0.5mm的蛋白表达诱导剂iptg在16℃条件下诱导表达16h；

表达纯化ns2b-ns3蛋白酶：对上述离心收菌，超声裂解细菌，离心保留上清，加入镍柱结合，依次用浓度为125mm(1)、250mm(2)和500mm(3)咪唑的蛋白裂解缓冲液来洗脱，透析除去咪唑，用超滤管浓缩透析后的蛋白溶液，最后应用akta蛋白纯化系统过g75分子筛，收集具有紫外吸收的峰，最后用sds-page来检验目的蛋白纯度；

检测槲皮素对蛋白酶活性的抑制作用：将上述纯化后的ns2b-ns3蛋白酶与反应缓冲液、系列浓度的槲皮素预先加到96孔全黑平板中孵育30min，加入bz-nle-lys-arg-arg-amc底物，室温下孵育10min，在酶标仪上检测荧光强度(rfu)，激发波长355nm，发射波长460nm，未加入ns2b-ns3蛋白酶作为对照组，加入aprotinin抑制剂作为阳性对照组，结果见如图7：

由图7(a)可知：经sds-page检验，在25kda左右得到ns2b-ns3蛋白酶目的条带，其纯度达到80％以上；

由图7(b)可知：实验组加入ns2b-g4tg4-ns3重组蛋白酶(ns2b-ns3蛋白酶)，因而产生较强荧光，而缓冲液对照组不含有重组蛋白酶，底物不能被酶切，荧光信号较弱，阳性对照组，aprotinin抑制蛋白酶活性，产生的荧光信号也较弱，这说明了表达纯化得到的ns2b-g4tg4-ns3重组蛋白酶活性较好，满足酶活性抑制实验；

由图7(c)可知：槲皮素能明显抑制ns2b-ns3蛋白酶活性，其对ns2b-ns3蛋白酶活性的抑制率随着浓度的增加而增加，存在明显的量效关系，槲皮素抑制ns2b-ns3蛋白酶的ic501.012±0.159μm，50μm的槲皮素对ns2b-ns3蛋白酶的抑制率达到100％。

结合以上研究结果，槲皮素作用于寨卡病毒进入阶段，是一个病毒进入抑制剂，且能明显抑制ns2b-ns3蛋白酶活性，这说明了槲皮素很有可能通过与病毒结合后，干扰ns2b-ns3蛋白酶活性，阻碍病毒进入细胞，进而影响病毒在细胞内的复制，因此槲皮素可作为一个潜在的抗寨卡病毒药物进行开发。