一种圆柏花粉变应原浸提物、其浸液及其制备方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种圆柏花粉标准化变应原浸液及其制备方法。

背景技术：

人们对变态反应疾病的认识始于“花粉热”，花粉热又称过敏性鼻炎。1911年noon和freeman首次利用花粉提取液来治疗花粉热，变态原疾病治疗的历史从此开始。目前，变态反应性疾病是全球性重大卫生问题之一。工业化国家超过25％的人口被变应性哮喘、变应性鼻结膜炎及变应性皮炎困扰，其中以变应性哮喘最为常见。吸入致敏花粉是引发变应性哮喘及其他呼吸道变态反应性疾病的最重要因素。vrta—l.a等调查发现近50％的变态反应性疾病患者对草类花粉过敏。

岳凤敏的《圆柏花粉的生物学及临床过敏初步分析》中指出随机取157例春季花粉症患者，对圆柏花粉过敏占31.8％；mimurat的《allergensinjapanesepatientswithallergicconjunctivitisinautumn》中指出日本的调查显示，春季发作变应性结膜炎的患者，其柏树花粉过敏的阳性率为59.4％；李文静的《圆柏花粉点刺试验阳性患者临床特点分析》中指出圆柏花粉阳性的患者在罹患疾病上表现出明显的倾向性，过敏性鼻炎患者占大多数(64.5％)；冯国歌的《北京地区哮喘患者变应原皮试状况的观察》中指出对就诊并行变应原测试的哮喘患者按不同年龄分组，对其过敏原测试结果进行分析研究，结果表明哮喘患者的阳性率为88.6％。其中圆柏花粉占22.8％；漆可的《北京地区中小学生常见吸入性变应原的调查分析》中指出在北京地区参加调查的学生中，对其中1280名学生进行皮肤点刺试验，495名变应原阳性，北京城区198名中有12％圆柏花粉呈阳性、郊区297名学生中有18％圆柏花粉呈阳性；以上圆柏花粉流行病学调查研究显示，圆柏花粉过敏广泛分布在我国各地，在北方地区圆柏花粉是花粉过敏的主要致敏原。

圆柏科(cupressaceae,cypress)，裸子植物门，松杉纲。含22属，约150种，分布于南北两半球，是冬春季花粉症常见的致敏原。我国有8属29种，广泛分布于全国，以圆柏等最为常见。在地中海国家，如法国、以色列、西班牙、意大利等，柏树花粉是冬季花粉症的重要变应原。

现在变应原特异免疫治疗的方法主要分为皮下注射给药免疫治疗和舌下给药免疫治疗。皮下注射给药免疫治疗已有100多年历史，其安全性和有效性已经被得到证明。上世纪90年代初，变应原舌下滴剂疫苗诞生，1998年，who宣布了变应原舌下滴剂疫苗安全和有效。

但是舌下给药免疫脱敏的方式相比皮下注射免疫给药，治疗周期长，短时间内疗效不显著，平均脱敏周期3-5年。在一个治疗周期中，舌下给药方式免疫脱敏给药量是皮下注射给药量的100倍。所以皮下注射给药免疫脱敏的方式相比舌下给药，虽然病人依从性差，但是治疗周期短，见效快，治疗费用低。

目前，用于圆柏花粉变应原的作为皮下注射免疫制剂的稳定性差，成分不确定，试剂存放一定时间后用于诊断圆柏花粉诱发的变态反应疾病时，阳性率降低，准确性低。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明提供一种含圆柏花粉变应原浸液，该浸液具有于特异性高，圆柏致敏蛋白组分提取充分且比例恒定，总生物效价稳定，有效期长的特点。其可有效用于变态反应疾病的皮肤点刺试验诊断及特异性免疫治疗，可有效诊断由圆柏花粉诱发的变态反应疾病并对其进行特异性免疫治疗。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

一种圆柏花粉变应原浸提物，其含有圆柏花粉变应原蛋白sabc1、sabc2、sabc3和sabc4中的一种或多种，其中所述sabc1含有如seqidno.4所示的氨基酸序列，所述sabc2含有如seqidno.5所示的氨基酸序列。

所述sabc3含有如seqidno.6所示的氨基酸序列。

所述sabc4含有如seqidno.7所示的氨基酸序列。

一种的圆柏花粉变应原浸液，所述变应原浸液中含如上所述的圆柏花粉变应原浸提物、体积比为0.2～0.4％的苯酚、体积比为45～55％的甘油和4.5～5.5g/l的nacl，其ph值为6.0～8.0。

如上所述的圆柏花粉变应原浸液，优选地，所述圆柏花粉变应原的相对生物效价为5000～20000bau/ml，所述圆柏花粉变应原浸液的总蛋白浓度0.08～0.32mg/ml。

进一步地，通过sds-page和westernblotting检测，所述圆柏花粉变应原浸提物分布主要在18kda、20kda、24kda、28kda、32kda、38kda、43.5～50.0kda、56kda、66kda、85kda。

如上所述的圆柏花粉变应原浸液的制备方法，其包括如下步骤：

s1、采集圆柏花粉，常温下干燥；

s2、对干燥后的花粉脱脂、干燥；

s3、将脱脂干燥后的圆柏花粉按重量g体积ml比1:50～1:10加入ph为7.9～8.2磷酸盐—盐水缓冲液，2-8℃搅拌22～26h进行浸提；

s4、取步骤s3后的浸提液，离心取上清液；将上清液过滤及除菌过滤；

s5、将过滤后的上清液进行超滤浓缩，获得超滤浓缩液；

s6、将所述超滤浓缩液经过二次过滤和除菌过滤后，真空冻干获得圆柏花粉变应原冻干品；

s7、将所述圆柏花粉变应原冻干品用ph6.5～7.5磷酸盐—盐水缓冲液复溶配置为圆柏花粉变应原原液，2～8℃放置，与等体积灭菌的甘油混匀，调节溶液ph值至6.0～8.0。

如上所述的制备方法，优选地，在步骤s2中，所述花粉脱脂采用花粉与丙酮以1：5～1:1的重量g体积ml比进行脱脂处理，重复脱脂至上层液体澄清。

如上所述的制备方法，优选地，在步骤s4中，所述离心的条件为8000～12000g，离心温度2～8℃，时间为15～20min；所述过滤及除菌过滤为先用4000目滤布过滤后，再通过纸板过滤、0.45μm和0.22μm滤膜依次过滤。

如上所述的制备方法，优选地，在步骤s5中，所述超滤浓缩用3kd或1kd超滤膜超滤，当超滤透过液总蛋白含量≤0.02mg/ml，停止超滤；当超滤透过液总蛋白含量>0.02mg/ml，更换超滤膜之后对超滤透过液重复超滤，直至超滤透过液总蛋白含量≤0.02mg/ml为止。

如上所述的制备方法，优选地，在步骤s6中，所述真空冻干的条件为-50～-35℃冻结，2～8mbar真空压力下，-25℃干燥，控制水分含量≤3％。

优选地，所述步骤s1还包括对原料圆柏花粉进行镜检鉴别和/或dna鉴定的步骤，其中dna鉴定方法为，以seqidno.1、seqidno.2为引物，对鉴别圆柏原料进行pcr扩增，并检测扩增产物。

如上所述的制备方法，优选地，所述磷酸盐—盐水缓冲液包括4.5～5.5g/l的氯化钠、0.03％～0.05％的磷酸二氢钾、1.5％～2％十二水合磷酸氢二钠和0.2％～0.4％的苯酚。

在制备圆柏花粉变应原进行浸提时，发明人尝试了多种浸提液，并且比较了它们的浸提效率。所使用的浸提液包括：0.8％的氯化钠、ph5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、ph6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、ph7.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、ph8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、ph8.2的coca’s液、ph8.9的tris-盐酸缓冲液、ph为7.9～8.2的含有4.5～5.5g/l的氯化钠及重量百分比含量为0.03％～0.05％的磷酸二氢钾，1.5％～2％十二水合磷酸氢二钠，0.2％～0.4％的苯酚等。实验结果证实，使用ph为7.9～8.2的含有4.5～5.5g/l的氯化钠及0.03％～0.05％的磷酸二氢钾，1.5％～2％十二水合磷酸氢二钠，0.2％～0.4％的苯酚的浸提效率较高，且制备的圆柏花粉变应原浸液可长期有效的保存，稳定性高。

本发明还提供一种圆柏花粉变应原冻干品，其由包括圆柏花粉收集-干燥-脱脂-提取-超滤浓缩-冻干的步骤制得：

(1)收集：用自然脱落法收集圆柏花粉；

(2)干燥：常温干燥或真空干燥或流化床干燥，直至花粉不再粘附，将干燥后的花粉过150～250目分样筛；

(3)脱脂：将(2)所得到的花粉与丙酮分别按g与ml计，以1：5～1:1的重量体积比进行脱脂处理，振荡脱脂30分钟后，静置分层，倒出上层液，加入新的丙酮，重复脱脂至上层液体澄清，将脱脂后的花粉均匀摊开，室温下干燥48小时至72小时；

(4)提取：将脱脂干燥后的圆柏圆柏花粉按重量体积比1:50～1:10加入10l，ph7.9～8.2磷酸盐—盐水缓冲液，2～8℃搅拌22～26h进行浸提；取提取后的浸提液，在离心力8000～12000g，离心温度2～8℃，时间设定为15～20分钟，进行离心，收取上清；先用4000目滤布过滤后，将滤液依次通过纸板过滤、0.45μm和0.22μm滤膜依次过滤；

(5)超滤浓缩：将过滤后的浸提液，用3kd或1kd超滤膜超滤，取样超滤浓缩液、超滤透过液，检测其总蛋白含量；其中，当超滤透过液中总蛋白含量≤0.02mg/ml，则直接排弃透过液；超滤透过液总蛋白含量>0.02mg/ml，则对超滤膜进行完整性测试，超滤膜未破损，则排弃透过液；若超滤膜破损，则更换超滤膜之后对透过液重复超滤；

(6)冻干：将超滤浓缩液经过二次过滤和除菌过滤后，按照冻干工艺条件：-50～-35℃冻结，2～8mbar真空压力下，-25℃干燥，控制水分含量≤3％，获得圆柏花粉变应原冻干品。

如上所述圆柏花粉变应原浸提物、所述圆柏花粉变应原浸液及所述圆柏花粉变应原冻干品的应用，用于在制备诊断变态反应疾病并对其进行特异性免疫治疗制剂中的应用，所述诊断变态反应疾病包括过敏性哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎和慢性荨麻疹。

进一步，所述圆柏花粉变应原浸提物冻干品用于制备成片剂、口崩片，所述圆柏花粉变应原浸液用于制备注射液、舌下滴剂、变应原斑贴剂、变应原浸液稀释液。

本发明提供的圆柏花粉变应原浸液用于制备治疗圆柏花粉过敏性疾病的药物使用。

具体而言，采用本发明提供的圆柏花粉变应原浸液或冻干品按治疗有效量或诊断有效量的圆柏花粉变应原、以及药学上可接受的载体可制备用于治疗圆柏花粉过敏性疾病的药物。

用于治疗圆柏花粉过敏性疾病的药物可以制成各种医学上可接受的剂型，并可由医师根据患者年龄、体重和大致疾病状况等因素确定对病人有益的剂量进行施用。用于治疗圆柏花粉过敏性疾病的药物的剂型选自口服剂、(皮下)注射剂、舌下含服剂、气雾剂、鼻腔剂、或皮肤点刺剂等液体剂型；优选(皮下)注射剂、舌下含服剂、或皮肤点刺剂。其中，(皮下)注射剂、舌下含服剂一般是作为特异性免疫治疗时常用的剂型，而皮肤点刺剂是作为体内变应原检测时常用的剂型。

当采用本发明圆柏花粉变应原浸液应用于诊断由圆柏花粉引起的过敏性疾病时(即变应原皮肤点刺诊断试验)，除了本发明圆柏花粉变应原浸液外，一般还应包括阴性对照液、阳性对照液、以及点刺针。阴性对照液一般为对人体无过敏性反应的液体(例如甘油与盐溶液的混合物等)，阳性对照液一般为1.0～5.0mg/ml的磷酸组胺/盐酸组胺溶液。

本发明制备的圆柏花粉变应原浸液可应用于斑贴试验中。其原理为：将可疑致敏物质(变应原)敷贴于患者皮肤上，通过皮肤或粘膜进入机体后由抗原呈递细胞将抗原呈递给t淋巴细胞，使特异性t淋巴细胞活化，诱发炎症反应。

本发明的有益效果在于：

1、圆柏作为北方地区主要花粉过敏原，本发明提供的圆柏花粉变应原浸液可以有效诊断由圆柏花粉诱发的变态反应疾病并对其进行特异性免疫治疗。

2、加入稳定剂甘油，提高了稳定性和缓释作用，提高了用药的有效性和安全性。

3、变态反应疾病皮下注射免疫脱敏给药方式，相比舌下含服滴剂给药方式，见效快，周期短。整个治疗周期给药剂量远小于舌下滴剂给药量(约100倍)，其治疗费用远小于舌下滴剂给药免疫脱敏，减轻患者的医疗负担。

4、本发明通过使用制备的应变原浸液按1:1000稀释液做皮内试验分别与变态反应专科医生临床综合特异性诊断和血清特异性ige(specificige，sige)诊断进行对比，皮内试验结果与临床综合特异性诊断及与血清sige诊断的结果一致、具有较好的灵敏度和特异度，安全性好。

本发明提供的圆柏花粉变应原浸液具有特异性高的特点，圆柏致敏蛋白组分提取充分，总生物效价稳定，有效期长，无菌保证好，可作为标准品使用；可有效用于变态反应疾病的皮肤点刺试验诊断及特异性免疫治疗，可有效诊断由圆柏花粉诱发的变态反应疾病并对其进行特异性免疫治疗。可实现标准化控制，使用有效期有效延长，能带来较好的经济效益。

本发明方法通过冻干复溶后得到的浸液，相比北京协和医院研制的圆柏花粉变应原注射原液更稳定，生物效价和蛋白含量都比较稳定，且效期为3年。

附图说明

图1为圆柏花粉原料its2序列pcr电泳结果。

图2为不同批次圆柏花粉不同脱脂时间脂肪含量变化趋势。

图3为圆柏花粉浸液总蛋白含量与浸提时间的关系。

图4为圆柏花粉变应原浸液sds-page蛋白电泳结果(示意成分鉴别)。

图5为圆柏花粉变应原浸液与圆柏过敏患者血清westernblotting反应检测结果(示意圆柏变应原成分鉴别)。

图6为圆柏花粉变应原浸液产品ph值在长期稳定性试验中的测试结果。

图7为圆柏花粉变应原浸液产品苯酚含量在长期稳定性试验中的测试结果。

图8为圆柏花粉变应原浸液产品甘油含量在长期稳定性试验中的测试结果。

图9为圆柏花粉变应原浸液产品氯化钠含量在长期稳定性试验中的测试结果。

图10为圆柏花粉变应原浸液产品总蛋白含量在长期稳定性试验中的测试结果。

图11为圆柏花粉变应原浸液产品总应变原活性在长期稳定性试验中的测试结果。

图12为圆柏变应原浸液与圆柏变应原注射液医疗机构制剂品种稳定性westernblotting对比研究。

图13为圆柏花粉变应原浸液产品应用于临床圆柏花粉过敏患者体外嗜碱性粒细胞活化试验结果示例。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1圆柏花粉原料的鉴别

由于原料的鉴别和纯度对于后续变应原诊断及治疗制剂极为重要，本实施例采用dna特异性序列检测加显微镜检对圆柏原料进行双重鉴别及质控。

1、圆柏花粉dna提取

采用天根快速dna提取扩增试剂盒(天根生化kg203)。

提取方法：称取5mg圆柏花粉样品置于1.5ml离心管中，加入buffer1100μl后用一次性研磨杵将样品彻底研碎后加入buffer2100μl后震荡混匀，离心机12000r/min离心5min后取上清液于新的离心管中作为dna模版备用。

2、引物设计及合成

引物序列如下：

sabcits2-f(seqidno.1)：5'-atgcgatacttggtgtgaat-3'

sabcits2-r(seqidno.2)：5'-gacgcttctccagactacaat-3'

引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。合成后分装-20℃保存。

3、pcr反应体系

pcr扩增试剂盒(天根生化)。对提取的dna采用如下50μl体系的配制pcr反应体系见表1：

表1.圆柏花粉its2序列pcr反应体系

4、pcr反应条件见表2.

表2.圆柏花粉its2序列pcr反应条件

对pcr扩增后的反应液进行2％琼脂糖电泳(加gengreen核酸染料)，150v、100ma20min电泳观察，电泳结果如图1所示。

5、测序

利用pcr产物纯化回收试剂盒(生工sk1141)，回收pcr产物进行测序，测序结果编号sabcits2，如seqidno.3所示。

6、圆柏的显微镜检

花粉粒近球形到扁球形，大小平均为20×23微米。具3沟，沟宽，沟端嚼烂状，沟膜上具排列不均匀的颗粒状纹饰。外壁两层明显，表面具网状纹饰。

实施例2圆柏花粉脱脂及浸提关健工艺步重要参数的确定

1、圆柏花粉脱脂工艺步参数确定

(1)将圆柏花粉(g)与丙酮(ml)以1：2的重量体积比(w/v)进行脱脂处理。对不同批次(不同采集时间)的圆柏花粉不同脱脂时间样品进行脂肪含量进行检测，以确定最优的脱脂时间。

采用海能sox500脂肪测定仪测定圆柏花粉中脂肪含量，通过索式萃取及干燥称重的方法，对比萃前后花粉重量的变化，得到相对应的脂肪含量，并根据脂肪含量结果对之后脱脂后花粉进行质量控制.

结果见图2，可见丙酮脱脂时间为30min后，脂肪含量几乎不随脱脂时间延长而下降，因此脱脂时间确定为30min。

(2)脱脂参数的验证：对不同批次(不同采集时间)的圆柏花粉进行30min脱脂后检测脂肪含量，结果如表3所示。

表3.不同批次圆柏花粉脱脂30min后脂肪含量降低百分比

从结果得知，圆柏花粉中脂肪含量在1％-2.1％左右，故在之后脱脂过程中，脱脂后的圆柏花粉在脂肪含量上应该下降1-2.1％左右，也就是花粉总重同比也应该下降1-2.1％左右。

2、圆柏花粉蛋白浸提工艺步重要参数确定

(1)将圆柏花粉(g)与丙酮(ml)以1：2的重量体积比(w/v)进行搅拌或振荡脱脂30分钟处理，静置分层，观察上层液体澄清情况，重复脱脂至上层液体澄清后，将脱脂后的花粉均匀摊开，室温下干燥48小时以上。

(2)将脱脂干燥后的圆柏花粉按重量体积比1:10加入10l，ph7.9～8.2磷酸盐—盐水缓冲液，2～8℃，在搅拌速度为250rpm条件下，在搅拌时间分别为3h、6h、9h、12h、18h、24h、48h、72h等提取点时，将提取后的提取液，将浸提液全部加入到离心桶内，调节平衡，离心力8000～12000g，离心温度4℃，时间设定为15～20分钟，进行离心，收取上清。

(3)将离心分离后的上清液先用4000目滤布过滤后，通过纸板过滤，0.45μm和0.22μm滤膜依次过滤；得到圆柏花粉粗提取液。

取样以bradford法测定蛋白含量，结果见图3。

如图3结果表明，在蛋白提取过程中，随搅拌提取时间延长，蛋白提取含量增大，提取时间24h含量达到最高329±5μg/ml，可见蛋白类物质提取时间过长会影响其蛋白含量，故提取时间优选为22～26h左右。

实施例4圆柏花粉变应原原液(冻干品)制备工艺

1、按实施例3圆柏花粉原料工艺制备圆柏花粉原料。

2、浸提

将脱脂干燥后的圆柏花粉按重量体积比1:50～1:10加入10l，本实施例中为1：10，以ph7.9～8.2磷酸盐—盐水缓冲液，2-8℃搅拌22～26h进行浸提。其中以配制1000ml磷酸盐—盐水缓冲液(ph8.2)为例的配方如表4。磷酸盐—盐水缓冲液充分溶解后除菌过滤，2～8℃放置，保存期不超过30天。

表4磷酸盐—盐水缓冲液(ph8.2)配方

3、固液分离

取提取后的浸提液，将浸提液全部加入到离心桶内，调节平衡，离心力8000～12000g，离心温度2～8℃，时间设定为15～20分钟，进行离心，收取上清；

4、澄清

将离心分离后的上清液先用4000目滤布过滤后，将滤液依次通过纸板过滤、0.45μm和0.22μm滤膜依次过滤；

5、超滤、透析、浓缩

过滤后的浸提液，用3kd或1kd超滤膜切向流超滤，优选地，本实施例中用3kd超滤膜超滤。透析液选用25-125mm的nh4hco3，本实施例中优选为50mm的nh4hco3。根据蛋白含量质量标准，超滤浓缩至适当体积，检测蛋白含量至质量标准的总蛋白含量区间。取样超滤浓缩液、超滤透过液，检测其总蛋白含量。当超滤透过液中总蛋白含量≤0.02mg/ml，则直接排弃透过液；超滤透过液总蛋白含量>0.02mg/ml，则对超滤膜进行完整性测试，超滤膜未破损，则排弃透过液；若超滤膜破损，则更换超滤膜之后对透过液重复超滤。

6、无菌过滤

用0.22μm膜除菌过滤。

7、冻干

按照冻干工艺条件，-50～-35℃冻结，2～8mbar真空压力下，-25℃干燥，控制水分含量≤3％；获得圆柏花粉变应原原液(冻干品)。

实施例5圆柏花粉变应原浸液成品制备工艺

1、复溶

将实施例4制备的圆柏花粉变应原冻干品用磷酸盐—盐水缓冲液(ph6.5～7.5，配方见表5)复溶，至总蛋白含量位于质量标准2倍范围区间。2～8℃放置。

表5.磷酸盐—盐水缓冲液(ph值6.5-7.5)配制

2、半成品配制

原液复溶后，在净化车间内a级洁净条件下，将复溶液与等体积预先湿热灭菌(121℃、30分钟)并冷却的甘油混匀，调节溶液ph值至6.0～8.0。

3、半成品除菌过滤、无菌分装为成品

在净化车间内a级洁净条件下，将半成品通过0.22μm滤膜除菌过滤，无菌分装为成品，得到ph6.0～8.0浅黄色至棕色液体即为圆柏花粉标准化变应原浸液成品。

实施例6圆柏花粉变应原浸液成品质量控制

1、实施例5制备的圆柏花粉标准化变应原浸总蛋白成分sds-page法鉴别

采用还原型sds-page法，分离胶浓度为4～12％，考马斯亮蓝染色。结果如图4所示。m为genstarm223-01marker，r为冻干内部参考品(即冻干的圆柏花粉变应原原液)，l1，l2和l3为不同批次圆柏花粉标准化变应原浸液，其蛋白分布主要在18kda、20kda、24kda、28kda、32kda、38kda、43.5～50.0kda、56kda、66kda、85kda。其中鉴定的致敏蛋白分子量、序列、过敏血清阳性率、对应全蛋白质谱鉴定肽段概览见表6。

2、圆柏花粉标准化变应原浸总变应原成分westernblotting法鉴别

采用还原型sds-pag电泳，分离胶浓度为4～12％，0.2μmpvdfimmobilonr-psq转印膜，一抗血清反应稀释度1：3，室温杂交2h，随后置于4℃冰箱杂交过夜，1×pbst洗3次，10min/次。。二抗msmabtohuige(ab99806)1：1000室温杂交2h，1×pbst洗3次，10min/次。将ecl显影液a液和b液1:1混匀后曝光显色。

结果见图5所示。其中，m为genstarm223-01marker，r为内部参考品，n为浸液与健康受试者血清反应条带，p1-21分别为21个浸液的样本与24例临床确诊的圆柏过敏阳性患者(sige≥3级，皮试≥+++，典型的夏秋季花粉症病史)血清反应条带结果图5(a)为p1-p9，图5(b)为p10-p21，其中致敏sabc1-sabc11的分子量及过敏血清阳性率汇总如表6，由此确定血清阳性率最高的sabc1(43.5～50.0kda)为圆柏花粉的主要致敏蛋白(血清阳性率最高，为76.2％)。

3、致敏蛋白序列测定

本发明产品对相应致敏蛋白(见表6)进行了全蛋白序列测定，并对圆柏花粉原料中每一致敏蛋白对应mrna进行了核苷酸全长测序，致敏蛋白代码、序列标识及氨基酸全长序列、对应mrna全长序列结果详见表6。

其中本发明所含圆柏致敏蛋白的全序列依次为：

sabc1致敏蛋白全序列为seqidno.4所示序列；

sabc2致敏蛋白全序列为seqidno.5所示序列；

sabc3致敏蛋白全序列为seqidno.6所示序列；

sabc4致敏蛋白全序列为seqidno.7所示序列；

通过对圆柏花粉原料中上述每一致敏蛋白对应mrna进行了核苷酸全长测序后，其mrna对应序列如下

sabc1致敏蛋白基因全序列为seqidno.8所示序列；

sabc2致敏蛋白基因全序列为seqidno.9所示序列；

sabc3致敏蛋白基因全序列为seqidno.10所示序列；

sabc4致敏蛋白基因全序列为seqidno.11所示序列；

4、质谱检测

对圆柏变应原浸液进行全蛋白质谱分析以及对圆柏变应原经sds-page分离后对应的胶条分别取样进行质谱鉴定，其主要包含且不限于以下肽段如：

sabc1质谱鉴定的肽段：

各肽段的氨基酸序列如seqidno.12-seqidno.30所示；

sabc2质谱鉴定的肽段：

其氨基酸序列如seqidno.31-seqidno.42所示；具体如下，

seqidno.31：sevsfvhldgak

seqidno.32：dltcgpghgmsigslgk

seqidno.33：nihgtsattaaiqlmcsdsvpcsnik

seqidno.34：fidtqnglr

seqidno.35：vdgtiaaypdpak

seqidno.36：vatcvnk

seqidno.37：hdstdafek

seqidno.38：iwmhfar

seqidno.39：wwsdqck

seqidno.40：kssavflvpank

seqidno.41：evtlmnspefhlvfgecdgvk

seqidno.42：espntdgidifask

sabc3质谱鉴定的肽段：

seqidno.43：ldqgqtwtvnlaagtasar

sabc4质谱鉴定的肽段：

seqidno.44：vvmeqsvheleevfk

seqidno.45：isgsdladilr

seqidno.46：slgsevgeaevk

表6圆柏花粉致敏蛋白分子量、序列、过敏血清阳性率情况概览

5、理化性质检测

该圆柏变应原浸液经理化性质检验后，其质量标准如表7：

表7圆柏花粉变应原浸液理化性质质量标准

6、总变应原活性测定

当变应原浸液包含治疗有效量或诊断有效量的圆柏花粉变应原时，用竞争性elisa法测定相对生物效价为5000bau/ml-20000bau/ml。

7、无菌检查

不得有菌生长。

实施例7圆柏花粉变应原浸液成品稳定性试验

对实施例5制备的圆柏花粉标准化变应原浸液成品在2-8℃下进行长期稳定性研究试验，分别对三个批次样品分别检测0时，3个月，6个月，9个月和12个月的ph值变化，苯酚含量，甘油含量，氯化钠含量，蛋白含量和总变应原活性的变化情况，结果如图6至图11所示。

从上述稳定性结果中，可以发现在12个月长期试验中，圆柏花粉标准化变应原浸液各质控参数虽有不规则波动，可能是实验误差导致，但均在质量标准质控范围内，且不同批次间变化趋势基本一致，这说明按照本发明所述的圆柏花粉标准化变应原浸液，在2-8℃条件下，至少12月内能稳定地保存。因此，圆柏花粉变应原浸液成品的效期合理预计在36个月。

实施例8本发明圆柏变应原浸液与圆柏变应原注射液医疗机构制剂(北京协和医院)westernblotting对比研究

本发明变应原浸液组方中加入了50％的甘油作为稳定剂，优化了磷酸盐缓冲液ph及配方，使其更适合花粉变应原的浸提及保存，且原料经dna条码技术鉴定，保障了纯度，原液采用了优化的冻干工艺，上述设计及工艺实现使按发明获得的变应原浸液成品稳定好、变应原活性得到良好保存，从而提高临床使用的有效性和安全性。为验证本发明下的处方及工艺对圆柏变应原活性保存优于已有工艺及处方配制的同品种圆柏变应原粗提液，本实施例针对圆柏变应原浸液(本发明，即下述为a的产品)及圆柏变应原注射液医疗机构制剂(北京协和医院配制，采用ph为8.2的coca’s液提取，主要成分0.5％的nacl、0.275％nahco3、0.4％的苯酚和注射用水，即下述为b的产品)做了稳定性对比研究。

本实施例通过对比a产品和b产品4℃(温度控制2～6℃，避光保存)长期放置12月后，分别在0点和12月取样，以产品与圆柏过敏患者血清池(15例圆柏过敏患者组成的血清池，sige≥3级，皮试≥+++，典型的夏秋季花粉症病史者入选)的westernblotting反应评价稳定性差异。

试验采用还原型sds-pag电泳，分离胶浓度为4～12％，0.2μmpvdfimmobilonr-psq转印膜，一抗血清反应稀释度1：3，室温杂交2h，随后置于4℃冰箱杂交过夜，1×pbst洗3次，10min/次。。二抗msmabtohuige(ab99806)1：1000室温杂交2h，1×pbst洗3次，10min/次。将ecl显影液1:1混匀后曝光显色。

结果见图12所示，其中，m为蛋白分子量marker(genstar)，n为浸液与健康受试者血清反应条带，l1和l2分别为本发明产品0时(a0)和12月(a12)与血清池反应结果，l3和l4分别为原医院制剂0时(b0)和12月(b12)与临床血清池反应条带结果。结果表明，本发明产品a对比原制剂b，sabc4(18kd)的蛋白活性得以保存，本发明产品比原医院制剂产品在4℃放置12月后，不仅主要致敏蛋白条带清晰，其余多个致敏条带反应仍较明显，说明本发明产品中圆柏致敏蛋白更为丰富，保存较好，活性也较高从而证实本发明产品更为稳定、有效。以相对生物效价为5000bau/ml、10000bau/ml、15000bau/ml、20000bau/ml的变应原浸液(对应总蛋白浓度约0.40mg/ml、0.80mg/ml、1.2mg/ml、1.60mg/ml)进行血清反应均能得到清晰条带。

实施例9评价应用1

本发明的制备的圆柏花粉变应原浸液对圆柏花粉过敏进行临床特异性皮试诊断的有效性和安全性。方法：选择2015-08-24日至2016-09-21间，在北京协和医院变态反应科门诊就诊的、患有过敏性结膜炎、过敏性鼻炎、过敏性哮喘、荨麻疹、过敏性皮炎等过敏性疾病的门诊患者1029例。对受试者进行圆柏花粉变应原皮肤点刺试验(skinpricktest，spt)，采用制备的应变原浸液按1:1000稀释液进行，以平均风团直径(meanwhealdiameter，mwd)为判读标准；以花粉sige为标准，做roc分析，分析不同诊断界值下，采用圆柏花粉变应原浸液用于诊断圆柏花粉过敏的准确性。同时记录不良事件，评价安全性。结果(results)共入组门诊患者1029例(4～70岁)，无脱落病例，剔除率25.66％。安全集(safetyset，ss)1026例，全分析集(fullanalysisset，fas)1007例，符合方案集(perprotocolset，pps)765例。年龄最小6岁，最大67岁。分析pps集的roc曲线，估算圆柏花粉spt的最佳诊断阈值为mwd5.25mm；特异度达95％时的诊断阈值为mwd5.75mm。分别以mwd3mm(国际通用阈值)、3.25mm、4.75mm为诊断阈值，本发明的圆柏花粉变应原浸液用于诊断圆柏花粉过敏的灵敏度依次降低，分别为0.7400(95％ci：0.7016～0.7784)、0.7000(95％ci：0.6598～0.7402)、0.5320(95％ci：0.4883～0.5757)；特异度依次升高，分别为0.7698(95％ci：0.7191～0.8205)、0.8264(95％ci：0.7808～0.8720)、0.9509(95％ci：0.9249～0.9769)。1029例患者中有6例出现7次不良事件，不良事件发生率0.583％(6/1029)，主要表现为流涕，喷嚏，鼻痒、呼吸不畅、眼痒、胸闷、点刺局部皮肤反应等。无严重不良事件。结论：本发明圆柏花粉变应原浸液用于诊断圆柏花粉过敏，诊断价值较高，安全性好，可作为圆柏花粉过敏原特异性体内诊断的临床检查方法。

实施例10评价应用2

本发明的制备的圆柏花粉变应原浸液对圆柏花粉过敏患者全血进行嗜碱性粒细胞活化试验，能进行临床特异性过敏体外诊断。这个检测方法在ige或非ige介导的过敏反应中均适用，可以用于部分sige体外诊断存在假阴性、假阳性患者的确诊及部分过敏性休克患者不适于进行皮试诊断的情况。

试验原理：变应原与患者全血细胞反应可以模拟人体内变态反应过程：即特异性ige抗体通过与相应的变应原桥联结合到细胞表面，激活细胞内信号级联导致嗜碱性粒细胞(ccr3持续表达于嗜碱性粒细胞，是其特异性标记)的活化脱颗粒。在这个脱颗粒的过程中，细胞内复合物影响跨膜蛋白cd63(gp53)，使其外表达于细胞表面，并暴露于细胞外基质中，因此可以依赖流式细胞术原理(使用抗人趋化因子受体ccr3-藻红蛋白(anti-ccr3-pe)对嗜碱性粒细胞进行标记，使用抗人cd63单克隆抗体-异硫氰酸荧光素(anti-cd63-fitc)对活化状态的嗜碱性粒细胞进行标记，非特异性细胞活化剂fmlp作为一种阳性质控)，并以嗜碱性粒细胞脱颗粒的百分数变化来判断受试者是否对特定变应原过敏。方法：选择健康受试者、圆柏过敏患者，取其edta抗凝全血样本，以刺激缓冲液(阴性对照)、圆柏变应原浸液(对1：10³～10¹⁰稀释比例进行优化，本实施例中取1：10⁸)、fmlp刺激液(阳性质控)作为嗜碱性粒细胞的激活物，加入到全血中，然后加入anti-cd63-fitc、anti-ccr3-pe染色，48h内上流式细胞仪进行检测。结果：见图13。健康受试者以阴性对照、圆柏变应原浸液、阳性对照为嗜碱性粒细胞活化物时，其嗜碱性粒细胞活化率分别应＜15％、＜15％、≥15％，圆柏花粉过敏患者以阴性对照、圆柏变应原浸液、阳性对照为嗜碱性粒细胞活化物时，其嗜碱性粒细胞活化率分别应＜15％、≥15％、≥15％。结论：该圆柏变应原浸液能有效作为活化物运用于嗜碱性粒细胞活化试验，并依据其判断标准有效做出临床诊断。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>中国医学科学院北京协和医院

<120>一种圆柏花粉变应原浸提物、其浸液及其制备方法

<150>2018102436579

<151>2018-03-23

<160>46

<170>siposequencelisting1.0

<210>30

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>30

atgcgatacttggtgtgaat20

<210>31

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>31

gacgcttctccagactacaat21

<210>32

<211>456

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>32

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<210>32

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<212>prt

<213>aminoacid

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metalaserprocysleuilealapheleuvalpheleucysalaile

151015

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202530

serasntrpglyglnasnargmetlysleualaaspcysalavalgly

354045

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505560

thrseralaaspaspasnprovalasnprothrproglythrleuarg

65707580

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100105110

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115120125

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130135140

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145150155160

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165170175

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180185190

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195200205

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210215220

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225230235240

asnglnpheglyproasnalaglyglnargmetproargalaargtyr

245250255

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275280285

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290295300

glycysgluserthrseralacysalaasntrpvaltrpargserthr

305310315320

argaspalapheserasnglyalatyrphevalserserglylysile

325330335

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340345350

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<210>5

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<212>prt

<213>aminoacid

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151015

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115120125

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370375380

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405410415

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420425430

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435440445

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450455460

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100105110

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metlysleualaaspcysalavalglypheglyserserthrmetgly

151015

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<211>16

<212>prt

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<400>15

leualaaspcysalavalglypheglyserserthrmetglyglylys

151015

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<211>11

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<213>aminoacid

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1510

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<213>aminoacid

<400>17

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15

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151015

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20

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<210>21

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<212>prt

<213>aminoacid

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1510

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151015

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1510

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<210>28

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<212>prt

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151015

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<211>12

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<213>aminoacid

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<212>prt

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<212>prt

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151015

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15

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15

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15

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1510

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1510