一种脱细胞蛋白支架消毒新方法与流程

本发明涉及组织工程技术领域，具体地说，是一种脱细胞蛋白支架消毒新方法。

背景技术：

组织工程是通过工程学的方法以及生命科学原理来探索正常或病理状态下哺乳动物组织结构和功能关系的一个研究领域，其最终目的是可以研发出替代的功能性生物材料来修复，维持甚至改进组织功能。脱细胞蛋白支架是目前组织工程和器官再生领域的热点，具有重建功能性器官并移植、修复人体的前景，全器官脱细胞是产生蛋白支架的主要方法，但是脱细胞程序只能移除器官里的细胞成分，并无法完全清除器官中的芽孢，这对蛋白支架的再细胞化是不利的，细菌的污染导致全器官重建效率的降低，增加了成本，理想的蛋白支架消毒方式应该是既能杀灭胶原蛋白支架里的细菌和芽孢，又不至导致蛋白支架变性，同时还能有利于后期再细胞化时细胞的生长。

现有最常使用的脱细胞蛋白支架消毒的物理方法为电子射线(electronbeam,e-beam)以及γ射线，但是它们都存在相应的问题。比如，e-beam和γ射线对组织含水量较为敏感，含水量多辐射效果好，所需射线剂量小；含水量少则与之相反；不同体积的蛋白支架没法非常精准地确定消毒所需的离子射线的剂量，因此只能边做边摸索，因为无法精准量化，所以只能采用大剂量长时间的照射，虽然消毒效果好，但射线本身会造成蛋白支架中蛋白成分的变性，肽链结构的断裂，蛋白支架机械力学特性的改变(弹性降低，强度降低等)，以及生物相容性(biocompatibility)的改变。

已知的化学消毒方法所产生的化学反应不仅仅可以消毒蛋白支架，同时也会交联(cross-link)肽链，蛋白支架的肽链被交联后会导致其失去弹性，机械力学特性降低，甚至可能在体内激活免疫反应。另外，并不是所有的消毒用品都适用于蛋白支架消毒，乙醇(ethylalcohol)和异丙醇(isopropyl)无法杀灭细菌芽孢，水银则是有毒物质，不能用于人体，限制了蛋白支架的应用，环氧乙烷(ethyleneoxide)会溶解软组织，限制了其在蛋白支架消毒中的应用,目前比较常用的化学蛋白支架消毒方法仍然是强酸消毒法(过氧乙酸或spor-klenz)，但这种消毒法也仍然存在交联肽链，导致机械力学特性降低等缺陷。

上述的这些蛋白支架的消毒方法都有缺陷，并且对蛋白支架的消毒效率较低。理想的消毒方法应当如前所述，既能消毒蛋白支架，又不致蛋白支架物理和生物学特性改变。

过氧乙酸(peraceticacid)是一种杀菌消毒试剂，已被广泛应用于器械表面消毒。但是，如果直接将过氧乙酸应用于蛋白支架的消毒，则同样也会导致组织肿胀，蛋白溶解、变性，因为过氧乙酸是一种强酸。

口腔医学杂志(jpractstomatol)2010jan,26(1)记载了评价三种消毒方法处理脱细胞神经支架的生物相容性，该文献记载了三种消毒方法，具体内容是：取新鲜york猪神经，应用改良的naoh消蚀技术处理后，分别应用60co、eto和0.1％paa三种消毒方法处理；观察不同实验组ans的细胞毒性、体外胶原酶敏感性、细胞相容性和植入后局部反应，评价应用不同消毒方法对ans的生物相容性的影响。结果表明：应用paa消毒效果最佳，但该消毒方法仅能保证消毒效果好，对于组织肿胀，蛋白溶解、变性等问题无法保证。

因此，发明人针对上述缺陷做了改进，用10％氢氧化钠中和了过氧乙酸，单纯利用过氧乙酸的氧化特性来对脱细胞蛋白支架进行消毒。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种脱细胞蛋白支架消毒新方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种脱细胞蛋白支架消毒新方法，是将组织脱细胞后，用中和后的过氧乙酸溶液联合高张溶液对脱细胞蛋白支架消毒灭菌，所述消毒新方法包括如下步骤：

(1)消毒液的制备：首先用去离子水将过氧乙酸溶液稀释到质量百分浓度为0.1％-0.5％，然后用10％氢氧化钠溶液中和稀释后的过氧乙酸溶液至ph为7.0-7.5，最后加入氯化钠、氯化钾或氯化钙晶体粉末使溶液浓度变为1-2mol/l，得到高张、中性消毒溶液；

(2)脱细胞蛋白支架的消毒：取步骤(1)中的消毒溶液持续灌洗或者浸泡蛋白支架，持续时间为5min-30h；

(3)用无菌去离子水、生理盐水或pbs溶液冲洗步骤(2)中消毒后的蛋白支架，即可。

作为本发明的一个优选实施方案，所述消毒新方法包括如下步骤：

(1)消毒液的制备：首先将1000ml去离子水与体积为2.8ml、质量百分浓度为35％的过氧乙酸溶液混合，然后用5.6ml10％氢氧化钠溶液中和稀释后的过氧乙酸溶液至ph为7.0-7.5，最后加入质量为58g的氯化钠晶体粉末，得到消毒溶液；

(2)脱细胞蛋白支架的消毒：取步骤(1)中的消毒溶液持续灌洗或者浸泡蛋白支架，持续时间为5min-30h；

(3)用无菌去离子水、生理盐水或pbs溶液冲洗步骤(2)中消毒后的蛋白支架，即可。

作为本发明的一个优选实施方案，所述步骤(1)中的10％氢氧化钠中和过氧乙酸是在超净层流操作台上进行。

作为本发明的一个优选实施方案，所述高张离子溶液是用氯化钠、氯化钾或者氯化钙晶体粉末配置的。

作为本发明的一个优选实施方案，所述组织包括血管、肌腱、皮肤、心脏、肺和肠道。

可用氯化钠、氯化钾或者氯化钙晶体粉末配置高张溶液，高张溶液对应离子浓度为1-2mmol/l，具体加入的晶体质量可通过计算得出。

对于肠道或大气道来源等的脱细胞支架，因其细菌含量较多，可用稍高浓度的过氧乙酸，反之亦然。

第一次用10％氢氧化钠溶液滴定过氧乙酸溶液时，用电磁搅拌的方法边搅拌边滴定，ph检测探头同时置入溶液中，记下ph中和到7.0所需的10％氢氧化钠的量，此后过氧乙酸的配置便无需重复此步骤，直接加入10％氢氧化钠溶液混匀即可。

消毒的时间根据蛋白支架的体积、来源、可能的细菌负担来最终确定。

由于过氧乙酸在稀释的溶液中会快速还原，因此我们通常在开始消毒蛋白支架前临时配置消毒溶液，根据文献报道，0.5％过氧乙酸溶液消毒效力半衰期为3天。

本发明优点在于：

采用本发明的消毒方法，既能彻底对脱细胞蛋白支架消毒，又不会对蛋白支架的机械强度造成影响，而且高渗盐水可以防止组织长时间浸泡在pbs中导致的蛋白支架水肿，对后期组织工程的开展有很大的好处，同时对细胞接种成活率影响较小；

此外，所选用的过氧乙酸的浓度低、成本低，而且所用原料均是易得原料，来源便捷；

再者，本发明的消毒方法简单易操作，具有很强的实用性及很好的应用前景。

附图说明

附图1是经过脱细胞后的蛋白支架，图中显示脱细胞处理后的气管只剩下蛋白支架，所有细胞成分已被全部移除。

附图2是不同消毒方式对脱细胞蛋白支架机械强度的影响(每组三个重复)。

附图3是组织切片h&e染色图。脱细胞气管支架切块后在不可贴壁96孔板中用a549细胞进行再细胞化，用dmem-f12培养液+10％胎牛血清进行培养，接种24小时后，对组织切片进行h&e染色(每组三个重复)。

附图4是经过24小时接种a549细胞后的组织切片染色图，a为对照组，因发生污染，再细胞化失败，b为过氧乙酸消毒组，c为高张中性过氧乙酸消毒组，d为β射线消毒组。

附图5是a549细胞接种不同组别脱细胞支架后24小时后支架覆盖率(coveragerate,cr)结果示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1脱细胞蛋白支架消毒液的制备

1实验原材料

1000ml去离子水，58g氯化钠晶体粉末，体积为2.8ml、质量百分浓度为35％过氧乙酸溶液，5.6ml10％氢氧化钠溶液。

2配制方法

首先用1000ml去离子水将2.8ml、质量百分浓度为35％过氧乙酸溶液稀释，然后用5.6ml10％氢氧化钠溶液中和稀释后的过氧乙酸溶液至ph为7.0-7.5，最后加入浓度为1.5mol/l、质量为58g的氯化钠晶体粉末，混匀得到消毒溶液。

配置溶液的操作需在层流超净台中完成。

第一次滴定过氧乙酸溶液时，用电磁搅拌的方法边搅拌边滴定，ph检测探头同时置入溶液中，记下ph中和到7.0所需的10％氢氧化钠的量，此后过氧乙酸的配置便无需重复此步骤，直接加入10％氢氧化钠溶液混匀即可。

实施例2脱细胞蛋白支架的消毒方法效果评价

1实验原材料

猪的气管，人a549细胞，1000ml去离子水，58g氯化钠晶体粉末，体积为2.8ml、质量百分浓度为35％过氧乙酸溶液，5.6ml10％氢氧化钠溶液，0.1％sds溶液，0.1％tritonx溶液，pbs溶液。

2实验方法

2.1猪气管脱细胞处理

先将猪的气管剪成3*2cm小段，在conicaltube中进行脱细胞处理，脱细胞方案如下：

(1)用0.1％sds溶液持续摇晃30h，每6小时更换一次sds溶液；

(2)更换去离子水持续摇晃12小时，每4小时更换一次去离子水；

(3)更换0.1％tritonx溶液持续摇晃12小时，每4小时更换一次tritonx溶液；

(4)更换无菌pbs溶液持续摇晃72小时，每6小时更换一次pbs溶液。

经上述步骤后，猪的气管已被脱细胞，只剩下蛋白支架(图1)。

2.2分组

将上述脱细胞后的蛋白支架分为四组：对照组(脱细胞支架不消毒)、实验一组(过氧乙酸(pa)消毒一小时)、实验二组(高张中性过氧乙酸溶液消毒24小时)、实验三组(electronbeamradiation(β)射线消毒，放射剂量20kgy，10mev能量源)。

2.3脱细胞蛋白支架的消毒

对照组按照如下方法处理：直接将上述脱细胞处理后的蛋白支架放在细菌培养基(broth)试管中培养48小时，观察溶液是否变浑浊并记录；

实验一组按照如下方法处理：首先将脱细胞后的蛋白支架在2.8ml、质量百分浓度为35％过氧乙酸溶液浸泡消毒一小时，然后将消毒后的蛋白支架放在细菌培养基(broth)试管中培养48小时，观察溶液是否变浑浊并记录；

实验二组按照如下方法处理：首先将脱细胞后的蛋白支架在实施例1得到的消毒液中消毒浸泡24小时，然后将消毒后的蛋白支架放在细菌培养基(broth)试管中培养48小时，观察溶液是否变浑浊并记录；

实验三组按照如下方法处理：首先将脱细胞后的蛋白支架在放射剂量20kgy、10mev能量源的β射线下消毒一小时，然后将消毒后的蛋白支架放在细菌培养基(broth)试管中培养48小时，观察溶液是否变浑浊并记录。

2.4机械强度测试

对上述四组消毒处理后的支架做机械强度测试，使用sutureretentionstrength(srs法)，根据ansi/aami心脏血管植入物指南中的规定，分别对四组蛋白支架进行机械强度测试，将缝线从生物材料中以恒定的缝合深度(2mm)及特定的抽离速率(10cm/min)抽离出生物材料所需的机械强度定义为srs机械强度，用于测量srs机械强度所用的机器为instronmachine(model3345singlecolumnmaterialstestingsystem)。记录实验结果。

上述所述生物材料均是指消毒处理后的蛋白支架。

2.5脱细胞蛋白支架进行再细胞化

对上述四组的脱细胞蛋白支架进行再细胞化，接种的细胞为人a549细胞，这是一种常用的人肺癌细胞株，用该细胞来重建脱细胞猪气管支架，在种植细胞前，先用20lpbs缓冲溶液连续冲洗浸泡四组蛋白支架，以洗脱有害物质，而后在96孔板里进行培养，如图3。洗脱结果见图4。将细胞覆盖的区域长度除以总组织长度，计算细胞覆盖率(coveragerate，cr)，每组三个重复，比较组间差异，对不同消毒方法组及对照组接种a549细胞后24小时细胞覆盖率进行one-wayanova检验，记录结果。

3实验结果

3.1细菌培养基浑浊情况

四组蛋白支架在细菌培养基中的浑浊情况如表1所示。

表1

细菌培养液浑浊，则证实被污染，实验结果表明：对照组被污染，实验一、二、三组均未被污染。

3.2机械强度测试结果

实验结果如图2所示，结果显示：四组平均srs机械强度在p<0.05水平存在显著的统计学差异[f(3,8)＝61.63,p<0.05]，因为发现显著统计学差异，我们对每个组的均数与其他任意组的均数进行两两比较，进行turkeyhsd事后检验(turkeyhsdposthoctest)，结果显示：对照组(20.43±0.66,n＝3)vs过氧乙酸组(25.13±0.46,n＝3)，对照组vsβ射线组(17.13±0.20,n＝3)，过氧乙酸组vs高张过氧乙酸组(19.83±0.15,n＝3)，过氧乙酸组vsβ射线组，高张中性过氧乙酸组vsβ射线组均有显著统计学差异，仅对照组和高张中性过氧乙酸组在蛋白支架机械强度上无区别。

3.3脱细胞蛋白支架进行再细胞化结果

四组覆盖率结果如图5所示，结果显示：四组平均覆盖率在p<0.05水平存在显著的统计学差异[f(3,8)＝492.3,p<0.05]，因为发现显著统计学差异，我们对每个组的均数与其他任意组的均数进行两两比较，同时用holm-sidaktest对比较结果进行校正，结果显示：对照组(0±0，n＝3)vs过氧乙酸组(0.2±0.02,n＝3)，对照组vsβ射线组(0.81±0.02,n＝3)，对照组和高张中性过氧乙酸组(0.87±0.03,n＝3)，过氧乙酸组vs高张过氧乙酸组，过氧乙酸组vsβ射线组均有显著统计学差异，仅高张中性过氧乙酸组vsβ射线组在细胞覆盖率上无区别。

4结论

综上所述，使用高张中性过氧乙酸消毒脱细胞的蛋白支架，在消毒效果上可以和传统上使用的强酸(过氧乙酸)和射线(β射线)相媲美，但是强酸会使蛋白支架变性，机械强度变大，弹性减退，而射线则会使蛋白支架变脆弱，机械强度减弱，这样的物理特性的改变，可能会对后期组织工程中再细胞化以及组织在体内的存活造成不利的影响，而高张中性过氧乙酸消毒法，则不会对蛋白支架的机械强度造成影响，而且高渗盐水可以防止组织长时间浸泡在pbs中导致的蛋白支架水肿，对后期组织工程的开展有很大的好处，再者前期的a549细胞接种试验证实高张中性过氧乙酸溶液不仅可以消毒蛋白支架，同时对细胞接种成活率影响较小。

本发明的消毒方法对脱细胞处理后的蛋白支架的消毒效率高，可防止细菌污染，又可减少对脱细胞蛋白支架物理特性的影响，能减轻蛋白支架长时间浸泡导致的水肿，有利后期再细胞化过程，具有很好的应用前景。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。