一种在体电生理学引导下的单细胞标记装置的制作方法

本发明属于细胞标记领域，具体涉及一种在体电生理学引导下的单细胞标记装置及其制备方法，该单细胞标记装置结合了细胞电生理学记录技术和示踪电离子透如法细胞标记技术，可以实现在体单个神经元在完整神经网络条件下结构与功能的相关性的展示。

背景技术：

大脑一定区域的电活动是动物特定的功能或相关行为的标志，是动态关联脑区不同神经环路活动的总和。神经环路是由各种各样的神经元细胞组成的，它们在形态结构、内在特性、分子识别、通路连接和神经投射等方面各有其特征。阐明脑功能或行为的细胞基础需要识别单个神经元的作用。一种方法是动物行为状态下的神经元特征性放电活动可以作为脑功能状态的标志；另一种方法是将该活动脑区可以用组织化学的方法进行定位与分析，但这两种方法不能确定单细胞水平的结构-功能的关联性。因此，难以明确脑功能活动区不同的神经元构成及各自的作用特征。如何实现在体单个神经元在完整的神经网络条件下单细胞功能与结构的相关性研究，这是当前神经科学研究中非常迫切需要解决的问题。

技术实现要素：

针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种在体电生理学引导下的单细胞标记装置。该单细胞标记装置可以对神经元细胞进行定向标记，使得在体单个神经元细胞外的放电活动特征及其神经元的递质类型和形态结构特征解剖可视化。

为了解决以上技术问题，本发明的技术方案为：

一种在体电生理学引导下的单细胞标记装置，包括脑立体定位仪、ag/agcl电极、玻璃微管、信号采集电极、示踪电极、电源和信号采集系统，其中，所述脑立体定位仪的三维微操作仪的只有端设置有固定座，所述玻璃微管竖向固定于所述固定座上，且玻璃微管的下端向下延伸出固定座；

所述玻璃微管包括毛细管本体和设置于毛细管本体端部的尖端，尖端的流道与毛细管本体的流道相通；

所述ag/agcl电极的一端插入玻璃微管的毛细管本体的流道中，另一端通过信号采集电极与信号采集系统连接；

所述示踪电极的一端与所述ag/agcl电极连接，另一端与电源连接。

向所述玻璃微管中灌注含有示踪剂neurobiotintm的0.5m的氯化钾溶液，玻璃微管在脑立体定位仪的三维操作仪的带动下缓慢向下移动，进而带动玻璃微管的尖端缓慢向下移动，使尖端插入试验动物的大脑。由于氯化钾溶液导电，神经元细胞的放电信号会通过氯化钾溶液传递给ag/agcl电极，并通过ag/agcl电极和信号采集电极传递给信号采集系统，由信号采集系统记录并显示玻璃微管尖端所处环境。当信号采集系统分辨出信噪比较高的单细胞时，便进行神经元单细胞的信号采集与记录。

记录完成后，打开所述电源，电源通过示踪电极向含有示踪剂neurobiotintm的0.5m的氯化钾溶液中提供一定的脉冲微电流，氯化钾溶液中的示踪剂在脉冲微电流的作用下发生微电泳，自玻璃微管的尖端流出至神经元单细胞内，进而实现了神经元单细胞的特异性标记。

进一步的，所述玻璃微管的尖端的内径为2-3μm，电阻为5-15mω。

玻璃微管的尖端是用于采集单个细胞放电，尖端太粗会采到多个细胞同时放电。神经细胞放电非常弱，为得到比较高的电压值显示在屏幕上，必须要高阻抗。

进一步的，所述玻璃微管的尖端的长度为0.3-1cm。

长度根据采集脑内区域的深浅而定。

进一步的，所述玻璃微管的毛细管本体的内径为0.8-0.9mm。

进一步的，所述毛细管本体的流道内壁粘贴微丝。

微丝是沿毛细管长轴壁内粘贴的微小的玻璃棒，作用一是产生毛细管作用有利于管内溶液的灌注，二是降低灌注溶液时气泡的产生。

向毛细管本体的流道内壁粘贴微丝有利于将向其中灌注含有示踪剂的氯化钾溶液，同时防止灌注过程中气泡的产生，从而解决灌注过程中产生的气泡因灌注液粘稠而被困在玻璃微管中的难题，进而可以保证单细胞标记的顺利进行。

进一步的，所述玻璃微管由毛细玻璃管通过微电极拉制仪拉制而成。

采用毛细玻璃管通过微电极拉制仪拉制而成，可以根据被注射的核团的位置和大小，灵活调整玻璃微管尖端的锥度和直径大小，具有较好的定位性。

进一步的，所述ag/agcl电极的直径为0.4-0.6mm。

进一步的，所述电源提供的电流的频率为2-4hz，每个周期的电流持续时间为0.2-0.3s，电流的大小为0.5na-10na。

进一步的，所述信号采集系统提供的采样率为20khz，频率为300-1000hz。

本发明的有益效果为：

该单细胞标记装置可以对神经元细胞进行定向标记，使得在体单个神经元细胞外的放电活动特征及其神经元的递质类型和形态结构特征解剖可视化。可以用于整体神经结构中的细胞识别和神经通路的追踪，在单细胞水平监测细胞功能和形态，建立动物行为的脑结构和相应功能的联系。

该单细胞标记装置可以与其他电生理技术(如脑电记录和脑内电刺激)、电子显微镜、免疫组化、分子和/或遗传技术相结合。为研究大脑细胞间通信的遗传、分子、生理和结构基础等方面提供的一种高标准技术工具。这一技术将有助于将脑功能研究推向单细胞精度，有助于在单细胞精度下对正常及病理状态的神经元进行研究。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1为ag/agcl电极的制备装置；

图2为本发明的一个实施例的用于单细胞标记装置的结构示意图；

图3为本发明的一个实施例的玻璃微管的结构示意图。

其中，1、三维操作仪，2、ag/agcl电极，3、信号采集电极，4、玻璃微管，5、固定座，6、示踪电极，7、过渡段，8、尖端。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

脑立体定位仪(stoeling，usa)又称脑固定装置，它是利用颅骨外面的标志或其他参考点所规定的三度坐标系统，来确定皮下某些神经结构的位置，以便在非直视暴露下对其进行定向的刺激、破坏、注药物、引导电位等研究。

如图2所示，一种在体电生理学引导下的单细胞标记装置，包括脑立体定位仪、ag/agcl电极2、玻璃微管4、信号采集电极3、示踪电极6、电源和信号采集系统，其中，所述脑立体定位仪的三维微操作仪1的只有端设置有固定座5，所述玻璃微管4竖向固定于所述固定座5上，且玻璃微管4的下端向下延伸出固定座5。

信号采集与示踪电极均通过ag/agcl传导。ag/agcl有两个作用，具体如下：

首先，信号在玻璃微管尖端得到后→经毛细管内的液体传导至→ag/agcl电极→传导信号至放大器，再经屏幕以波形的形式显示；

然后，在采集到理想波形后，微电泳仪发出微小电流→经ag/agcl传导至→毛细管内液→毛细管尖端→微渗透至发放信号的细胞。

如图3所示，所述玻璃微管4包括毛细管本体和设置于毛细管本体端部的尖端8，尖端8和毛细管本体之间连接有过渡段7，过渡段7为锥体结构，锥体结构的大径端与毛细管本体连接，小径端连接所述尖端8，尖端8的流道与毛细管本体的流道相通；

所述ag/agcl电极2的一端插入玻璃微管4的毛细管本体的流道中，另一端通过信号采集电极3与信号采集系统连接；

所述示踪电极6的一端与所述ag/agcl电极2连接，另一端与电源连接。

玻璃微管4的尖端的内径为2-3μm，电阻为5-15mω；尖端的长度为0.3-1cm。玻璃微管的毛细管本体的内径为0.8-0.9mm。毛细管含有本体的流道内加入微丝。向毛细管本体的流道内加入微丝有利于将向其中灌注含有示踪剂的氯化钾溶液，以及防止灌注时气泡的产生，从而解决灌注过程中产生的气泡因灌注液粘稠而被困在玻璃微管中的难题，进而可以保证单细胞标记的顺利进行。

玻璃微管的制备方法

细胞外记录使用的是带有纤维微丝的毛细玻璃管(外径1.7mm,内径0.89mm南京六合然泰教学器材厂)，毛细玻璃管加入微丝有利于含生物素管内液的灌注以及防止灌注时气泡的产生，从而解决灌注过程产生的气泡因灌注液粘稠而被困在电极中的难题。使用微电极拉制仪(p-97，sutter,usa)将毛细玻璃管拉制成微电极(尖端内径2-3μm,电阻5-15mω)，采用微电极拉制仪拉制时，能根据被注射的核团位置、大小灵活调整玻璃微管尖端的锥度和直径大小，使用方便，定位性好。

ag/agcl电极的制备

如图1所示，agcl电极用银丝的规格为：含银量99％，直径0.5mm，美国sigmaaldrich，银丝用砂纸打磨、用硝酸溶液浸泡后作为工作电极，参考电极为铂电极，二者均放入2mol/l的盐酸溶液中，银丝与电源正极相连，铂电极电源负极相连，电源采用直流电源，1.5v直流电压供电，工作电流控制在0.04ma左右，持续3小时。最终银丝表面会镀上一层致密的灰白色的膜，即为ag/agcl电极，最后用去离子水冲洗并在烤箱中干燥，即得。

单细胞记录与标记装置制备及其应用

将制备好的玻璃微管内灌注含有2％示踪剂neurobiotintm的0.5m的氯化钾溶液，玻璃微管尖端向下固定于脑立体定位仪的三维微操作仪1上。将制备好的ag/agcl电极2一端放入玻璃微管4内，与氯化钾溶液接触，另一端与信号采集电极3相接后连接信号采集系统。

动物麻醉后，将其头部固定在脑立体定位仪上，剪开头皮暴露颅骨，按照脑图谱确定所需脑区的定位点打孔，通过三维微操作仪1带动玻璃微管4缓慢向下移动，玻璃微管4的尖端8进入到大脑表面以下后开始寻找单个细胞，当分辨出信噪比较高的单细胞采集并记录(采样率20khz；频率：300-1000hz)。

记录完成后，开始用微电泳的方法标记细胞，在记录细胞动作电位的同时，打开电源，通过示踪电极6给出一个持续时间为0.2s，周期2.5hz的正电流，电流大小从0.5na开始逐步增加，直到调制到约10na为止，并维持调制状态10-15分钟。这种方法的原理是在电场的作用下将示踪分子透入被记录神经元膜内，即能够经电极尖端将神经生物素电泳到记录的细胞内，后面通过免疫组化的进一步处理，可以实现单细胞的特异性标记和识别。由于这种方法可以长期记录单个神经元，因此可以收集到许多电生理特征，并且可以标记出最细微和最遥远的轴突分支。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。