用于治愈肌腱或韧带损伤的自体及同种的脂肪来源间充质干细胞组合物及其的制备方法与流程

本发明涉及包含自体或同种的脂肪来源间充质干细胞的组合物及其的制备方法及利用其的治疗方法，具体地涉及通过脂肪来源间充质干细胞单独给药或与水凝胶组合给药，来用于改善或治疗如跟腱疾病、髌腱疾病、外上髁炎、内上髁炎、足底筋膜炎、旋转肌群疾病、腱鞘滑膜炎、肌腱变性、肌腱炎、腱鞘炎、腱损伤、腱松解等的肌腱疾病或如十字韧带损伤、踝关节韧带损伤、副韧带损伤等的韧带疾病的组合物、改善或治疗的方法及其的制备方法。

背景技术：

作为具有自我更新能力、高生存能力、对各种细胞的分化潜能的细胞系，间充质干细胞(mesenchymalstemcells，mscs)在再生医学中具有作为细胞治疗产品的潜力。据悉，与对于间充质干细胞的组织细胞的直接分化能力的影响相比，这种再生能力受由间充质干细胞分泌的细胞因子、生长因子等的间接因素的影响的影响更大(fox，j.m.etal.(2007)recentadvancesintotheunderstandingofmesenchymalstemcelltrafficking.br.j.haematol.137：491-502)。

另一方面，据证实，间充质干细胞通过侵入性方法主要从骨髓获取，但存在于脂肪组织中的间充质干细胞比骨髓多1000倍，不仅如此，脂肪来源间充质干细胞的簇形成能力明显比骨髓干细胞更高，在转化生长因子β(transforminggrowthfactorbeta，tgfβ)、血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，vegf)等的生长因子分泌的方面也具有差异(dmitrievarietal.(2012)bonemarrow-andsubcutaneousadiposetissue-derivedmesenchymalstemcells：differencesandsimilarities.cellcycle.15；11(2)：377-83)。

并且，脂肪具有如下优点：富含组织，与个体分离的风险非常低，可直接使用所分离的细胞或低温保存来用于未来自体或同种的应用。

因此，为了获得用于治疗目的的药学有效量的如间充质干细胞的生长因子等的分泌物质，需要利用脂肪组织来源间充质干细胞来大量培养其的方法。

另一方面，肌腱(tendon)和韧带(ligament)为纤维性软组织，以胶原蛋白作为主要构成成分，其机械性质及结构方面相似，仅在各个骨骼与骨骼、骨骼与肌肉的附着点不同而已。

据悉，人体组织中的肌腱(腱子)或韧带供血比人体的其他组织相对不足，一旦受到损伤，需要相当长的时间再生，即使再生并治疗，也无法完全恢复成如原先正常的肌腱或韧带。据报道，这些肌腱或韧带再生之后，生物力学强度低于正常的肌腱或韧带，这种生物力学强度受到构成这些组织的胶原蛋白的影响。另一方面，还报道有涉及肌腱和韧带的治疗的多种生长因子的研究(mollyt.etal.(2003)therolesofgrowthfactorsintendonandligamenthealing.sportsmedicine33，5：381-394)。

因肌腱或韧带的外伤引起的损伤在运动或工作、日常生活中也常有发生，因衰老的退行性变化引起的肌腱的炎症或部分破裂等也可因轻微外伤而引起。

然而，至今为止，就这种衰老(退行性变化)及外伤引起的肌腱的炎症、部分破裂(扭伤)或完全破裂而受到损伤的肌腱或韧带而言，除了缝合断裂的肌腱或韧带的手术治疗及仅仅止于症状缓解的类固醇注射、物理适用法之外还未开发出特别的治疗方法。

因此，需要可通过再生并修复受到损伤的肌腱来实质性地改善或治疗肌腱或韧带疾病的肌腱或韧带疾病治疗。

韩国授权专利第1219624号公开了以血管紧张素ⅱ1型受体阻滞剂(angiotensinⅱtype1receptorblocker)及脂肪组织来源干细胞作为有效成分，并且在损伤肌肉的再生时形成调节过度纤维化的抑制或损伤肌纤维的融合或分化成新生肌纤维的干细胞的微环境(niche)，从而可促进损伤肌肉的治疗或损伤肌肉的再生，但是干细胞的分化不仅仅包含血管紧张素受体阻滞剂来确定，难以断定适用于临床时的效果是明确的，而且仅止于作为依据的实验例或动物实验上，因此其效果更加难以保证。

另一方面，韩国公开专利第2013-0000397号中公开了可通过给药包含血小板衍生生长因子(pdgf)的组合物来治疗肌腱疾病，但上述血小板衍生生长因子通过包含血液在内的生物流体来进行分离的过程复杂，并且利用重组脱氧核糖核酸(dna)技术来获得的情况下仍然需要各种过程，因此经济性较低。并且，在将人工物质及非同种来源物质适用于临床的情况下，无法保证完全着生于个体内并无副作用地执行预期功能。

多个上述现有技术提出通过调节干细胞的分化或将生长因子给药于肌腱疾病部位来治疗肌腱疾病的方法。然而，只要不是自体及同种来源的细胞或物质，就难以证实明确的效果且无副作用，当需要复杂的步骤时经济性降低。

另一方面，国际专利wo2007/127698号中记载有用于制备源自肝以外的组织来源的干细胞的肝干细胞的方法，肝干细胞源自脂肪干细胞，当在脂肪干细胞(asc)中生产如肝细胞生长因子(hgf)等的肝细胞因子并进行体内移植时，对肝组织的再生是有用的，在韩国授权专利第995133号中公开有由脂肪组织来源干细胞及单核细胞生产细胞生长因子的方法及由上述生产方法获取的培养产物的组织再生用途，韩国授权专利第955212号中公开有利用人的脂肪来源干细胞来大量生产人的生长因子的方法。然而，在上述文献中未提及利用脂肪来源间充质干细胞来有效地治疗肌腱相关疾病的方法及最佳培养条件。

因此，需要如下的肌腱或韧带疾病的改善及治疗方法：可弥补上述缺点且无副作用，并且能够以简单的方法制备药学有效量，适用于临床且其效果得以证实。

技术实现要素：

技术问题

本发明的目的在于，提供可改善或治疗如跟腱疾病、髌腱疾病、外上髁炎、内上髁炎、足底筋膜炎、旋转肌群疾病、腱鞘滑膜炎、肌腱变性、肌腱炎、腱鞘炎、腱损伤、腱松解等各种肌腱疾病或如十字韧带损伤、踝关节韧带损伤、副韧带损伤等的韧带疾病的组合物、治疗方法及其的制备方法。

解决问题的手段

为了实现上述目的，本发明提供包含来源于自体或同种的脂肪组织的间充质干细胞的用于改善或治疗肌腱或韧带疾病的组合物及其的培养方法，以及利用来源于自体或同种的脂肪组织的间充质干细胞来改善或治疗肌腱或韧带疾病的方法。

发明的效果

以药学有效量培养作为本发明的组合物的自体或同种的脂肪组织来源间充质干细胞，并单独或与水凝胶组合来适用于肌腱或韧带疾病中，从而无副作用地再生及重建损伤部位的组织，因而可治疗或改善肌腱或韧带疾病。

附图说明

图1a为示出脂肪干细胞的表面表型分析结果。

图1b为示出通过激发荧光细胞分离器(fluorescenceactivatedcellsorter，facs)来确认由人脂肪来源间充质干细胞所表达的cd29及cd44之后与基础培养基中培养的细胞进行比较的图形。

图2为示出通过酶联免疫测定法(enzymelinkedimmunoassay，elisa)来对由人脂肪来源间充质干细胞所分泌的肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor，hgf)、转化生长因子β(transforminggrowthfactorbeta，tgfb)及胰岛素样生长因子(insulin-likegrowthfactor-1，igf-1)的量进行定量并与基础培养基中培养的细胞进行比较的图形。

图3为表示当将脂肪干细胞与腱细胞共同培养时，相对于基质培养基，在增殖培养基中共同培养时的肌腱细胞的增殖的图。

图4为表示当处理在增殖培养基中培养的人脂肪来源间充质干细胞培养液时，相对于处理基质培养基中培养的培养液的细胞的腱细胞的增殖的图形。

图5为示出在增殖培养基中培养4天的5个互不相同的批次(lot)的多个脂肪干细胞的细胞增殖率的图形。

图6为示出通过酶联免疫测定法(enzymelinkedimmunoassay，elisa)来对由人脂肪来源间充质干细胞所分泌的血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，vegf)和胰岛素样生长因子(insulin-likegrowthfactor，igf)的量进行定量的图形。

图7a为测定在增殖培养基中培养4天的多个细胞中所分泌的胶原蛋白的图形。

图7b为表示在增殖培养基中培养的脂肪干细胞的胶原蛋白i型基因的表达的图形。

图7c为表示胶原蛋白i型蛋白质的表达的图形。

图7d为用胶原蛋白i型染色脂肪来源间充质干细胞并进行观察的荧光显微镜照片(x40)。

图8为示出当将在增殖培养基中培养4天的5个互不相同的批次(lot)的多个脂肪干细胞与腱细胞共同培养时的腱细胞的增殖率的图形。

图9为表示将脂肪干细胞与生物可降解支撑体一同移植之后的腱损伤治愈的有效性的图形。

具体实施方式

本发明涉及包含脂肪来源间充质干细胞的用于改善或治疗肌腱或韧带疾病的组合物。

在本发明的一方案中，上述间充质干细胞为自体或同种来源。

在本发明的一方案中，上述间充质干细胞可以为传代培养1代以上的。

在本发明的一方案中，上述间充质干细胞具有以下特征中的一种以上的特征：

(a)：对cd29及cd44呈现出阳性免疫学特性；

(b)：分泌由肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor，hgf)、胰岛素样生长因子(insulin-likegrowthfactor，igf)、转化生长因子β(transforminggrowthfactorbeta，tgfb)及血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，vegf)组成的组中的一种以上的生长因子。

在本发明的一方案中，上述间充质干细胞可分泌1000pg/ml以上的肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor，hgf)，更具体地，将培养2代以上所收集的脂肪来源间充质干细胞以1.0×10⁵的量接种于24孔板中之后，添加增殖培养基1ml，并在37℃温度、5％co2培养箱中培养72小时的间充质干细胞中测量时，可分泌肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor，hgf)1000pg/ml以上。

在本发明的一方案中，上述间充质干细胞可分泌200pg/ml以上的胰岛素样生长因子(insulin-likegrowthfactor，igf)，更具体地，将培养2代以上所收集的脂肪来源间充质干细胞以1.0×10⁵接种于24孔板中之后，添加增殖培养基1ml，并在37℃温度、5％co2培养箱中培养72小时的间充质干细胞中测量时，可分泌胰岛素样生长因子(insulin-likegrowthfactor，igf)200pg/ml以上。

在本发明的一方案中，上述间充质干细胞可分泌150pg/ml以上的转化生长因子β(transforminggrowthfactorbeta，tgfb)，更具体地，将培养2代以上所收集的脂肪来源间充质干细胞以1.0×10⁵的量接种于24孔板中之后，添加增殖培养基1ml，并在37℃温度、5％co2培养箱中培养72小时的间充质干细胞中测量时，可分泌转化生长因子β(transforminggrowthfactorbeta，tgfb)150pg/ml以上。

在本发明的一方案中，上述间充质干细胞可分泌500pg/ml以上的血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，vegf)，更具体地，将培养2代以上的脂肪来源间充质干细胞以1.0×10⁵的量接种于24孔板中之后，添加包含有10％血清溶液(胎牛血清(fetalbovineserum，fbs))、1ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor，bfgf)的培养培养基，并在37℃温度、5％co2培养箱中培养72小时的间充质干细胞中测量时，可分泌血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，vegf)500pg/ml以上。

根据实验条件及实验器具，结果有可能有所不同，然而当使用本发明的增殖培养基时呈现出如下情况：生长因子与基质培养基中培养的细胞相比，在胰岛素样生长因子(igf)的情况下增加3倍以上，更具体地，增加3.5倍以上，在肝细胞生长因子(hgf)的情况下增加3倍以上，更具体地，增加5倍以上，在转化生长因子β(tgfβ)的情况下增加1.2倍以上，更具体地，增加1.3倍以上。

在本发明的一方案中，上述间充质干细胞可促进细胞增殖及血管形成。

在本发明的一方案中，上述间充质干细胞可分泌细胞外基质蛋白。

在本发明的一方案中，上述间充质干细胞可分泌胶原蛋白。

在本发明的一方案中，在包含选自由成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor，fgf)、表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，egf)、转化生长因子β-1((transforminggrowthfactorbeta-1，tgf-β1)、血小板源性生长因子(platelet-derivedgrowthfactor，pdgf)、血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，vegf)、肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor，hgf)及胰岛素样生长因子(insulin-likegrowthfactor，igf-1)组成的组中的一种以上的生长因子的培养基中培养上述脂肪来源间充质干细胞。

在本发明的一方案中，可将组合物注射到患处。

在本发明的一方案中，上述患处可以为骨骼-肌腱或骨骼-韧带结合部。

在本发明的一方案中，上述患处可以为肌腱或韧带。

在本发明的一方案中，上述肌腱疾病可以为选自由跟腱疾病、髌腱疾病、外上髁炎、内上髁炎、足底筋膜炎、旋转肌群疾病、腱鞘滑膜炎、肌腱变性、肌腱炎、腱鞘炎、腱损伤及腱松解组成的组中，但不限定于此，在此，外上髁炎可表示网球肘，内上髁炎可表示高尔夫球肘。

在本发明的一方案中，上述韧带疾病可以为选自由十字韧带损伤、踝关节韧带损伤、副韧带损伤、韧带破裂及韧带扭伤组成的组中，但不限定于此。

在本发明的一方案中，组合物能够以单剂量或单剂量过量来给药。

在本发明的一方案中，组合物可通过单次注射来给药。

在本发明的一方案中，组合物的给药剂量可通过考虑给药途径、治疗次数、需要治疗的个体的年龄、体重、健康状态、性别、疾病的严重程度、饮食及排泄率等多种因素来确定适当的有效量。

在本发明的一方案中，组合物可在给药约6周以内与基线相比肌腱或韧带疾病病变的尺寸减少10％以上。

在本发明的一方案中，组合物可额外地还包含生物可降解支撑体。

在本发明的一方案中，作为水凝胶，生物可降解支撑体可以为选自由纤维蛋白胶、透明质酸、明胶、胶原蛋白、褐藻酸、纤维素、果胶、几丁质、聚乙醇酸及聚乳酸组成的组中的一种以上，但不限定于此。

在本发明的一方案中，组合物还可包含药学上可接受的载体及稀释剂。

在本发明的一方案中，上述药学上可接受的载体及稀释剂可在生物学上及生理学上对干细胞及接受其的移植的接受者为相容性的。

在本发明的一方案中，上述药学上可接受的载体可混合使用盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇及它们的成分中的一种以上，并且可根据需要添加其他常规添加剂，如抗氧化剂、缓冲液及抑菌剂等。并且，还可额外地添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂及润滑剂，来制剂化为注射用剂型，如水溶液、悬浮液、乳浊液等，但不限定于此。

本发明涉及用于改善或治疗肌腱或韧带疾病的包含脂肪组织来源间充质干细胞的组合物的制备方法，其中，包括：步骤(a)，从脂肪组织分离间充质干细胞-血管部分并在基质培养基中培养；步骤(b)，在包含选自由成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor，fgf)、表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，egf)、转化生长因子β-1((transforminggrowthfactorbeta-1，tgfβ-1)、血小板源性生长因子(platelet-derivedgrowthfactor，pdgf)、血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，vegf)、肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor，hgf)及胰岛素样生长因子(insulin-likegrowthfactor，igf-1)组成的组中的一种以上的生长因子的培养基中培养基质-血管部分；以及步骤(c)，将所培养的间充质干细胞传代培养1代以上。

在本发明的一方案中，本发明的特征在于，可将由上述步骤(c)获得的脂肪组织来源间充质干细胞与生物可降解支撑体一同通过单次注射来给药。

在本发明的一方案中，上述生物可降解支撑体可以为选自由纤维蛋白胶、透明质酸、明胶、胶原蛋白、褐藻酸、纤维素、果胶、几丁质、聚乙醇酸及聚乳酸组成的组中的一种以上。

在根据本发明的方法来利用增殖培养基制备的情况下，与现有基质培养基中培养的情况相比，cd29的表达增加5％以上，在cd44的情况下表达增加30％以上，在生长因子的情况下也比基质培养基中培养的细胞呈现出胰岛素样生长因子(igf)的情况下增加3.5倍，肝细胞生长因子(hgf)的情况下增加5倍，转化生长因子β(tgfβ)的情况下增加1.3倍左右。

更具体地，对根据本发明的间充质干细胞的培养方法进行说明如下：

(1)间充质干细胞的培养

将从相应组织获得的间充质干细胞悬浮于基质培养基中，并以10000-40000cells/cm²的浓度接种于培养器皿中之后进行培养。基质培养基为包含有10％牛血清的杜尔贝科改良伊格尔培养基(dmem)或杜尔贝科改良伊格尔培养基/ham'sf-12营养培养基(dulbecco'smodifiedeaglemedium/ham'sf-12nutrientbroth，dmem/f12)，约培养24小时。

(2)在增殖培养基(expansionmedia)中培养

去除基质培养基之后，通过在增殖培养基培养来使贴壁细胞增殖。增殖培养基为包含10％牛血清、0.1～100ng/ml浓度的成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor，bfgf)的杜尔贝科改良伊格尔培养基(dmem)或杜尔贝科改良伊格尔培养基/ham'sf-12营养培养基(dmem/f12)，并且具有可使贴壁性的脂肪来源间充质干细胞快速增殖且可在短时间内增加细胞数量的作用。

(3)传代培养

当细胞填满培养器皿底部的80～90％时，去除增殖培养基并通过胰蛋白酶处理来将细胞从培养器皿取出。为了传代培养，将细胞以1：3～1：4稀释，并在新培养器皿中与增殖培养基一同培养。能够以这种方法进行额外的传代培养。

(4)胶原蛋白及生长因子分泌的确认

同种的脂肪来源间充质干细胞还根据其种类(个体)而生物学特性表现不一，因此确认至少传代培养1代以上的脂肪来源间充质干细胞中的胶原蛋白及生长因子的分泌，并且当选择有效治愈腱损伤的同种的脂肪来源间充质干细胞来使用时，与自体细胞相比，在临床方面更为有效。

在本发明的一方案中，上述细胞培养用培养基可以为杜尔贝科改良伊格尔培养基(dmem)或杜尔贝科改良伊格尔培养基/ham'sf-12营养培养基(dulbecco'smodifiedeaglemedium/ham'sf-12nutrientbroth，dmem/f12)，但不限定于此。

在本发明的一方案中，上述细胞培养用培养基可根据需要来添加一种以上的辅助成分，可使用包括胎牛血清、马或人等的血清在内的用于防止微生物污染的抗生素及抗真菌剂等。

在本发明的一方案中，提供通过将自体或同种的脂肪来源间充质干细胞向个体进行单独给药或与水凝胶组合给药，来改善或治疗如跟腱疾病、髌腱疾病、外上髁炎、内上髁炎、足底筋膜炎、旋转肌群疾病、腱鞘滑膜炎、肌腱变性、肌腱炎、腱鞘炎、腱损伤、腱松解等的肌腱疾病或如十字韧带损伤、踝关节韧带损伤、副韧带损伤等的韧带疾病的方法。

在本发明的一方案中，提供利用自体或同种的脂肪来源间充质干细胞的如跟腱疾病、髌腱疾病、外上髁炎、内上髁炎、足底筋膜炎、旋转肌群疾病、腱鞘滑膜炎、肌腱变性、肌腱炎、腱鞘炎、腱损伤、腱松解等的肌腱疾病或如十字韧带损伤、踝关节韧带损伤、副韧带损伤等的韧带疾病治疗用途。

定义

“肌腱(tendon)”为使肌肉付托在骨骼上的纤维性软组织，其作用为通过传递肌肉的收缩力来使关节发生运动，运动时调节力量来起到物理稳定化功能，储存能量并高效恢复。

“韧带(ligament)”为连接骨骼与骨骼之间的纤维性软组织，其主要作用为位于关节上使关节保持稳定。

“脂肪来源间充质干细胞(adipose-derivedstromalstemcells)”是指由间充质干细胞-血管部分获得的间充质干细胞。可同样用脂肪来源干细胞(adipose-derivedstemcells，asc)、脂肪来源成体干细胞(adipose-derivedadultstemcells，adas)以及脂肪干细胞来表示。

“同种移植”是指从他人或同一物种的其他个体接受特定组织或器官或细胞的移植，在无法使用自身组织或器官、细胞的情况下，从他人或其他动物接受组织或器官或细胞的移植。

“cd29及cd44”为间充质干细胞的标志物，可通过用免疫荧光法及免疫细胞化学法表现出的阳性反应结果来确认间充质干细胞。

“肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor，hgf)被认知为离散因子，并且为促进有丝分裂、促移动、促侵袭及促形态发生的多功能细胞因子。肝细胞生长因子(hgf)-依赖性信号传导通过促进聚集及细胞粘附来调节整联蛋白功能。肝细胞生长因子/离散因子(hgf/sf)诱导效果通过配体结合后的met受体酪氨酸激酶的信号传导而发生。

“胰岛素样生长因子(insulin-likegrowthfactor，igf)”的胰岛素样生长因子-i(igf-i)及胰岛素样生长因子-ii(igf-ii)与胰岛素共享50％的结构同源性。胰岛素样生长因子(igf)不仅起到细胞增殖的有丝分裂刺激物质的作用，还用作细胞凋亡途径的抑制物质。在生长激素(gh)的调节下，肝脏为产生胰岛素样生长因子(igf)的主要部位。胰岛素样生长因子-i(igf-i)水平受到影响以及受到产生阶段的影响。胰岛素样生长因子(igf)的自分泌及旁分泌的产生有助于可用于生长调节的胰岛素样生长因子(igf)的水平。

“转化生长因子β(transforminggrowthfactorbeta，tgfβ)”为由23个氨基酸(aa)的信号序列、256个氨基酸(aa)的前(pro)-区域及112个aa的成熟片段构成的55kda的391个氨基酸(aa)前蛋白质原(preproprotein)。在分泌之前，前-区域因嘌呤样蛋白酶而在-rxxr位点上被切割。这与预结合(previouslyattached)二硫键结合的前-区域非共价键以产生形成“潜在复合体”的非糖基化的25kda的二硫键结合的成熟二聚体。这种复合体分泌。几乎确实的是，激活在多种条件下通过跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶在细胞外部发生，从而启动由转录因子的果蝇抗生物皮肤生长因子蛋白(smad)家族介导的细胞内信号级联。

“血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，vegf)”作为内皮细胞的生长及存活因子来被最初鉴定。这诱导内皮细胞增殖，并调节血管形成及脉管形成。血管内皮生长因子(vegf)为分泌为45kda同种二聚体的肝素结合糖蛋白。通常，分泌非内皮细胞本身的多个细胞类型的血管内皮生长因子(vegf)。

“细胞外基质蛋白”为蛋白质，如胶原蛋白、透明质酸、弹性蛋白，弹性蛋白等，具有结合细胞与细胞之间及缓冲的作用。

“治疗”是指治疗学上的处置及预防或防止措施。因此，需要治疗的人不仅包括已经患有肌腱或韧带相关疾病的人，还包括想要预防肌腱或韧带相关疾病的人。本发明的方法不限定于此，可用于治疗需要治疗的任意的哺乳动物，如人类、灵长类动物、家畜型及饲养型、宠物型或体育型动物，例如狗，马，猫，羊，猪，牛等。

本发明的实施方式

在下文中，通过以下实施例更详细地说明本发明。然而，这仅为了助于理解本发明，而不是要限定本发明的发明要求保护范围。

实施例

实施例1：人脂肪来源间充质干细胞的培养方法

以如下的方式从由脂肪抽吸获得的脂肪组织分离了脂肪来源间充质干细胞(脂肪组织通常用脂肪抽吸术获得，但不限定于此)：为了去除血液，用相同体积的克-林二氏重碳酸盐(krebs-ringerbicarbonate，krb)溶液清洗了脂肪组织3～4次。加入与脂肪组织相同体积的胶原酶溶液在37℃温度的水浴中进行了反应。将其移至离心管中，在20℃温度下以1200rpm离心分离了10分钟。去除作为上清液的脂肪层，小心地分离出作为下层的胶原酶溶液以避免摇动。加入基质培养基使之悬浮之后，在20℃温度下以1200rpm离心分离了5分钟。此时，向下沉淀的为间充质干细胞-血管部分，并去除了上清液。

使间充质干细胞-血管部分悬浮于基质培养基中，并接种在培养器皿中，在37℃温度、5％co2培养箱中培养了24小时。去除培养液之后，利用磷酸盐缓冲溶液清洗，并且利用基质培养基或基质培养基中包含1ng/ml浓度的碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)的增殖培养基来进行增殖。当脂肪来源间充质干细胞生长至培养器皿的80-90％时，进行胰蛋白酶处理并分离成单细胞来获取。用增殖培养基将所获得的细胞稀释成1：3～1：4来进行了传代培养。

[实验例]

实验例1：人脂肪来源间充质干细胞的表面类型分析

在上述实施例1中，收集培养2代以上的脂肪来源间充质干细胞，并移入1.5ml离心管中，加入激发荧光细胞分离器(facs)染色溶液(包含有1％胎牛血清的磷酸盐缓冲溶液)1ml搅拌均匀之后，以10000rpm离心分离了5秒钟。去除上清液，重新悬浮于激发荧光细胞分离器(facs)染色溶液1ml中以10000rpm离心分离5秒钟，去除上清液，重新悬浮于激发荧光细胞分离器(facs)染色溶液300μl中。根据样品数量，将样品分注到新地试管，使得每个离心管包含约2×10⁵个细胞，并添加抗体之后，在冰上反应了30分钟。重新悬浮于激发荧光细胞分离器(facs)染色溶液1ml中，以10000rpm离心分离5秒钟之后，去除了上清液。添加激发荧光细胞分离器(facs)固定液400～500μl并重新悬浮之后，利用流式细胞仪来进行了分析。

其结果，如以下图1a及图1b所示，证实了本发明的脂肪干细胞于基质培养基中培养的细胞相比，呈现出cd29、cd44的表达增加的免疫学特性。

实验例2：人脂肪来源间充质干细胞的生长因子分泌

收集上述实施例1中的培养2代以上的脂肪来源间充质干细胞，并将1.0×10⁵细胞接种于24孔板之后，添加了基质培养基或增殖培养基1ml。在37℃温度、5％co2培养箱中培养72小时之后，收集上清液，然后利用酶联免疫测定法(enzymelinkedimmunoassay，elisa)来测量了作为与腱损伤治愈相关的具代表性的生长因子的肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor，hgf)、胰岛素样生长因子(insulin-likegrowthfactor-1，igf-1)、转化生长因子β(transforminggrowthfactorbeta，tgfb)的量。

其结果，如图2所示，在增殖培养基中培养的细胞分泌了3000～5000pg/ml(相对于基质培养基的10倍以上的高浓度)的肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor，hgf)及357～378pg/ml的胰岛素样生长因子(insulin-likegrowthfactor，igf)(相对于基质培养基的3.5倍以上的高浓度)。并且，根据本发明来培养的间充质干细胞分泌了转化生长因子β(transforminggrowthfactorbeta，tgfβ)200～214pg/ml，此为相对于基质培养基的1.3倍的生长因子。因此，证实了当将根据本发明来培养的间充质干细胞适用于腱损伤部位时，持续地分泌促进细胞增殖及治愈的多种生长因子，从而可使伤口治愈简单化。

实验例3：同种脂肪来源间充质干细胞的肌腱细胞增殖例1

收集上述实施例1中的培养2代以上的脂肪来源间充质干细胞，在穿透(transwell)板上将每平方厘米(cm²)5000个的细胞与肌腱细胞进行共同培养，并在37℃温度、5％co2培养箱中培养72小时之后，证实了肌腱细胞的增殖。

图3为示出当将肌腱细胞与在增殖培养基中培养的脂肪来源干细胞共同培养7天时，相对于与基质培养基中培养的脂肪来源干细胞共同培养的干细胞增加的肌腱细胞的增殖的图形。经证实，与基质培养基中培养的干细胞共同培养的肌腱细胞增加了1.53倍，反之，与在增殖培养基中培养的干细胞共同培养的肌腱细胞增加了2.35倍。

实验例4：同种脂肪来源间充质干细胞的肌腱细胞增殖例2

收集上述实施例1中的培养2代以上的脂肪来源间充质干细胞，将每平方厘米(cm²)5000个的细胞接种于96孔板中之后，在37℃温度、5％co2培养箱中培养72小时之后，收集培养液，利用基质培养基或增殖培养基稀释至25％、50％、75％，然后至肌腱细胞中处理并培养7天之后，证实了肌腱细胞的增殖。

图4为当将肌腱细胞与脂肪来源干细胞培养液培养了7天时，与处理了基质培养基中培养的培养液的情况相比，在25％、50％、75％的情况下分别增加了1.09倍、1.30倍、1.34倍浓度，当处理基质培养基中培养的培养液时，未证实到根据浓度的变化。

实验例5：人脂肪来源间充质干细胞的增殖能力

收集上述实施例1中的培养2代以上的5个批次(lot)的脂肪来源间充质干细胞，将每平方厘米(cm²)5000个的细胞接种于96孔板之后，加入包含有10％血清溶液(fetalbovineserumfbs)、1ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor，bfgf)的培养培养基，然后在37℃温度、5％co2培养箱中培养了4天。在培养到第4天时加入四唑盐(tetrazoliumsalts，wst-1)，并测量了5个批次(lot)之间的细胞增殖程度。

图5为示出利用四唑盐(tetrazoliumsalts，wst-1)来定量测量5个互不相同的批次(lot)中的干细胞的增殖能力的图形，可证实第5批的干细胞增殖最好。

实验例6：人脂肪来源间充质干细胞的生长因子的分泌

收集上述实施例1中的培养2代以上的5个批次(lot)的脂肪来源间充质干细胞，将1.0×10⁵细胞接种于24孔板中之后，加入包含有10％血清溶液(fetalbovineserumfbs)、1ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor，bfgf)的培养培养基。在37℃温度、5％co2培养箱中培养72小时之后收集上清液，然后利用酶联免疫测定法(enzymelinkedimmunoassay，elisa)来测量了作为从间充质干细胞分泌的具代表性的生长因子的血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，vegf)及胰岛素样生长因子(insulin-likegrowthfactor-1，igf-1)的量。

其结果，如图6所示，上述细胞分泌了619.9～1641.2pg/ml的血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，vegf)及37～402pg/ml的胰岛素样生长因子(insulin-likegrowthfactor，igf)。经证实，5个互不相同的批次(lot)的脂肪来源间充质干细胞中第5批次(lot)中分泌的血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，vegf)及胰岛素样生长因子(insulin-likegrowthfactor，igf)的分泌量多。

即，证实了当将根据本发明来培养的间充质干细胞适用于腱损伤部位时，持续地分泌促进细胞增殖及血管形成的多种生长因子，从而可使伤口治愈简单化。

实验例7：人脂肪来源间充质干细胞的胶原蛋白i型的表达

收集上述实施例1中的培养2代以上的5个批次(lot)的脂肪来源间充质干细胞，来证实了胶原蛋白的分泌程度及表达程度。

图7a为示出取培养到第4天时的脂肪来源间充质干细胞的培养液并通过sircolassay来测量胶原蛋白的分泌程度的，并证实了第5批次(lot)中分泌了5.7ug/ml的较多的胶原蛋白。

图7b为示出从培养到第4天时的脂肪来源间充质干细胞提取核糖核酸(rna)并利用聚合酶链反应(polymerasechainreaction，pcr)并证实了胶原蛋白信使核糖核酸(mrna)表达水平。收集培养了四天的细胞，利用人源基因特异性反应的引物(primer)(hcoli-f5'-cagccgcttcacctacagc，hcoli-r5'-ttttgtattcaatcactgtc)，通过逆转录聚合酶链反应(reversetranscription-polymerasechainreaction，rt-pcr)证实了从脂肪来源间充质干细胞分泌的基质中的胶原蛋白i型(collagentypei；coli)的表达。

图7c为示出收集培养了4天的细胞，利用人源蛋白质特异性反应的抗体来证实了从脂肪来源间充质干细胞分泌的基质中的胶原蛋白i型(collagentypei；coli)的表达，并证实了在第5批次(lot)的脂肪来源间充质干细胞中，第5批次(lot)的脂肪来源间充质干细胞中的胶原蛋白i型表达最多。

并且，通过荧光免疫染色方法观察了胶原蛋白i型的表达程度。如实施例1中所述，利用包含3.7％甲醛的磷酸盐缓冲盐水(phosphatebuffersaline，pbs)来将培养的5个批次(lot)的脂肪来源间充质干细胞固定了30分钟。用磷酸盐缓冲盐水(phosphatebuffersaline，pbs)清洗3次，并用包含5％正常山羊血清(normalgoatserum)及0.1％聚乙二醇辛基苯基醚(triton-x100)的磷酸盐缓冲盐水(phosphatebuffersaline，pbs)进行了透化(permeablization)及封闭(blocking)30分钟。添加包含一抗的磷酸盐缓冲盐水(phosphatebuffersaline，pbs)之后，在37℃温度下，反应1小时之后，用磷酸盐缓冲盐水(phosphatebuffersaline，pbs)清洗3次，添加二抗之后，在常温下反应了30分钟。用磷酸盐缓冲盐水(phosphatebuffersaline，pbs)清洗3次之后，固定并用荧光显微镜观察。

图7d为示出脂肪来源间充质干细胞的细胞外基质蛋白(extracellularmatrix；ecm)中作为构成95％的腱的蛋白质的胶原蛋白i型的分泌能力的照片(x40)，如此处所示，根据本发明来制备的脂肪来源间充质干细胞中，在整体上对胶原蛋白i型呈现了阳性反应。即，证实了根据本发明来制备的脂肪来源间充质干细胞不仅大量分泌腱损伤治愈中所需的细胞外基质蛋白，还当所分泌的胶原蛋白移植到体内时提供多种基质，从而可使腱损伤治愈简单化。

实验例8：同种脂肪来源间充质干细胞的肌腱细胞增殖例

收集上述实施例1中的培养2代以上的5个批次(lot)的脂肪来源间充质干细胞，在穿透(transwell)板上与肌腱细胞共同培养，添加包含有10％血清溶液(fetalbovineserumfbs)、1ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor，bfgf)的培养培养基之后，在37℃温度、5％co2培养箱中培养72小时，然后证实了肌腱细胞的增殖。

图8中示出当将肌腱细胞与脂肪来源干细胞共同培养7天时，与仅培养肌腱细胞的对照组相比，增加了1.67倍～2.2倍，据证实，在5个批次(lot)中，第5批次的脂肪来源间充质干细胞使肌腱细胞的增殖增加得最多。

实验例9：同种脂肪来源间充质干细胞的腱损伤治疗例

为了通过上述实施例1的方法培养的脂肪来源间充质干细胞的临床应用，以诊断为外上髁炎的患者作为对象来实施了研究人员临床试验。所制备的多个细胞传代培养了1代以上，将第一组(1×10⁶cells/ml)和第二组(10×10⁶cells/ml)的两种浓度的细胞与纤维蛋白胶一同以1ml的用量通过超声波观察的同时移植到腱损伤部位。

图9a为将移植6周后和12周后时腱损伤治愈及疼痛程度以疼痛视觉模拟评分(vasscore)及改良梅奥(mayo)活动指数表示的图形。据观察，休息时和活动时的疼痛评分(vas)(1组和2组均相对于注射前疼痛指标在第6周和第12周时明显减小，作为综合评估疼痛和功能性状态的尺度的改良梅奥(mayo)活动指数也从第6周开始统计上显著好转情况。

图9b为为了调查临床试验对像的腱缺陷部位的解剖学结构而用超声成像观察的所测量的病变尺寸的照片，与注射前相比，1组和2组均在注射后第6周在病变部位的尺寸减小，在第12周时其尺寸明显减小。尤其，注射后第12周超声成像的病变部位中观察到了紧密的组织，从而证实了解剖学上损伤部位再生及重建且功能得以改善。

产业上的可利用性

将本发明的自体或同种的脂肪组织来源间充质干细胞以药学有效量进行培养，单独或与水凝胶组合适用于肌腱或韧带疾病中，从而无副作用地再生及重建损伤部位的组织，可改善或治疗肌腱或韧带疾病，因此在工业上非常有用。