发明领域
本发明主要涉及联合应用1)免疫调节剂、2)检查点抑制剂和3)释放癌症抗原的疗法(如放疗)治疗癌症患者的方法。具体的，所述免疫调节剂可以是抗-cd3免疫毒素，所述检查点抑制剂抑制pd-1和pd-l1的相互作用。
发明背景
细胞表面的pd-l1蛋白和t细胞上的pd-1蛋白之间的相互作用降低了t细胞的功能并阻止免疫系统攻击细胞。虽然这种相互作用对保护正常细胞很有用，但是一些癌细胞也可以在其表面表达pd-l1并伪装成正常细胞不被免疫系统攻击。这种载有pd-l1的癌细胞能够借此逃避免疫清除。为解决这一问题，已开发的“检查点抑制剂”(多数为免疫抗体)可以阻止pd-l1和pd-1的相互作用，最典型的是通过绑定pd-l1或pd-1蛋白中的一个进而在空间上抑制二者的相互作用。因此，所述抑制剂的使用阻止了载有pd-l1的癌细胞逃避免疫系统，并最终被免疫系统识别和清除。
检查点抑制剂pembrolizumab
对于不能切除的黑色素瘤，在使用
发明概要
本发明提供一种联合使用免疫调节剂(如杀灭t细胞的抗-cd3免疫毒素)和检查点抑制剂，并同时在现有t细胞被耗尽后新的t细胞稳态增殖过程中释放癌症抗原，杀灭癌细胞的方法。
本发明的一个目的是对有需要的受试者提供一种治疗癌症的方法，包括给予受试者足够量的抗-cd3特异性免疫毒素以耗尽受试者现存的t细胞；向受试者提供一种释放由癌症细胞表达的癌症抗原的疗法；以及，
给予受试者一种检查点抑制剂，
其中，在癌症抗原的存在下，患者现存t细胞的耗尽导致新的t细胞的再生和成熟。在一些方面，抗-cd3特异性免疫毒素是a-dmdt390-bisfv(ucht1)。在一些方面，检查点抑制剂为单克隆抗体，抑制pd-1和pd-l1的相互作用。可以是抗pd-l1的单克隆抗体，进一步，检查点抑制剂也可以为抗pd-1的单克隆抗体，例如pembrolizumab。在其他方面，所述释放癌症抗原的疗法是指放射疗法。更进一步，给予检查点抑制剂的步骤在提供释放癌症抗原的步骤之后。在其他方面，提供释放癌症抗原的步骤在给予抗-cd3特异性免疫毒素的步骤之后；给予检查点抑制剂的步骤在提供释放癌症抗原的步骤之后。
在其他方面，所述给予抗-cd3特异性免疫毒素的步骤是在治疗的第1、2、3、4天给予多剂量的抗-cd3特异性免疫毒素；所述提供释放癌症抗原的步骤是在治疗的第5天进行；所述给予检查点抑制剂的步骤是在治疗的第16天进行，之后每三周进行一次。进一步，该方法包括在一段时间后重复提供释放癌症抗原的步骤(如在1天、1周、1个月或1年)。在一些方面，所述癌症选自不可切除的非小细胞肺癌、不可切除的肝细胞癌、不可切除的头颈鳞状细胞癌、不可切除的结肠直肠癌、不可切除的胃癌和不可切除的黑色素瘤。
本发明还提供一种延长癌症患者生存时间的方法，包括给予患者足够量的抗-cd3特异性免疫毒素以耗尽患者现存的t细胞，向患者提供一种释放由癌细胞表达的癌症抗原的疗法，以及，给予患者一种检查点抑制剂；其中，在癌症抗原的存在下，患者现存t细胞的耗尽导致新的t细胞的再生和成熟，由此延长患者的生存时间。
本发明还提供一种准备患者的免疫系统来识别并杀灭转移性和/或复发性癌细胞的方法，包括：给予患者足够量的抗-cd3特异性免疫毒素以耗尽患者现存的t细胞，向患者提供一种释放由癌细胞表达的癌症抗原的疗法，和给予患者一种检查点抑制剂；其中，在癌症抗原的存在下，患者现存t细胞的耗尽导致新的t细胞的再生和成熟，由此准备免疫系统来识别并杀灭转移性和/或复发性癌细胞。
本发明的其他特点和优势将在随后的说明书部分详述，部分内容说明书直接记载的，部分内容是通过本发明的实施可以获得的。本发明将通过说明书和权利要求书中所特别指出的组合物和方法来实现和得到。
附图说明
图1：
图2：应用
图3：a-dmdt390-bisfv(ucht1)的氨基酸序列(seqidno：1)；
图4：抗小鼠cd3的免疫毒素，resimmune的小鼠类似物，杀灭小鼠cd3阳性el4t细胞；
图5：抗小鼠cd3免疫毒素抑制了由g1261megfrviii细胞移植诱发的神经胶质瘤的生长。
发明详述
本发明提供一种联合使用免疫调节剂(如杀灭t细胞和载有cd3抗原的癌细胞的抗-cd3免疫毒素)和检查点抑制剂，并进一步联合释放癌症抗原疗法(如放疗)杀死癌细胞的方法。例如，美国专利7,696,338和8,217,158(neville等)记载了典型的抗-cd3免疫毒素。采用该方法延长了癌症患者的生存时间，并阻止和/或有助于杀灭转移性或复发性肿瘤和癌性病变。比如，患者保持无癌状态和/或生存期延长至少6个月、12个月、24个月或更长。在一些情况中，患者保持无限期无癌。
不考虑理论约束，我们认为当给予癌症患者能够消灭t细胞的抗-cd3免疫毒素时，无论癌症是否带有cd3，免疫毒素都消灭现存正常、健康的表达cd3抗原的t细胞。这导致患者体内新的初始中央记忆型t细胞反应性稳态增殖。中央记忆型cd8t细胞通常不能维持增殖状态和稳态增殖信号。但是，在癌症抗原存在的情况下，中央记忆型cd8t细胞可转化成中央记忆效应形式，使这种维持成为可能。因此，很有可能新的中央记忆型cd8t细胞在分化过程中，被释放的癌症抗原致敏，进而分化成为能够识别并杀灭其敏感的癌症细胞的效应型cd8t细胞。
根据本发明的一些方面，新的记忆型cd8t细胞向cd8效应型细胞的分化发生在癌症抗原存在的情况下，所述癌症抗原i)通过例如放疗法从受试者的肿瘤细胞中释放出来，和/或ii)来源于例如以前保留的肿瘤样本；和/或iii)来源于合成抗原。无论哪种来源，癌症抗原存在下的中央记忆型cd8t细胞分化成效应记忆型cd8t细胞很可能导致效应记忆型cd8t细胞能够特异性识别并杀灭所有载有这些抗原的细胞，如受试者体内存在的癌细胞，癌症复发产生的癌细胞等等。
在分化前，中央记忆型cd8t细胞高水平表达pd-1并因此成为检查点抑制剂的很好的靶点。联合检查点抑制剂很可能提高中央记忆型cd8t细胞向效应记忆型cd8t细胞的转化。此外，pd1/pd-l1的相互作用可以将癌细胞伪装成正常细胞，检查点抑制剂通过阻断例如pd1/pd-l1的相互作用来直接帮助cd8效应t细胞识别癌细胞。
在一些方面，通过向受试者提供放射疗法将初始中心记忆型cd8t细胞暴露给癌症抗原。在治疗方案中放射疗法使被照射的肿瘤细胞随着其死亡和分解释放出癌症抗原，帮助中央记忆型t细胞转化成效应型t细胞，识别并杀灭载有辐照释放的抗原的肿瘤细胞。当稳态增殖与癌细胞溶解和抗原释放相结合，抗癌免疫应答可以无限期的存在。因此，新转化的效应型t细胞能够立即(现存的肿瘤细胞存在于无法辐照的位置)或在将来(比如肿瘤发生转移或复发)攻击肿瘤细胞。因此，抗-cd3免疫毒素联合检查点抑制剂，并可选择的/通常的联合肿瘤溶解疗法(例如放射疗法)，对于杀灭癌细胞并获得防止癌症复发的长期免疫很可能产生了协同增效的效果。
所述“协同”或“协同的”是指，三种疗法的相互作用产生了优于单独使用三种疗法其效果之和的联合效果。
药物类型和治疗方法
本发明提供一种通过如下组合疗法治疗癌症和/或阻止癌症转移和/或复发的方法，所述方法包括1)至少一种免疫调节剂，2)至少一种检查点抑制剂，和3)可选择的，一种癌症溶解、抗原释放疗法，如放射疗法。
本发明所述“免疫调节剂”指的是能提高、增加或支持、促进免疫系统活性的化合物。尤其是，所述免疫调节剂提高对抗一种或多种癌症的免疫系统的活性。已公开的美国专利20150166660(该专利的全部内容引用到本专利中作为参考)记载了免疫毒素分子，其被用于对抗癌细胞的cd3抗原。专利20150166660公开了这些免疫毒素作为免疫调节剂具有惊人的效果。免疫毒素最早在已授权的第7,696,338号和第8,217,158号(neville)美国专利中记载，这两项专利的全部内容引用到本专利中作为参考。最初用于直接杀灭载有cd3抗原的癌细胞的免疫毒素分子是嵌合体或融合蛋白，包含连接抗体部分的重组毒素部分，所述抗体部分能够特异性结合cd3表位。抗体部分负责将免疫毒素结合到t细胞受体复合物的cd3εγ亚基上，使免疫毒素分子能够特异性的靶向和结合到载有cd3受体的t细胞上。一旦结合，分子的毒素部分将进入并杀灭细胞。在一些实施方式中，所述毒素部分为，例如截短的白喉毒素(dt)部分或假单胞菌外毒素a(eta)毒素部分，并且所述抗体部分包含抗cd3抗体的两个单链fvs。抗cd3免疫毒素a-dmdt390-bisfv(ucht1)的氨基酸序列如图3和seqidno：1所示。该序列的变体也可以使用，例如氨基酸序列发生保守替换的变体、蛋白水解的片段、包含和不包含甲硫氨酸残基的变体、优化的密码子和/或人源化变体等。此外，丝氨酸蛋白酶在例如弗林蛋白酶裂解位点rvrr：svgs(seqidno：2，参见seqidno：1的191-198残基)或其他可能位点的裂解，而没有破坏半胱氨酸188-202之间的二硫键。任意变体均可能被用来治疗或防止此处所述的癌症，只要变体保留免疫毒素活性。
给予患者治疗有效量的本发明所述免疫毒素制剂，例如可以导致将患者体内t细胞群体耗尽到足以引发免疫系统稳态增殖的量。耗尽t细胞群体涉及破坏或杀灭受试者体内至少90-99％或以上(例如100％)的t细胞，但是在一些情况中可能杀死50％或以上(例如55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％)就足够了。
本发明方法中适合的检查点抑制剂包括但不限于靶向于pd-1的制剂和靶向于pd-l1的制剂。典型的pd-1制剂包括但不限于：pembrolizumab
在一些方面，在所述组合治疗方案提供抗原释放疗法，例如，给予受试者一种溶解癌细胞并将癌症抗原释放到循环系统的药剂或疗法。在一些方面，抗原通过放射疗法被释放。“放射疗法”(xrt)是指使用高能射线来缩小并杀死癌细胞。放射疗法包括使用x射线、伽马射线，和/或带电粒子。放射(例如局部放射)可通过仪器在体外进行(体外照射疗法)，也可将放射性物质放置在体内癌细胞附近达到放射治疗的效果(体内放射疗法，也叫短距离放射治疗)。或者，还可以使用放射性物质例如放射性碘的全身放射疗法。放射疗法的类型包括但不限于：立体定向放疗(sbrt)、立体定向质子疗法(rsbpt)等。
在其他方面，抗原也可被或者是再加上如免疫毒素这样的能溶解癌细胞的药剂来释放。这类溶解癌细胞的药剂可以是免疫毒素，例如，靶向于特定类型的癌细胞的免疫毒素(例如靶向于乳腺癌细胞的her-2的免疫毒素)或是靶向于供给人类肿瘤的新血管系统的抗体(例如抗前列腺特异性膜抗原的抗体，anti-pmsa)等。
方法
本发明提供一种治疗癌症和/或阻止癌症转移和/或复发的方法，进而延长生存时间、无病生存时间和癌症复发时间。所述方法涉及给予一种组合疗法，包括：i)至少一种免疫调节剂；ii)至少一种检查点抑制剂；和iii)可选择的，一种肿瘤溶解/抗原释放疗法，例如放射疗法。通常该方法包括使用本领域已知方法诊断受试者患有癌症、转移性癌症和/或复发性癌症的步骤。
i.给予抗-cd3免疫毒素：诊断后，受试者首先给予免疫调节剂如抗-cd3免疫毒素诱发反应性稳态增殖并提高(扩大)cd8中央记忆型t细胞的频率(数量、等级等)。由于治疗的效果在治疗后的几周、几个月甚至几年内都不会明显的表现出来，因此诊断后立即开始免疫调节是很有利的，使免疫调节尽快开始是可取的。
免疫毒素的剂量可能根据本领域技术人员如熟练的执业医师对参数的理解不同而改变。推荐的剂量和给药方法可在临床试验中确定。给药量可能基于以下因素而改变：例如病人的体重、性别、年龄、整体状况等、和/或疾病的类型和阶段，以及是否在给药期间给予其他药物等。一般而言，在一轮化疗期间(计划进行一段时间，比如4天)的总体给药量大约在5-60μg/kg体重范围内变化，例如，给药量大约为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60μg/kg体重。具体的，例如4天内给予20μg/kg体重的剂量。一天内给予0.5-5μg/kg体重的剂量(约0.5、1、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5μg/kg体重)，分为1-6(如1、2、3、4、5或6)次给药，通常是每天两次。治疗进行的天数或周数可以按照影响给药剂量和时间的因素而改变(如2-10天或更长，具体的为2、3、4、5、6、7、8、9或10天)。例如，给予的抗cd3制剂a-dmdt390-bisfv(ucht1)的药量为20μg/kg，该剂量表现为可诱导稳态增殖(假设患者抗dt效价低于22μg/ml)。在4天时间内，该剂量分为8个等分剂量，每次给予一个等分剂量，每天给药两次，即1-4天的治疗。a-dmdt390-bisfv(ucht1)通常在1个4天疗程内完成诱导t细胞耗尽，因为抗dt抗体效价会在第5天升高进而影响后续t细胞的耗尽直到效价降低，如3到12个月后。为解决该问题，在某些方面，应用脱免疫原性截短的毒素序列使得免疫毒素治疗过程延长到例如5或6天或一周或更长。
具体的，给予抗-cd3制剂治疗4天(每天两次)导致正常t细胞数量2-3对数级减少并诱发反应性稳态增殖。循环系统中的t细胞水平，包括成熟的cd3t细胞和中央记忆型、效应记忆型cd8t细胞，可通过本领域已知方法进行检测来优化治疗方案并获得治疗目的。同样的，其他免疫系统组分，如针对免疫毒素的毒素部分、其他疗法或成分、和/或肿瘤抗原等的抗体被视为有效。一般来说，给药后的15-38天，t细胞的再生提高了cd8中央记忆型t细胞的比例，是给药前的10-20倍。这些细胞表达激活的标记物cd45ra-/low，cd3，cd27andcd8。
ii.肿瘤抗原释放。给予抗cd-3制剂与其他释放癌症抗原的疗法组合为增殖的t细胞成为“被训练的”t细胞提供机会。因此，本发明方法还包括以释放肿瘤抗原的方式杀死肿瘤细胞的步骤，或者向发育中的中央记忆型t细胞暴露癌症抗原的步骤以促进生成针对此种癌症抗原的免疫记忆细胞。总之，在给予抗cd3免疫毒素后的5-6天肿瘤细胞抗原应用一种或多种适合的制剂或疗法被释放或其他方式给予受试者。所使用的抗原释放疗法不应损害淋巴结构和功能。
如果肿瘤细胞溶解疗法是局部照射，则实施剂量由放射肿瘤医师决定，具体的在第5天给予单次治疗(即在给予4天抗-cd3免疫毒素治疗后的1-2天)，剂量在3-20gy变动，如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20gy。在选择剂量时要考虑多方面因素，包括患者是否接受化疗，是否有副发病变，手术前还是手术后进行放疗，以及手术的成功率等。大剂量放疗(如单次在10-20gy范围内)可能提高照射区域以外的病变的反应率，并因此对免疫调节产生更显著的效果。
如前所述，也可以应用其他抗原释放疗法代替放疗或与放疗一起实施。例如，如果癌细胞载有cd3抗原，则抗-cd3制剂意外的同样能杀死癌细胞并释放抗原。
其他类型的抗原比如可以是取自受试者的肿瘤或活检样本的抗原制剂。该样本可以被保存，其中一部分在适当的时间间隔与本发明描述的方法联用，如给予4天的抗-cd3制剂之后1-2天。
释放癌症抗原的步骤在治疗的早期进行，使得免疫系统足以在复发之后迅速监控、识别和消灭新型肿瘤而无需进一步治疗。然而，在其他方面，为了进一步增强免疫应答，抗原释放疗法在治疗过程中可以再次应用，类似于免疫接种方案。如果癌症复发，其能容易地被发现，因为届时可以执行释放抗原的治疗。然而，如果没有发现或检测到肿瘤细胞的再生，它可能通过给药肿瘤细胞或含有源自初始肿瘤抗原的片段而增强效应，所述初始肿瘤已经为此保存。在该情况下，细胞或片段可以在初始治疗例如在3-6个月后，如果需要，也可以在和/或更长间隔(例如数年)后给药，以作为“增强剂”。其通过提高患者不间断的免疫监督和与肿瘤作斗争的自然能力，促进了对未照射的和/或正在转移和/或复发的癌症的治疗。所述照射剂量和方案同上文第一种治疗。
iii.给予检查点抑制剂
在抗原释放疗法以后，例如大约7-10天以后，在治疗的第16天，给予检查点抑制剂(治疗的1-4天为给予抗-cd3免疫毒素的时间)。此后，大约每3周给予一次检查点抑制剂，持续几个月(如1-6个月)和/或直到在受试者体内检测不到癌细胞为止，或直到检查点抑制剂产生的副作用导致停用检查点抑制剂为止。
检查点抑制剂的剂量参照fda对获准新药所述的范围或fda对试验药物按照批准的试验新药政策规定的范围。一方面，由于联合应用抗-cd3免疫毒素和检查点抑制剂的协同作用的影响，在i期临床药物组合治疗阶段，检查点抑制剂的剂量相对于临床适应症有所减少。例如，一种或几种检查点抑制剂按照例如大约0.1-100mg/kg、或大约1-75mg/kg、或大约5-50mg/kg的剂量给予。通常在给予抗-cd3制剂的第4天或4天内给予检查点抑制剂。为达到预期效果，可一次足量给药，或者分为小剂量，和/或按周、月重复给药。
在患者的整个生命过程中，治疗过程可按需要重复进行，尤其是癌症复发时。但是，对于所述重复治疗，通常不需要重复给予抗-cd3免疫调节剂，仅给予局部肿瘤放射疗法(如前所述)，联合或不联合给予检查点抑制剂。
本发明方法通过给予包括所述活性制剂(有时是编码它们的核酸序列)和药理学上合适(生理学兼容)载体的组合物来实施。所述组合物的制备为本领域技术人员所熟知。具体的，所述组合物制备成液体制剂或悬浮剂。所述活性成分可与药学上可接受的并与活性成分相兼容的赋形剂混合。适宜的赋形剂为，例如，水、盐溶液、葡萄糖、甘油、乙醇等，或其组合物。此外，该组合物可以包含少量辅料，如润湿剂或乳化剂，ph缓冲剂等。
一般来说，抗-cd3制剂和检查点抑制剂(和/或抗原释放剂，如果后者不是放射物)作为癌症治疗方案的单独组分一起(联合)给药。同样的，任一制剂通常作为单独的组分进行给药。同时给药或不同时给药都能使接受治疗的受试者的血流中存在一种或多种制剂。但是，抗原释放疗法最好在t细胞群体减少之后或再繁殖之前或在繁殖过程中进行。通常在记忆型t细胞再繁殖和转化过程中给予检查点抑制剂，并扩大效应型t细胞活性。给药是系统性的。
虽然本发明所述制剂通常作为单独组分给药，但情况并非总是如此。包含一种或多种抗-cd3制剂和/护一种或多种检查点抑制剂和/或一种或多种抗原释放剂的组合物也包括在其中。
本领域技术人员熟悉化学治疗剂的给药方法，所述组合物(制剂)可能通过很多已知的适宜方式中的任意一种进行给药，包括但不限于：注射、吸入、口服、阴道内给药、鼻腔给药、外敷、滴眼液、喷雾、肿瘤内注射、释放药剂的组合物或装置的移植等。通常的，给药的方式是静脉注射或皮下注射。
此外，该组合物可以和其他治疗形式联用，比如促进免疫系统的物质(如结核杆菌或其部分)、各种其他抗肿瘤/抗癌化学治疗剂(如铂类药物顺铂、氨甲蝶呤等)、止痛药、抗眩晕药、抗过敏药(如抗组胺)、营养补充剂、抗抑郁药等。同样，手术也可以作为整个治疗的一部分，例如在本发明方法开始之前或之后的任何适宜的时间切除一个或多个肿瘤。其他可联合的癌症疗法将在下文进行详述。
本发明描述的制剂可在癌症确诊后的任何所需时间按照任何适宜的治疗方案或时间表进行给药。其可在其他抗癌药物或疗法进行之前、之后或同时进行。例如，其可在其他细胞毒药物或疗法或手术治疗开始前和/或同时或之后(如几天或几周)进行给药。如果和其他治疗形式“一起”给药，其可在先后较短的时间内，例如几分钟、几小时或几天内以单独的组合物给药，或使用包含至少一种(即一种或一种以上)药物(即抗-cd3制剂、检查点抑制剂或抗原释放疗法，如果不是放疗)和一种或一种以上抗癌药物的单一组合物。
治疗的癌症类型
在一些方面，被认为适于使用本发明方法治疗的患者是那些被诊断患有癌细胞没有表面cd3表位的癌症患者，即癌细胞表面没有(缺失)cd3表位。在该方面，如果抗-cd3免疫毒素被用作免疫调节剂，则其主要作为免疫调节剂发挥功效，不表现出直接的杀灭癌细胞作用。不具有表面cd3表位的癌症包括任何非-t细胞白血病或淋巴癌(即任何不属于t细胞白血病或淋巴癌的癌症)；急性髓性白血病(amk)；肾上腺皮质癌；非典型畸形/杆状肿瘤；中枢神经系统癌症；基底细胞癌(如非黑色素瘤)；胆管癌；膀胱癌；肝外膀胱癌；骨癌(如尤文肉瘤家族的肿瘤、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤)；脑干胶质瘤；脑肿瘤(如星形细胞瘤、脑和脊髓瘤、中枢神经系统非典型畸形/杆状瘤、中枢神经系统胚芽瘤、中枢神经系统生殖细胞瘤等)；颅咽管瘤；室管膜瘤；乳腺癌；支气管肿瘤；伯基特淋巴瘤；胃肠道肿瘤；心脏肿瘤；宫颈癌；脊索癌；慢性淋巴细胞白血病(cll)；慢性髓细胞性白血病(cml)；慢性骨髓增生性疾病；结肠癌；直肠癌；颅咽管癌；皮肤t细胞淋巴癌；肝外胆管肿瘤；原位导管癌(dcis)；胚芽肿瘤；子宫内膜癌；食管癌；鼻腔神经胶质瘤；尤文肉瘤；颅外的生殖细胞肿瘤；性腺外生殖细胞瘤；眼癌(眼内黑色素瘤、成视网膜细胞瘤)；骨纤维组织细胞瘤；骨肉瘤、胆囊癌；胃癌；胃肠道类癌肿瘤；胃肠道间质瘤(gist)；妊娠滋养层瘤；神经胶质瘤；毛细胞白血病；头颈癌；心脏癌症；肝癌；下咽癌；眼内黑色素瘤；胰岛细胞瘤；胰腺神经内分泌肿瘤；肾脏(例如肾细胞和肾母细胞瘤)；朗格汉斯细胞组织细胞增生症；喉癌；白血病；肝癌(初级)；小叶原位癌(lcis)；肺癌(非小细胞、小细胞)；淋巴瘤；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；男性乳腺癌；恶性间皮细胞瘤；原发灶隐匿的颈部转移性鳞状细胞癌涉及nut基因的主要中线束癌；口腔癌；内分泌腺瘤综合征；骨髓增生异常综合征；骨髓增生异常/骨髓及外骨髓增殖肿瘤；慢性髓细胞性白血病(cml)；急性髓性白血病(aml)；多发性骨髓瘤；慢性骨髓增生性失调；鼻腔或鼻窦癌；鼻咽癌；成神经细胞瘤；非霍奇金淋巴瘤；口腔癌；口腔癌(oralcavity)；嘴唇和口咽癌；骨肉瘤和骨恶性纤维组织细胞瘤；卵巢癌；胰腺癌；胰腺神经内分泌肿瘤(胰岛细胞瘤)；乳头瘤病；副神经节瘤；甲状腺癌；阴茎癌；咽癌；neochromocytoma；垂体瘤；浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤；胸膜肺母细胞瘤；cns淋巴瘤；前列腺癌；直肠癌；肾细胞(肾脏)癌；唾液腺癌；肉瘤(尤文、卡波济、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、软组织、子宫)；皮肤癌(黑素瘤、merkel细胞癌、非黑色素瘤)；小细胞肺癌、小肠癌、鳞状细胞癌；原发灶隐匿的鳞状颈部癌症；转移性胃癌；睾丸癌；喉癌；胸腺瘤和胸腺癌；甲状腺癌；肾盂和输尿管移行性细胞癌；滋养层肿瘤，妊娠期的；尿道肿瘤；子宫内膜癌；子宫肉瘤；阴道癌；外阴癌；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；肾母细胞瘤；鼻腔和鼻窦癌；鼻咽癌；成神经细胞瘤；非小细胞肺癌，皮肤黑色素瘤，霍奇金淋巴瘤，以及它们的转移和复发。
其他组合疗法
在一些方面，在治疗中还可以使用其他毒素制剂和/或其他疗法实现例如杀死全部癌细胞、导致肿瘤缩小等目的，例如短期的一线疗法。因此，可给予一种或多种其他的抗癌制剂或抗癌形式或疗法，例如包括但不限于：靶向于特异性肿瘤或生成肿瘤的血管细胞毒免疫毒素，细胞毒抗肿瘤药物诸如烷基化制剂顺铂、卡铂、oroxaliplatin；伪装为嘌呤(如咪唑硫嘌呤、巯嘌呤)或嘧啶的抗代谢剂；植物生物碱和萜类，例如长春花生物碱如长春新碱、长春花碱、长春瑞滨、长春地辛；足叶草毒素、依托泊苷和替尼泊苷；紫杉烷类如紫杉醇；拓扑异构酶抑制剂i型包括喜树碱、伊立替康和拓扑替康，拓扑异构酶抑制剂ii型例如安丫啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷和替尼泊苷；和细胞毒性抗生素例如放线菌素、蒽环霉素、阿霉素、道诺霉素、柔比星、伊达比星、表柔比星、博来霉素、普卡霉素、丝裂霉素；基因治疗(例如将编码抗癌剂的核苷酸递送到肿瘤)、肿瘤外科手术/切除术；激素疗法；血管生成抑制剂给药；给药其他免疫调节剂或治疗(例如异基因/同源造血干细胞移植)；借助体外放射治疗(ebrt)的放射疗法；或借助短距离放射治疗、电化学疗法的内部治疗；紫外线(uv)治疗等。
以下实施例旨在说明本发明各种代表性的方面，但不应被解释为用于对本发明的限制。
具体实施方式
实施例1a-dmdt390-bisfv(ucht1)融合蛋白
适应性临床试验设计是一项包括对研究设计的一个或多个特定方面和基于受试者数据分析(通常为临时数据)的假设按预期计划进行改进的研究。按照预期计划的时间点进行、以双盲或非盲的方式、以正式统计假设检验对累积的研究数据的分析。
本实验首先进行剂量增加研究来评估联合疗法对不同癌症的安全性。来自任一预先计划的组合剂量水平的所有入组受试者在第一次给药的28天内观测其dlt。一旦计划的任一剂量组的受试者人数(3+3设计中的前3名受试者)通过28天dlt窗口，则该剂量水平被清除，研究向下一剂量水平或下一阶段进行。由于目标是检测安全性，而非有效性，因此可以包括多种未得到满足的肿瘤类型且无需等到起效点就可以进行下一剂量水平，以使研究更快登记并尽快向下一步进行。抗-pd-l1的剂量扩大在三期临床试验已经达到1mg/kg，并将发展到2.5mg/kg和最终5mg/kg的剂量(3+3设计中的3名受试者)。resimmune的剂量将保持在恒定的20μg/kg，每4天一次，每天两次，因为该剂量可诱导t细胞耗竭和由此而产生的稳态增殖以及后续的类似tcm(中央记忆型t细胞)细胞20倍的增加。放射剂量，优选sbrt，由放射肿瘤医师按照转移癌的大小在14-24gy范围内选择，旨在缓解而非有效。在需要评价有效率的剂量扩大阶段，我们可以选择添加去掉resimmune的第二试验组来确定利用resimmune组合的有效性增加的程度。由于能够获得数据我们将利用统计学方法来预测最佳的病例队列规模。
我们预测resimmune联合抗-pd-l1相对于单独使用抗-pd-l1效果最低提高135％且有可能提高到250％。这一提高很可能是因为组合疗法能够在肿瘤环境中提高肿瘤抗原且消除t细胞抑制机制。
排除：患有肝细胞癌的患者表现为不具备复制肝病毒；有心脏病史的患者需排除。参见研究者手册：使用a-dmdt390-bisfv(ucht1)治疗阿利贝尔氏病。
对于不可切除的黑色素瘤，在使用抗-pd-1检查点抑制剂
临床研究已经表明使用检查点抑制剂治疗癌症，肿瘤体细胞突变的数量与临床有效率的非常相关，即使浸润肿瘤的淋巴细胞(tils)能够利用较低的体细胞突变数量识别肿瘤。体细胞突变的数量问题导致极少的tils或t细胞活性不足的tils。在小鼠肿瘤研究中，诱发稳态增殖的制剂提高了过继性转移t细胞的抗癌活性。阻断pd-1/pd-l1提高了中央记忆型t细胞的效应功能，其可能是因为中央记忆型t细胞高水平表达pd-1.
检查点抑制剂在该过程中帮助阻断pd-1/pd-l1。该治疗方案对黑色素瘤患者尤其有效，因为黑色素瘤具有高水平的体细胞突变。然而，该治疗方案对于其他低体细胞突变的癌症也有效果，如肝细胞癌，是因为对中央记忆型t细胞数量的补偿促进(由
在示例性方面，采用抗-cd3制剂resimmunetm、抗-pd-l1和缓解性放疗三者组合来治疗患有不可切除的iv期癌症的患者。缓解性放疗的作用在于帮助释放黑色素瘤抗原从而导致树突细胞和t细胞浸润到肿瘤内(见表1)。
表1
第二个目标是用高通量深度测序技术检测人tcrv-β区以便更好地表征在治疗过程外周t细胞库的扩增和克隆特性。免疫疗法引起的t细胞库的变化与外围t细胞稳态增殖/激活和免疫抑制细胞的百分比/表现型(调控t细胞和il-17+t细胞)有关。这些改变与单独使用抗pd-l1或抗pd-1治疗而无
实施例2小鼠模型证明抗cd3免疫毒素对肿瘤生长的效果，以研究检查点抑制剂和抗cd3免疫毒素的协同作用
为了证明抗cd3免疫毒素的抗肿瘤效果，我们开发了类似于抗人类cd3免疫毒素resimmune的抗小鼠cd3免疫毒。该抗小鼠cd3免疫毒素具有与人类对应物相同的结构且同样对cd3复合体的epsilon链具有特异性。免疫毒素能够有效杀灭体外培养的小鼠cd3阳性t细胞(见图4)。
在固体肿瘤模型中，我们使用了具有正常免疫功能的小鼠c57bl/c和经修饰的小鼠胶质瘤细胞系gl261megfrviii。该细胞系过表达小鼠egfrviii，但不表达cd3，因此对抗小鼠cd3免疫毒素不敏感。gl261megfrviii细胞(5x105/小鼠)被皮下接种到c57bl/c小鼠的右侧。当移植肿瘤生长到150mm3，通过尾静脉注射，给予实验组抗小鼠cd3免疫毒素，每只注射0.1ml抗小鼠cd3免疫毒素的pbs溶液(40μg/kg)，每天注射一次，共4天。对照组每只小鼠给予0.1ml的pbs缓冲液。如图5所示，抗小鼠cd3免疫毒素能显著延缓肿瘤生长。
由于抗小鼠cd3免疫毒素不直接作用于gl261megfrviii细胞，不会影响细胞的生长，因此如resimmune-ctcl临床试验所见，其对gl261megfrviii移植肿瘤的抑制作用则主要取决于其免疫调节功能。我们认为抗-cd3免疫毒素具有抗肿瘤活性是因为它能引起t细胞耗尽导致cd8t细胞通过稳态增殖快速扩增，杀灭肿瘤细胞。现在已知肿瘤细胞表达检查点分子(如pd-l1)以逃避t细胞的攻击，因此，我们预测如果联合使用抗cd3免疫毒素和检查点抑制剂(如抗-pd-1或抗pd-l1抗体)，将能在小鼠肿瘤模型和人类癌症治疗中达到更深远和持续的肿瘤抑制效果。
我们预计联合使用抗小鼠cd3免疫毒素和检查点抑制剂(如抗-小鼠pd-1或抗-小鼠pd-l1抗体)，总应答率至少能够达到非治疗对照组的135％；肿瘤抑制效果(或肿瘤消退效果)可能达到非治疗对照组的250％。在小鼠肿瘤模型中，可以用连续4天尾静脉注射或肿瘤内注射基于白喉毒素(dt)的抗-egfrviii免疫毒素的方法来释放肿瘤抗原
虽然本发明已经描述了优选的实施例，本领域技术人员可以认识到本发明可以在权利要求书的精神和范围内进行修改后实施。相应的，本发明不应该限于上述实施例，但进一步的，应该包含与本说明书此处所提供的精神和范围内的全部修饰及其等同。
序列表
<110>美国安吉益民公司
<120>免疫调节剂联合检查点抑制剂治疗癌症的方法
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