一种非活性全细胞细菌在肿瘤治疗上的应用

1.本发明涉及癌症的治疗技术领域，具体地，涉及一种非活性全细胞细菌在肿瘤治疗上的应用，本发明提供了一种增强免疫检查点抑制剂的联合疗法，用于治疗、减少、抑制或控制免疫检查点抑制剂难治性患者中一种或多种肿瘤的非活性全细胞别样杆菌。其中所述免疫检查点抑制剂难治性患者旨在与非活性全细胞别样杆菌的施用同时、分别或顺序进行免疫检查点抑制剂治疗，并且任选地进一步包括施用一种或多种其他抗癌治疗或药物治疗。


背景技术：

2.免疫增强剂是一个新的药物类别，也被称为免疫调节剂，曾用名为免疫促进剂及免疫刺激剂。免疫增强剂大多以肿瘤的非特异性免疫疗法为目的而开发，通过提高机体免疫功能，加速诱导免疫应答反应发挥治疗作用。临床上主要用于免疫缺陷疾病、恶性肿瘤的辅助治疗，以及难治性细菌或病毒感染。临床上常用的免疫增强剂药物依其来源分为五类：
3.1、细菌来源的免疫增强剂药物，如卡介苗；
4.2、人或动物免疫系统产物，如胸腺素、转移因子、干扰素、白介素等；
5.3、化学合成免疫增强剂药物，如左旋咪唑、聚肌胞苷酸等；
6.4、真菌多糖类，如香菇多糖等；
7.5、中药及其他，如人参、黄芪等中药有效成分；植物血凝素(pha)、刀豆蛋白a及胎盘多糖等。
8.细菌来源的免疫增强剂在癌症治疗中的应用历史由来已久，早在1893年，癌症免疫领域的先驱者william coley采用由化脓性链球菌制备的“coley毒素”，反复接种给晚期癌症患者，刺激发热和机体产生免疫反应，能导致一些患者的肿瘤消退。“coley毒素”成为癌症免疫治疗的投石问路之举，促使现代癌症免疫疗法兴起。过去十年中，癌症免疫疗法前所未有的崛起和成功彻底改变了多种恶性肿瘤的临床管理。其中，免疫检查点阻断剂(immune-checkpoint inhibitors，icis)是免疫疗法中最前沿的技术之一。icis疗法通过阻断被肿瘤细胞劫持的免疫抑制通路(如pd-l1/pd-1和ctla-4/b7-1)来重新活化t细胞，重新激活机体的免疫系统对肿瘤细胞的识别与清除能力，具有疗效好，反应持久的优势，开创了肿瘤治疗的新时代。icis疗法在因缺乏治疗选择的多种肿瘤类型的应用中引发了癌症治疗的变革，成为癌症治疗的新里程碑。
9.接受icis治疗的患者在治疗中断仍后可持续缓解，为某些患者，尤其是黑色素瘤患者，增加了治愈希望。尽管接受了icis治疗的部分患者可实现完全缓解，即所有可见肿瘤转移灶完全消失。icis单药治疗在患者中响应率低和单药治疗耐药的问题成为其目前发展和应用的最大瓶颈，能够在单药icis治疗中到达部分或完全缓解的患者仅占有15％～40％。患者对icis治疗的响应异质性或耐药性的相关因素除了肿瘤内部因素，如肿瘤微环境，还包括宿主相关的因素，如年龄，遗传多样性，饮食及肠道菌群等因素。某些特定的肠道细菌通过定植或自身全细胞组成成分与肠黏膜免疫系统的直接作用或通过其代谢功能产
gothenburg)，保藏号为ccug46020的芬氏别样杆菌；
33.保藏于法国cip菌种保藏中心(collection de l'institut pasteur of institut pasteur)，保藏号为cip107999的芬氏别样杆菌；
34.保藏于中国广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为gdmcc 1.2324的芬氏别样杆菌。
35.优选地，所述非活性全细胞细菌，包括细菌全细胞成分，细菌全细胞衍生物、或细菌全细胞代谢产物中的一种或几种。
36.更优选地，所述细菌全细胞成分，包括细菌组成成分和遗传物质及其相关成分，具体地，包括细菌细胞壁，细胞膜，菌毛，鞭毛，lps，和核酸物质等来源于细菌的成分的一种或几种。
37.更优选地，所述细菌全细胞衍生物，包括细菌胞外囊泡，细菌相关外泌体，前噬菌体的一种或几种。
38.更优选地，所述细菌全细胞代谢产物是指由细菌全细胞成分参与产生的代谢物，包括所有有机酸、无机酸、碱、蛋白质和肽、酶和辅酶、氨基酸和核酸、碳水化合物、脂质、糖蛋白、脂蛋白、糖脂、维生素、所有生物活性化合物、含有无机成分的代谢物以及所有小分子的一种或几种，例如含氮分子或含亚硫酸分子。
39.进一步优选地，同时或分别施用属于别样杆菌属(alistipes)的非活性全细胞细菌和免疫检查点抑制剂。
40.优选地，所述肿瘤治疗为肿瘤缩小或稳定、总生存时间延长、无恶化生存期延长、生活质量改善。
41.优选地，所述肿瘤为腺瘤、恶性肿瘤和腺癌，其中肿瘤按照组织来源或细胞名称分类，包括：肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺癌、胰腺癌、宫颈癌、胆管癌、结肠癌、结直肠癌、弥漫性大b细胞淋巴瘤、多形成性胶质细胞瘤、胶质瘤、头颈癌、肾嫌色细胞癌、混合肾癌、肾癌、白血病、淋巴瘤、脑癌、肝癌、肺腺癌、肺鳞癌、间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、嗜铬细胞瘤、副神经节瘤、前列腺癌、直肠腺癌、肉瘤、皮肤黑色素瘤、胃癌、食管癌、睾丸癌、甲状腺癌、胸腺癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、葡萄膜黑色素瘤和软组织肉瘤中的一种或几种。
42.更优选地，所述肿瘤为肠癌或肺癌。
43.优选地，所述肿瘤为恶性肿瘤、转移性肿瘤或非转移性肿瘤。
44.优选地，在此所述肿瘤包括恶性、转移性和非转移性类型；包括癌症的任何阶段。
45.更优选地，所述免疫检查点抑制剂为作用于t细胞负性共刺激(共抑制)分子和/或它们各自的配体的阻断剂的一种或多种的组合。
46.再优选地，t细胞负性共刺激(共抑制)分子和/或它们各自的配体选自ctla-4、pd-1、pd-l1、pd-l2、b7-1、b7-2、b7-h3、b7-h4、b7-h6、a2ar、ido、tim-3、btla、vista、tigit、lag-3、cd40、kir、ceacam1、garp、ps、csf1r、cd94/nkg2a、tdo、tnfr、dcr3。
47.进一步优选地，所述t细胞负性共刺激(共抑制)分子的配体的阻断剂选自纳武利尤单抗(nivolumab，pd-1单抗)、伊匹单抗(ipilimumab，ctla-4单抗)、帕博利珠单抗(pembrolizumab，pd-1单抗)、阿托珠单抗(azetolizumab，pd-l1单抗)、阿特朱单抗(atezolizumab，pd-l1单抗)、卡瑞珠丽单抗(camrelizumab，pd-l1单抗)、替雷丽珠单抗(tislelizumab，bgb-a317)、度伐利尤单抗(durvalumab，pd-l1单抗)、曲美木单抗
(tremelimumab，ctla-4单抗)、斯巴达珠单抗(spartalizumab，pd-1单抗)、阿维鲁单抗(avelumab，pd-l1单抗)、信迪利单抗(sintilimab，pd-1单抗)、特瑞普利单抗(toripalimab，pd-1单抗)、西米普利单抗(cemiplimab，pd-1单抗)、mga012(retifanlimab，pd-1单抗)、mgd013(tebotelimab，pd-1/lag-3双抗)、mgd019(pd-1/ctla-4双抗)、恩比利珠单抗(enoblituzumab，b7-h3单抗)、mgd009(b7-h3单抗)、mgc018(b7-h3单抗)、medi0680(pd-1单抗)、pdr001(pd-1单抗)、faz053(pd-l1单抗)、tsr022(tim-3单抗体)、mbg453(tim-3单抗)、relatlimab(bms986016,lag-3单抗)、lag525(lag-3单抗)、imp321(lag-3单抗)、regn3767(lag-3单抗)、培西达替尼(pexidartinib,csf-1r单抗)、ly3022855(csf-1r单抗)、fpa008(csf-1r单抗)、blz945(csf-1r单抗)、gdc0919(navoximod,ido单抗)、艾帕斯塔(epacadostat,ido单抗)、indoximid(ido单抗)、bms986205(ido单抗)、cpi-444(a2ar单抗)、medi9447(oleclumab,cd73单抗)、pbf509(a2ar单抗)、利瑞路单抗(lirilumab,kir单抗)或其中任意几种的组合；优选地，其中所述阻断剂选自纳武利尤单抗、帕博利珠单抗、特瑞普利单抗、信迪利单抗、西米普利单抗或其中任意几种的组合。
48.再优选地，所述免疫检查点抑制剂为作用于pd-1/pd-l1信号通路和/或pd-1/pd-l2信号通路的抑制剂，其中pd-1是指程序性细胞死亡蛋白1，又称为cd279，pd-l1(又称为b7-h1或cd274)和pd-l2(又称为b7-dc或cd273)是pd-1的配体。
49.进一步优选地，所述pd-1/pd-l1信号通路或pd-1/pd-l2信号通路的抑制剂选自纳武利尤单抗(nivolumab，pd-1单抗)、帕博利珠单抗(pembrolizumab，pd-1单抗)、阿托珠单抗(azetolizumab，pd-l1单抗)、阿特朱单抗(atezolizumab，pd-l1单抗)、卡瑞珠丽单抗(camrelizumab，pd-l1单抗)、替雷丽珠单抗(tislelizumab，bgb-a317)、度伐利尤单抗(durvalumab，pd-l1单抗)、斯巴达珠单抗(spartalizumab，pd-1单抗)、阿维鲁单抗(avelumab，pd-l1单抗)、信迪利单抗(sintilimab，pd-1单抗)、特瑞普利单抗(toripalimab，pd-1单抗)、西米普利单抗(cemiplimab,pd-1单抗)、mga012(retifanlimab，pd-1单抗)、mgd013(tebotelimab，pd-1/lag-3双抗)、mgd019(pd-1/ctla-4双抗)、medi0680(pd-1单抗)、pdr001(pd-1单抗)、faz053(pd-l1单抗)或其中任意几种的组合。
50.更进一步优选地，所述pd-1/pd-l1信号通路或pd-1/pd-l2信号通路的抑制剂选自选伊匹单抗(ipilimumab，ctla-4单抗)、曲美木单抗(tremelimumab，ctla-4单抗)、mgd019(pd-1和ctla-4双抗)或其中任意几种的组合。
51.再更进一步优选地，所述免疫检查点抑制剂为作用于pd-1/pd-l1信号通路和/或pd-1/pd-l2信号通路的抑制剂和/或作用于ctla-4/b7-1信号通路和/或ctla-4/b7-2信号通路的抑制剂。
52.最优选地，所述免疫检查点抑制剂为所述免疫检查点抑制剂为pd-1单克隆抗体。
53.优选地，在与所述非活性全细胞细菌的施用同时、分别或顺序进行免疫治疗，化学治疗或放射治疗。
54.优选地，所述应用的施用的对象是人类，所述人类是婴幼儿，儿童，青少年，成年人或老人。
55.优选地，其中所述应用施用的对象是非人类灵长类动物，所述非人类灵长类动物是哺乳动物。
56.优选地，将所述非活性全细胞细菌以细菌的105至10
12
个cfu之间，或以107至
10
11
cfu之间、或108至10
11
cfu之间、或109至10
11
cfu之间、或10
10
至10
11
cfu之间的剂量施用，更优选地，以包含所述细菌的109至10
11
cfu之间的剂量施用。
57.本发明还要保护以下内容：
58.一种用于肿瘤治疗的试剂盒，其包含任一项所述的免疫检查点抑制剂的一种或多种，以及任一项所述的细菌，并且任选地包含容器；
59.或由任一项所述的免疫检查点抑制剂的一种或多种，以及任一项所述的非活性全细胞细菌组成，并且任选地包含容器。
60.一种非活性全细胞细菌，所述非活性全细胞细菌的菌株包含的16s rdna序列，与别样杆菌菌属(alistipes)的16s rdna序列具有至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％或100％的一致性。
61.一种非活性全细胞细菌，所述非活性全细胞细菌的菌株包含的16s rdna序列，与芬氏别样杆菌菌种(alistipes finegoldii)的16s rdna序列具有至少99％的一致性。
62.一种非活性全细胞细菌，所述非活性全细胞细菌的菌株包含的16s rdna序列，其16s rdna序列与以下菌株的中的任意一个的16s rdna序列具有至少99.5％或100％的一致性：
63.保藏于德国dsm微生物和细胞培养物保藏中心(deutsche sammlung von mikroorganismen und zellkulturen＝german collection of microorganisms and cell cultures)，保藏号为dsm 17242的芬氏别样杆菌(ncbi：txid679935)；
64.保藏于日本jcm菌种保藏中心(japan collection of microorganisms)，保藏号为jcm16770的芬氏别样杆菌；
65.保藏于韩国kctc菌种保藏中心(korean collection for type cultures)，保藏号为kctc 15236的芬氏别样杆菌；
66.保藏于芬兰赫尔辛基厌氧菌参考实验室(anaerobe reference laboratory，helsinki collection，national public health institute，helsinki，finland)，保藏号为ahn 2437的芬氏别样杆菌；
67.保藏于瑞典ccug菌种保藏中心(culture collection university of gothenburg)，保藏号为ccug46020的芬氏别样杆菌；
68.保藏于法国cip菌种保藏中心(collection de l'institut pasteur of institut pasteur)，保藏号为cip107999的芬氏别样杆菌；
69.保藏于中国广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为gdmcc 1.2324的芬氏别样杆菌。
70.其中保藏号为：dsm 17242的芬氏别样杆菌(alistipes finegoldii dsm17242)的16s rdna序列如seq id no：1所示。
71.一种制剂，将有效量的用于治疗肿瘤的中任一项所述的非活性全细胞细菌中的一种或多种的组合物，加入药学上可接受的载体和辅料制备成冻干粉，片剂、胶囊剂、颗粒剂或针剂；其中“药学上可接受的载体”是指对有机体不引起明显刺激性和不干扰所给予化合物的生物活性和性质的载体，其中“辅料”是指溶剂、稀释剂或其它赋形剂、分散剂、表面活性剂。
72.一种组合物，其包含中任一项的非活性全细胞细菌和药学上可接受的载体。
73.一种组合物，其包含配制成用作药物的任一项的非活性全细胞细菌。
74.一种组合物，其包含配制为用作医疗食品的任一项的非活性全细胞细菌。
75.一种组合物，其包含两种或更多种中任一项所述的非活性全细胞细菌的混合物，并且任选地还包含药学上可接受的载体。
76.一种组合物，其包含有效量的用于肿瘤治疗的两种或更多种任一项所述的非活性全细胞细菌全细胞的混合物，并且还任选地包含药学上可接受的载体。
77.一种组合物，其包含有效量的用于肿瘤治疗的两种或更多种任一项所述的非活性全细胞细菌全细胞的细菌成分、细菌衍生物、或细菌代谢产物中的一种或几种组合物，并且还任选地包含药学上可接受的载体。
78.一种食品、饮料、食品补充剂、益生菌或保健食品，其包含任一项所述的非活性全细胞细菌，被配制成制剂用于肠内营养。
79.一种食品、饮料、食品补充剂、益生菌或保健食品，其包含两种或更多种任一项所述的非活性全细胞细菌的混合物，被配制成制剂用于肠内营养。
80.优选地，任一项细菌、制剂或组合物，其中所述非活性全细胞细菌或组合物被制备成冻干粉，片剂、胶囊剂、颗粒剂或针剂。
81.优选地，任一项所述的非活性全细胞细菌、制剂、组合物、食品、饮料、食品补充剂、益生菌或保健食品，其特征在于，其施用对象为人类。
82.优选地，任一项所述的非活性全细胞细菌、制剂、组合物、食品、饮料、食品补充剂、益生菌或保健食品，其特征在于，其中所述人类是婴幼儿、儿童、青少年、成年人或老人。
83.优选地，任一项所述的非活性全细胞细菌、组合物、食品、饮料、食品补充剂、益生菌或保健食品，施用于非人类灵长类动物，所述非人类灵长类动物是哺乳动物；鸟类；爬行动物；鱼；两栖动物；节肢动物或家畜动物。
84.优选地，任一项所述的非活性全细胞细菌、制剂、组合物、食品、饮料、食品补充剂、益生菌或保健食品，在肿瘤治疗中的应用。
85.优选地，任一项所述的非活性全细胞细菌、制剂、组合物、食品、饮料、食品补充剂、益生菌或保健食品，包含有效量的所述细菌，在肿瘤治疗上中的应用。
86.优选地，任一项所述的非活性全细胞细菌、制剂、组合物、食品、饮料、食品补充剂、益生菌或保健食品，包含有效量的所述非活性全细胞细菌，在肿瘤治疗中的应用，其特征在于，所述肿瘤治疗施用任一项所述的细菌、制剂、组合物、食品、饮料、食品补充剂、益生菌或保健食品。
87.一种组合物，其包含用于治疗癌症的有效量的中任一项非活性全细胞细菌或组合物，并且任选地还包含药学上可接受的载体。
88.一种组合物，其包含有效量的用于治疗癌症的两种或更多种任一项非活性全细胞细菌或组合物，并且还任选地包含药学上可接受的载体。
89.一种组合物，包括芬氏别样杆菌(alistipes finegoldii)和免疫检查点抑制剂。
90.优选地，所述免疫检查点抑制剂为pd-1单克隆抗体(αpd-1)。
91.属于别样杆菌属(alistipes)的细菌的非活性全细胞细菌全细胞的细菌成分、细菌衍生物、或细菌代谢产物中的一种或几种在制备免疫检查点抑制剂治疗肿瘤的增效剂中的应用。
92.本发明还要求保护一种药物，包括所述的组合物，具体地，成分为属于别样杆菌属(alistipes)的非活性全细胞细菌和免疫检查点抑制剂治疗肿瘤的药物组合物，
93.优选地，所述免疫检查点抑制剂为pd-1单克隆抗体(αpd-1)。
94.属于别样杆菌属(alistipes)的细菌的非活性全细胞细菌全细胞、细菌衍生物、或细菌代谢产物中的一种或几种在制备免疫检查点抑制剂治疗肿瘤的增效剂中的应用。
95.优选地，属于别样杆菌属(alistipes)的细菌的非活性全细胞细菌作为在制备免疫检查点抑制剂的增效剂中的应用，所述增效剂能够提高免疫检查点抑制剂治疗肿瘤的效果。
96.优选地，所述免疫检查点抑制剂为pd-1单克隆抗体(αpd-1)。
97.更优选地，属于别样杆菌属(alistipes)的细菌为以下菌株的中的一个或几个的组合：
98.保藏于德国dsm微生物和细胞培养物保藏中心(deutsche sammlung von mikroorganismen und zellkulturen＝german collection of microorganisms and cell cultures)，保藏号为dsm 17242的芬氏别样杆菌(ncbi：txid679935)；
99.保藏于日本jcm菌种保藏中心(japan collection of microorganisms)，保藏号为jcm16770的芬氏别样杆菌；
100.保藏于韩国kctc菌种保藏中心(korean collection for type cultures)，保藏号为kctc 15236的芬氏别样杆菌；
101.保藏于芬兰赫尔辛基厌氧菌参考实验室(anaerobe reference laboratory，helsinki collection，national public health institute，helsinki，finland)，保藏号为ahn 2437的芬氏别样杆菌；
102.保藏于瑞典ccug菌种保藏中心(culture collection university of gothenburg)，保藏号为ccug46020的芬氏别样杆菌；
103.保藏于法国cip菌种保藏中心(collection de l'institut pasteur of institut pasteur)，保藏号为cip107999的芬氏别样杆菌；
104.保藏于中国广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为gdmcc 1.2324的芬氏别样杆菌。
105.本发明提出一种用于治疗肿瘤患者的非活性全细胞芬氏别样杆菌(alistipes finegoldii，rx-af01)，其可增效免疫检查点抑制剂疗效。具体地，本发明提出一种联合疗法：将在与rx-af01的施用同时、分别或顺序进行免疫检查点抑制治疗，从而增加免疫检查点抑制的治疗效果。
106.施用rx-af01的给药方式为口服。
107.施用联合疗法顺序为：在免疫检查点抑制治疗同时，之前和/或之后施用所述rx-af01。
108.所述联合疗法中，根据个体患者对治疗的耐受性，根据需要执行剂量延迟和/或剂量减少以及时间调整。
109.本发明中所述的rx-af01可包含有效量的通常分散于药学上或药理学上可接受的载体中的芬氏别样杆菌(alistipes finegoldii)。
110.术语“药学上或药理学上可接受的”是指当施用至动物(例如人，如果合适)时不产
生不良反应、过敏反应或其他不利反应的分子实体和组合物。如本文所述的药理学上可接受的载体的具体实例是硼酸盐缓冲液或无菌盐水溶液。
111.本发明中所述增效免疫检查点抑制剂，可用于免疫检查点抑制剂难治性患者，其中所述免疫检查点抑制剂难治性患者表现出对所述免疫检查点抑制剂治疗的先天性(原发性)抗性，表现为从第一剂开始持续至少约8周或12周对所述免疫检查点抑制剂治疗的应答缺乏或应答不足。
112.本发明中所述增效免疫检查点抑制剂，可用于免疫检查点抑制剂难治性患者，其中所述免疫检查点抑制剂难治性患者表现出对所述检查点抑制剂治疗的后天性(继发性)抗性，表现为对所述免疫检查点治疗有初始应答，但一种或多种肿瘤随后复发和发展。
113.本发明中所述的联合疗法的治疗效果评估，通过增加的总生存时间来测量增强的治疗效果。
114.本发明中所述的联合疗法的治疗效果评估，通过增加的无进展生存期来测量增强的治疗效果。
115.本发明中所述的联合疗法的治疗效果评估，其中如recist 1.1所定义，通过减少或稳定一个或多个所述肿瘤的肿瘤尺寸来测量所述增强的治疗效果，包括目标肿瘤的疾病稳定(sd)、完全缓解(cr)或部分缓解(pr)；和/或一种或多种非目标肿瘤的疾病稳定(sd)或完全缓解(cr)。
116.本发明中所述的联合疗法的治疗效果评估，通过改善的总缓解率和/或提升的生活质量来测量增强的治疗效果。
117.本发明中所述的联合疗法的安全性评估，通过是否引发腹泻或肠炎来测量其安全性。
118.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
119.本发明通过使用非活性全细胞别样杆菌的口服制剂，联合免疫检查点抑制剂，显著增强免疫检查点抑制剂对多多种肿瘤的药效，且安全性更好，延长癌症患者整体存活时间，提高癌症免疫治疗人群的响应率，扩大癌症免疫治疗(免疫治疗检查点抑制剂)的受益肿瘤患者人群。
附图说明
120.图1为实施例1施用活性rx-af01和非活性全细胞rx-af01于肠癌细胞系小鼠模型的流程图。
121.图2为活性rx-af01与非活性全细胞rx-af01的电镜照片对比图。
122.图3为实施例1施用活性rx-af01和非活性全细胞rx-af01于肠癌细胞系小鼠模型的肿瘤体积变化曲线。
123.图4为实施例1施用活性rx-af01和非活性全细胞rx-af01于肠癌细胞系小鼠模型的肠道菌群的β-多样性pcoa分析。
124.图5为实施例1比较施用活性rx-af01和非活性全细胞rx-af01于肠癌细胞系小鼠模型的肠道菌群的属水平的组成差异。
125.图6为比较施用活性rx-af01和非活性全细胞rx-af01于肠癌细胞系小鼠模型的肠道菌群相对丰度排名前20的细菌菌属的统计学差异分析。
126.图7为实施例2施用活性rx-af01和非活性全细胞rx-af01于肺癌细胞系小鼠模型的流程图。
127.图8为实施例2施用活性rx-af01和非活性全细胞rx-af01于肺癌细胞系小鼠模型的肿瘤体积变化曲线。
128.图9为实施例2施用活性rx-af01和非活性全细胞rx-af01于肺癌细胞系小鼠模型实验终点肿瘤重量。
129.图10为实施例2施用活性rx-af01和非活性全细胞rx-af01于肺癌细胞系小鼠模型实验终点的肿瘤照片。
130.图11为实施例3rx-af01在健康人肠道及其他身体部位的相对丰度分析。
具体实施方式
131.下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
132.实施例1使用活性和非活性全细胞rx-af01联合免疫检查点抑制剂治疗肠癌
133.一、实验方法
134.1、实验材料
135.(1)小鼠品系：6周龄的雌性c57bl/6j小鼠
136.(2)肿瘤细胞株：鼠肠癌细胞系(mc38，atcc)
137.(3)rx-af01菌株信息：芬氏别样杆菌(alistipes finegoldii，dsm no.:17242,type strain，其16s rdna序列如seq id no：1所示)，商购自dsmz德国国家培养物保藏中心，(dsmz的官方网址：http://www.dsmz.de)。
138.(4)芬氏别样杆菌(rx-af01)的培养基成分：液体dsmz104培养基，配方主要包括含蛋白胨，酵母提取物，牛肉提取物和葡萄糖等，商购自dsmz德国国家培养物保藏中心。
139.(5)免疫检查点抑制剂：pd-1单抗(αpd-1)，克隆号g4c2，试剂为上海君实生物医药科技股份有限公司赠送。
140.(6)抗生素组合：甲硝唑100mg/kg，万古霉素50mg/kg，青霉素钠100mg/kg，硫酸新霉素100mg/kg。
141.2、实验分组
142.实验分组如表1所示，
143.表1：
144.af01的抗肿瘤效应。
159.图4为实施例1使用活性rx-af01和非活性全细胞rx-af01治疗肠癌的肠道菌群的β-多样性pcoa(principal co-ordinates analysis)主坐标分析。其中肠道菌群的β多样性是指不同肠道环境之间整个肠道环境细菌的组成差异性；两组间的统计学差异衡量使用anosim分析方法(analysis of similarities)，anosim分析是一种基于置换检验和秩和检验的非参数检验方法，用来检验组间的差异是否显著大于组内差异，从而判断分组是否有意义。该anosim方法主要有两个数值结果：一个是r，其范围为[-1，1]，用于判断不同组间否存在差异，r》0说明组间差异大于组内差异，r《0组间差异小于组内差异，r值越接近于1表示组间差异越大；一个是p，用于说明是分组间否存在显著差异。
[0160]
结果显示，使用活性rx-af01和非活性全细胞rx-af01治疗肠癌的肠道菌群的β多样性存在显著而大(r＝0.6950，p＝0.001)的差异。证明使用活性rx-af01和非活性全细胞rx-af01治疗肠癌可导致整体肠道菌群的组成存在显著而大的差异，进而形成较大的肠道黏膜免疫状态差异。因此在实施例1中，非活性全细胞rx-af01与的抗肿瘤效应差异可能与其对肠道菌群结构的重塑作用差异相关，即非活性全细胞rx-af01非活性全细胞联合αpd-1治疗肠癌条件下重塑的肠道菌群结构与增强的抗肿瘤免疫功能相关。
[0161]
图5为实施例1比较使用活性rx-af01和非活性全细胞rx-af01治疗肠癌的肠道菌群的属水平的组成差异。图6为实施例1比较使用活性rx-af01和非活性全细胞rx-af01治疗肠癌的肠道菌群相对丰度排名前20的细菌菌属的wilcoxon rank-sum test(威尔科克森秩和检验)统计学差异分析。
[0162]
结果显示，使用活性rx-af01和非活性全细胞rx-af01治疗肠癌之间肠道菌群相对丰度排名前20的细菌菌属中，有8个菌属存在显著的统计学差异。其中，差异最大的为拟杆菌属(bateroides)，使用活性rx-af01治疗组中拟杆菌属的相对丰度显著高于非活性rx-af01治疗组；另外一个突出的差异为脱硫弧菌属(desulfovibrio),该菌属仅存在于非活性全细胞联合疗法组(αpd-1+rx-af01_heat killed)。而rx-af01所属的别样杆菌属(alistipes)在活性联合疗法组中的相对丰度显著(p＝0.0156)高于非活性全细胞联合疗法组。证明使用活性rx-af01和非活性全细胞rx-af01治疗肠癌可导致肠道菌群的属水平的组成存在显著差异，进而形成差异的肠道黏膜免疫状态。因此在实施例1中，活性全细胞rx-af01与非活性全细胞rx-af01的抗肿瘤效应差异与其对肠道中某些菌属的特定富集或者生长削弱，进而形成差异的肠道黏膜免疫状态，刺激差异的抗肿瘤免疫监视相关。
[0163]
实施例2使用活性和非活性全细胞rx-af01联合联合免疫检查点抑制剂治疗肺癌
[0164]
一、实验方法
[0165]
1、实验材料
[0166]
(1)小鼠品系：6周龄的雌性c57bl/6j小鼠
[0167]
(2)肿瘤细胞株：鼠肺癌细胞系(llc，atcc)
[0168]
(3)rx-af01菌株信息：芬氏别样杆菌(alistipes finegoldii，dsm no.:17242,type strain，其16s rdna序列如seq id no：1所示)，商购自dsmz德国国家培养物保藏中心，(dsmz的官方网址：http://www.dsmz.de)。
[0169]
(4)rx-af01的培养基成分：液体dsmz104培养基，配方主要包括含蛋白胨，酵母提取物，牛肉提取物和葡萄糖等，商购自dsmz德国国家培养物保藏中心。
1+rx-af01：**p《0.01；αpd-1+rx-af01_heat killed：****p《0.0001)的优于未治疗组(pbs)的肿瘤缩减；对比单药免疫检查点抑制剂组(αpd-1)，使用αpd-1联合活性rx-af01(αpd-1+rx-af01)或αpd-1联合非活性全细胞rx-af01(αpd-1+rx-af01_heat killed)组均显示出显著(αpd-1+rx-af01：*p《0.05；αpd-1+rx-af01_heat killed：****p《0.0001)的优于单药αpd-1的肿瘤治疗效果；对比αpd-1联合活性rx-af01(αpd-1+rx-af01)和αpd-1联合非活性全细胞rx-af01(αpd-1+rx-af01_heat killed)治疗效果显示，非活性全细胞rx-af01有优于活性rx-af01的疗效趋势，但未达到统计学差异(ns：p》0.05)。
[0188]
图9为使用活性rx-af01和非活性全细胞rx-af01治疗llc小鼠肺癌终末时间(第28天)肺癌肿瘤重量统计图。实验终点肿瘤重量显示，相对于未治疗组(pbs)，单药免疫检查点抑制剂组(αpd-1)未显示出显著(ns：p》0.05)的肿瘤缩减。αpd-1药物联合活性rx-af01未显示出显著(ns：p》0.05)优于单药αpd-1的效应，而αpd-1药物联合非活性全细胞rx-af01的治疗显著(**p《0.01)优于单药αpd-1的疗效。对比αpd-1联合活性rx-af01和αpd-1联合非活性全细胞rx-af01治疗效果显示，非活性全细胞rx-af01组的平均重量低于活性rx-af01组的平均重量。结果证明活性rx-af01和非活性全细胞rx-af01均可增强免疫检查点抑制剂的抗肿瘤效应。当单药αpd-1疗效差或耐药时，采用αpd-1施用的同时联合活性rx-af01或非活性全细胞rx-af01可逆转对单药αpd-1治疗耐药的肺癌，因此活性rx-af01和非活性全细胞rx-af01均具有治疗、减少、抑制或控制免疫检查点抑制剂难治性肿瘤的效力，且非活性全细胞rx-af01的抗肿瘤效应优于活性rx-af01的抗肿瘤效应。
[0189]
图10为使用活性rx-af01和非活性全细胞rx-af01治疗肺癌实验终点的肿瘤照片，在llc小鼠肺癌模型中，活性联合疗法组(αpd-1+rx-af01)和非活性全细胞联合疗法组(αpd-1+rx-af01_heat killed)两组分别出现1例肿瘤完全消失的小鼠。证明活性rx-af01和非活性全细胞rx-af01均可增强免疫检查点抑制剂的抗肿瘤效应。
[0190]
实施例3分析rx-af01在健康人肠道及其他身体部位的相对丰度
[0191]
一、实施方法和步骤
[0192]
(1)原始宏基因组数据来源：使用美国国立卫生研究院(national institutes of health，nih)的人体菌群计划项目公共数据资源的宏基因组学测序数据(human microbiome project,hmp，https://www.hmpdacc.org/)。
[0193]
(2)细菌的分类和菌株水平的鉴定分析软件：metaphlan2和strainphlan(https://github.com/biobakery/metaphlan2,https://github.com/biobakery/metaphlan)。联合metaphlan2和strainphlan可以对宏基因组数据进行菌株水平的鉴定分析。在使用两个软件时使用默认设置。
[0194]
(3)从(2)中得到菌株相对丰度(某一菌株与总微生物群体的比值)后，对rx-af01在身体不同部分的丰度进行可视化分析。
[0195]
二、实施结果
[0196]
图11为rx-af01在健康人肠道及其他身体部位的相对丰度。对2335个来源于健康人4个身体位点(其中553个肠道样本，1259个口腔样本，309个皮肤样本，234个阴道样本)样本进行分析显示，rx-af01主要存在于肠道样本，其在肠道中的阳性检出率为73.6％(407/553)。而在口腔，皮肤和阴道样本中，rx-af01的检出率分别为1.4％(18/1259)，1.9％(6/309)和1.7％(4/234)。在rx-af01阳性的407例肠道样本中rx-af01的相对丰度区间为
0.00006％～9.0％。据最新的肠道细菌数量估算数据(sender r,fuchs s,milo r.revised estimates for the number of human and bacteria cells in the body.plos biol.2016aug 19；14(8))，一名体重为70kg的健康成年男性的肠道中包含的全部细菌数量约为3.8*10
13
，rx-af01在hmp数据库健康人肠道的数量约为106～10
13
，因此rx-af01为人体固有共生肠道细菌，主要定植于肠道与人体交互作用，且rx-af01的相对丰度在部分人群中处于优势菌种(定义为占总肠道菌群数量的比例大于1％的菌种)的地位，证明本发明rx-af01及施用剂量105～10
12
的安全性。
[0197]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。