一种肝郁脾虚外感动物模型的建立及评价方法与流程

本发明属于微生物学和实验动物学领域，特别涉及一种肝郁脾虚外感动物模型的建立及评价方法。
背景技术：
：流行性感冒是流感病毒引起的一种传染性强、传播速度快的急性呼吸道传染疾病。流感病毒属正粘病毒科，分为甲、乙、丙三种类型，其中甲型流感病毒易发生变异，曾多次引起世界性大流行。流感病毒容易引起病毒性肺炎、细菌性肺炎、脱水等并发症。《伤寒论》中的少阳病，是邪犯少阳胆腑，枢机不利，经气不畅所表现的证候，主要表现为寒热往来，口苦，咽干，目眩，胸胁苦满，默默不欲饮食，心烦喜呕，苔薄白，脉弦。其中肝郁和脾虚是临床上表现的主要症状。柴胡桂枝汤是小柴胡汤和桂枝汤的合方，其原意是治疗太阳病，表邪不解，部分传入少阳所致之太阳少阳并病，方以小柴胡汤除半表半里之热邪，使得肝郁解、脾气调少阳枢机运转。同时以桂枝汤外合营卫、内调脾胃，治疗外证之不解。故柴胡桂枝汤和肝郁脾虚(少阳病)外感证属方证对应关系。随着科技的进步、社会的发展，中青年人面临越来越大的工作压力，经常思虑过度、饮食不规律，甚至熬夜，极易产生肝气郁结、脾胃虚弱症状，如精神抑郁、情绪低落、记忆力下降、失眠、没有胃口、消化不良等。在面临流感侵袭时，这种人群多容易外感，形成肝郁脾虚外感证。中青年是社会的中流砥柱，因流感会在很大程度上影响社会生产力。为了更好地解决这一问题，本课题首次建立了“肝郁脾虚外感”动物模型，并通过柴胡桂枝汤和连花清瘟胶囊分别从方证对应和反证角度对模型进行了评价。建立一个合理的中医动物模型对于研究中药是至关重要的。对于肝郁脾虚外感机理、药物应用等研究，一个稳定的、重现性好的动物模型进行临床前的动物实验是必要的。技术实现要素：本发明提供一种肝郁脾虚外感动物模型的建立及评价方法，建立一个建模时间短、操作次数少、建模致死率低的动物模型建立方法，为肝郁脾虚外感的彻底攻克奠定了基础。本发明是通过以下技术方案实现的：一种肝郁脾虚外感动物模型的建立方法，包括以下步骤：选取适当小鼠，腹腔注射利血平注射液连续10天，第11天开始每只小鼠滴鼻感染7μlh1n1病毒，并按0.08mg·kg-1·d-1腹腔注射利血平注射液，连续3d，从第14d开始按0.16mg·kg-1·d-1腹腔注射利血平注射液，连续4d。上述所述的建立方法，包括以下步骤：(1)60只雄性balb/c小鼠随机分为2组：正常组20只，模型组40只。模型组按0.32mg·kg-1·d-1腹腔注射利血平注射液，连续10d建立肝郁脾虚模型[4-6]；正常组腹腔注射同等剂量的0.2％乙酸溶液，连续10d；(2)第11d，肝郁脾虚模型组根据肛温、体重随机分为3组，每组10只；第1组为肝郁脾虚外感组，每只小鼠滴鼻感染7μlh1n1病毒，鸡红细胞血凝滴度为1:320，并按0.08mg·kg-1·d-1腹腔注射利血平注射液，连续3d，从第4d开始按0.16mg·kg-1·d-1腹腔注射利血平注射液，连续4d，共7d；第2组为连花清瘟组，除第1组的操作外，从第12d开始，分别给予成人等效剂量的连花清瘟胶囊0.546g·kg-1·d-1，连续6d；第3组为柴胡桂枝组，除第1组的操作外，从第12d开始，分别给予成人等效剂量的柴胡桂枝汤6.11g·kg-1·d-1，连续6d；正常组腹腔注射同等剂量的0.2％乙酸溶液并灌胃同等剂量的生理盐水，连续7d，同时每只小鼠滴鼻7μl生理盐水。上述所述的肝郁脾虚外感动物模型的评价方法，包括以下步骤：采用qpcr法检测小鼠肺组织流感病毒h1n1的m基因表达量，每个样本取10～20mg，首先将其处理成肺组织匀浆液，然后进行总rna提取及浓度测定，最后将总rna稀释成相同浓度，此为肺组织总rna提取环节；逆转录环节主要包括去基因组dna、rna逆转录成cdna两步；qpcr扩增环节以grcc10、ppia两个管家基因扩增的循环数平均值作为参比基因对h1n1的m基因扩增循环数进行相对定量；基因序列如seqidno.1-seqidno.6所示。评价方法，还包括将小鼠肛温、体重作为判断造模过程中的整体性生理状态指标，将小鼠悬尾不动时间、旷场活动总路程作为评价肝郁状态的整体行为学指标，将小鼠饮食量、饮水量作为评价脾虚状态的整体生理指标，将小鼠血清中淀粉酶、胃泌素含量作为评价脾虚状态的体内生化指标，并结合脏器指数。具体的包括以下步骤：(1)测定造模是否对小鼠一般体征的影响：正常组小鼠皮毛光滑、行动迅速，对外界刺激反应敏捷，大便色深、颗粒饱满、数量多；模型组小鼠皮毛不光滑，伴有眯眼、倦怠等症状，对外界刺激反应迟缓、挣扎时无力且时间短，大便颜色浅、质软甚至便溏，颗粒变小，数量变少；(2)测定造模是否对小鼠体重、肛温的影响：在造模的前4d，与正常组相比，模型组小鼠体重无明显变化；从造模第5d起，与正常组相比，模型组小鼠体重逐渐降低；到造模的第10d，与正常组相比，模型组小鼠体重显著性降低；(3)测定造模是否对小鼠饮食量、饮水量的影响：与正常组相比，模型组小鼠饮食量、饮水量显著降低，说明模型组在整体的生理指标上表现出了脾虚的状态；(4)测定造模是否对小鼠悬尾不动时间、旷场活动的影响：与正常组相比，模型组小鼠悬尾不动时间明显增加、旷场活动路程显著降低，说明模型组在整体的行为学指标上表现出肝郁状态；(5)测定造模是否对小鼠血清中淀粉酶、胃泌素的影响：与正常组相比，模型组小鼠血清中淀粉酶、胃泌素显著性降低，说明模型组在体内的生化指标上出现脾虚的表征；(6测定造模是否对小鼠脏器指数的影响：与正常组相比，模型组小鼠肝、脾、胸腺、肾上腺指数均明显降低，说明模型组在免疫功能方面呈低下状态；指标符合，说明动物模型构建成功。有益效果本实验采用利血平腹腔注射制备肝郁脾虚小鼠模型，为了更好地保证造模的重复性，本实验采用的造模药物为利血平标准品，并将其溶解于0.2％的乙酸制备成造模注射液。本实验所建立的肝郁脾虚模型属于中医病证结合动物模型，所选评价指标应符合中医的整体思维并结合现代医学中的相关技术。故本实验将小鼠肛温、体重作为判断造模过程中的整体性生理状态指标，将小鼠悬尾不动时间、旷场活动总路程作为评价肝郁状态的整体行为学指标，将小鼠饮食量、饮水量作为评价脾虚状态的整体生理指标，将小鼠血清中淀粉酶、胃泌素含量作为评价脾虚状态的体内生化指标，并结合脏器指数，对模型进行全面地评价。本课题所建立的肝郁脾虚小鼠模型不仅一般体征上出现临床上肝郁、脾虚的状态，并且体重、饮食量、饮水量，血清中淀粉酶、胃泌素含量均显著降低，悬尾不动时间、旷场活动总路程显著增加。肝、脾、胸腺、肾上腺作为重要的免疫器官，其指数也显著降低。通过全面评价，此模型符合中医少阳病的特点，可继续进行复合模型的建立。本实验借鉴病证结合的方法，通过腹腔注射利血平结合滴鼻感染甲型h1n1流感病毒建立肝郁脾虚外感小鼠模型，在造模时，利血平和流感病毒的用量均需要合理控制，过高或者过低均不能达到效果，只有有效的剂量才能达到造模的成功。评价该模型的整体性生理状态指标、脾虚状态指标和评价肝郁脾虚模型相应指标一致，除此之外，评价肝郁脾虚外感模型的病毒感染指标主要包括小鼠肺指数、肺组织流感病毒h1n1的m基因表达量和肺组织的病理学改变。通过综合评价，本实验所建立肝郁脾虚外感小鼠模型不仅在一般体征上表现出外感证有关的低迷状态，体重、肛温显著降低，而且肺指数显著性增高，并伴随明显的肺组织病理学改变；小鼠饮食量、饮水量和血清中淀粉酶、胃泌素含量都显著减低，肝、胸腺、肾上腺的脏器指数显著降低，基本符合此复合模型建立的要求。柴胡桂枝汤和连花清瘟胶囊对小鼠的外感症状均表现出不错的治疗效果，小鼠肺指数、肺组织病毒基因表达量显著降低；而在整体性生理状态指标和脾虚状态指标上，柴胡桂枝汤表现出良好的治疗效果，而连花清瘟胶囊作用不明显。柴胡桂枝汤能有效提高肝郁脾虚外感小鼠的体重、肛温，以及血清中淀粉酶、胃泌素含量，而连花清温胶囊则无明显改善，甚至略有降低。通过对比两种药物对肝郁脾虚外感小鼠的治疗效果，更加印证了柴胡桂枝汤和肝郁脾虚(少阳病)外感证的“方-证”对应关系，并从正面证明了此模型成立；而常用于治疗流行性感冒属热毒袭肺证阳性对照药--连花清瘟胶囊则从反面证明了此模型成立。本课题建立的肝郁脾虚外感小鼠模型，基本符合中医临床的要求，方法简便、重复性好，为进一步柴胡桂枝汤的药效及机制研究奠定了基础。附图说明图1为造模过程中小鼠的肛温变化；图2为造模过程中小鼠的体重变化；图3为肝郁脾虚外感造模过程中小鼠的肛温变化；图4为肝郁脾虚外感造模过程中小鼠的体重变化；图5为各组小鼠的肺组织切片(he染色，×200)a.正常组b.肝郁脾虚外感组c.连花清瘟组d.柴胡桂枝组；图6：对比例1造模过程中小鼠的肛温变化；图7：对比例1造模过程中小鼠的体重变化；图8：对比例1造模过程中小鼠的饮食量变化；图9：对比例2造模过程中小鼠的肛温变化；图10：对比例2造模过程中小鼠的体重变化；图11：对比例2造模过程中小鼠的饮食量变化；图12：对比例3造模过程中小鼠的肛温变化；图13对比例3造模过程中小鼠的体重变化；图14对比例3造模过程中小鼠的饮食量变化；图15对比例4肝郁脾虚造模过程中小鼠的肛温变化；图16对比例4肝郁脾虚造模过程中小鼠的体重变化；图17对比例4肝郁脾虚外感造模过程中小鼠的肛温变化；图18对比例4肝郁脾虚外感造模过程中小鼠的体重变化；图19对比例4肝郁脾虚外感造模过程中小鼠的死亡率曲线。具体实施方式下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例11实验材料1.1试剂及药物利血平(分析纯，sigma-alorich公司，批号：wxbc4865v)，冰醋酸(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司)，淀粉酶检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20181010)，胃泌素检测试剂盒(raybiotech公司，批号：1012187009)，rnapreppure动物组织总rna提取试剂盒、fastquantcdna第一链合成试剂盒、superrealpremixplus(sybrgreen)(北京天根生化科技有限公司，批号：r6716、r6308、r6620)，流感病毒甲型(influenzavirusa，北京地方株引自中国cdc研究所)，连花清瘟胶囊(石家庄以岭药业股份有限公司，批号：a170831)，柴胡桂枝汤复方中组成的药材被我校中药鉴定教研室李峰教授鉴定，均符合2015版药典标准。1.2实验动物balb/c小白鼠，雄性，60只，spf级，体重20±2g，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供(许可证编号scxk(鲁)20140007)。1.3实验仪器bat-12型小鼠肛温计(美国physitemp公司)、yp20001型电子天平(上海光正医疗器械有限公司)、esj220-4a型万分之一分析天平(沈阳龙腾电子有限公司)、dp80电子显微镜(日本奥林巴斯公司)、3k15型高速低温离心机(德国sigma公司)、悬尾实验和旷场实验动物行为学分析系统(上海欣软信息科技有限公司)、cfxconnecttm荧光定量pcr扩增仪(bio-rad公司)、thermomultiskanfc型酶标仪(赛默飞世尔上海有限公司)。2实验方法2.1实验动物分组、造模及给药60只雄性balb/c小鼠随机分为2组：正常组20只，模型组40只。模型组按0.32mg·kg-1·d-1腹腔注射利血平注射液，连续10d建立肝郁脾虚模型；正常组腹腔注射同等剂量的0.2％乙酸溶液，连续10d。并于肝郁脾虚造模结束后解剖正常组、模型组小鼠各10只，用于测定相关指标(见2.2)。第11d，肝郁脾虚模型组根据肛温、体重随机分为3组，每组10只；第1组为肝郁脾虚外感组，每只小鼠滴鼻感染7μlh1n1病毒(鸡红细胞血凝滴度为1:320)，并按0.08mg·kg-1·d-1腹腔注射利血平注射液，连续3d，从第4d开始按0.16mg·kg-1·d-1腹腔注射利血平注射液，连续4d，共7d；第2组为连花清瘟组，除第1组的操作外，从第12d开始，分别给予成人等效剂量的连花清瘟胶囊(0.546g·kg-1·d-1)，连续6d；第3组为柴胡桂枝组，除第1组的操作外，从第12d开始，分别给予成人等效剂量的柴胡桂枝汤(6.11g·kg-1·d-1)，连续6d；正常组腹腔注射同等剂量的0.2％乙酸溶液并灌胃同等剂量的生理盐水，连续7d，同时每只小鼠滴鼻7μl生理盐水。2.2检测指标每天观察记录小鼠的一般体征，肛温、体重，饮食量、饮水量，于造模的第9、10d分别测量各组小鼠的悬尾不动时间、旷场活动情况(每组10只，悬尾实验时间为4min，旷场活动时间为15min)，并于肝郁脾虚造模结束后解剖正常组、模型组小鼠各10只，眼球取血，离心取上清，用于测定淀粉酶(比色法)和胃泌素(elisa法)；并测定相关脏器指数--胸腺、肾上腺、肝脏、脾脏。于造模第11d起开始观察各组小鼠的死亡率，实验完成后解剖小鼠，取出肺组织、胸腺、肾上腺、肝脏、脾脏，测定相关脏器指数；眼球取血，4000r/min离心10min，取上清，血清置于-20℃保存，用于测定胃泌素和淀粉酶。肺组织取出后一半存放在福尔马林溶液中，以备做组织切片；一半置于rnastore溶液中，用于测定小鼠肺组织流感病毒h1n1的m基因表达量(提取肺组织总rna时将肺组织取出，每个样本取10～20mg，用于做肺组织匀浆液)。本实验采用qpcr法检测小鼠肺组织流感病毒h1n1的m基因表达量，每个样本取10～20mg，按照试剂盒相关操作说明首先将其处理成肺组织匀浆液，然后进行总rna提取及浓度测定，最后将总rna稀释成相同浓度，此为肺组织总rna提取环节；逆转录环节主要包括去基因组dna、rna逆转录成cdna两步；qpcr扩增环节以grcc10、ppia两个管家基因扩增的循环数平均值作为参比基因对h1n1的m基因扩增循环数进行相对定量。具体的引物序列信息见表1。表1h1n1的m基因、管家基因grcc10、ppia的引物序列2.3柴胡桂枝汤提取物的制备柴胡桂枝汤经方出自东汉张仲景的《伤寒论》，复方组成：桂枝4.5g，黄芩4.5g，党参4.5g，甘草3g，半夏(法半夏)5g，白芍4.5g，大枣6枚(擎)4.5g，干姜4.5g，柴胡12g。提取方法：桂枝4.5g，黄芩4.5g，党参4.5g，甘草3g，半夏(法半夏)5g，白芍4.5g，大枣6枚(擎)4.5g，干姜4.5g，柴胡12g(共47g)，加入10倍量的水，浸泡30min，煎煮40min过滤，同法共煎煮3次，合并滤液，得柴胡桂枝汤提取液，冷冻干燥，得冻干粉，根据实验需要稀释至所需浓度。2.4统计分析实验数据用spss17.0软件统计分析，计量数据均以表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析(one-wayanova)lsd检验，p<0.05表示差异有统计学意义。用graphpadprism7.0软件作图，数据均以表示。3实验结果3.1复制肝郁脾虚模型3.1.1造模对小鼠一般体征的影响正常组小鼠皮毛光滑、行动迅速，对外界刺激反应敏捷，大便色深、颗粒饱满、数量多。模型组小鼠皮毛不光滑，伴有眯眼、倦怠等症状，对外界刺激反应迟缓、挣扎时无力且时间短，大便颜色浅、质软甚至便溏，颗粒变小，数量变少。3.1.2造模对小鼠体重、肛温的影响在造模的前4d，与正常组相比，模型组小鼠体重无明显变化；从造模第5d起，与正常组相比，模型组小鼠体重逐渐降低；到造模的第10d，与正常组相比，模型组小鼠体重显著性降低(p<0.05)，见表2、图2。与正常组相比，在造模过程中模型组小鼠肛温无显著性变化，见表2、图1。表2造模第10d小鼠体重、肛温的检测组别n体重(g)肛温(℃)正常组2020.99±0.9135.52±0.53模型组4017.84±0.88**35.34±0.04注：与正常组比较，p*<0.05，p**<0.01。3.1.3造模对小鼠饮食量、饮水量的影响与正常组相比，模型组小鼠饮食量、饮水量显著降低(p<0.05、p<0.01)，说明模型组在整体的生理指标上表现出了脾虚的状态。见表3。表3小鼠饮食量、饮水量的检测组别n饮食量(g)饮水量(ml)正常组2034.27±2.2435.70±2.06模型组4020.94±9.14*20.83±8.35**注：与正常组比较，p*<0.05，p**<0.01。3.1.4造模对小鼠悬尾不动时间、旷场活动的影响与正常组相比，模型组小鼠悬尾不动时间明显增加(p<0.01)、旷场活动路程显著降低(p<0.01)，说明模型组在整体的行为学指标上表现出肝郁状态。见表4。表4小鼠悬尾不动时间、旷场活动的检测(n＝10)注：与正常组比较，p*<0.05，p**<0.01。3.1.5造模对小鼠血清中淀粉酶、胃泌素的影响与正常组相比，模型组小鼠血清中淀粉酶、胃泌素显著性降低(p<0.01)，说明模型组在体内的生化指标上出现脾虚的表征。见表5。表5小鼠血清中淀粉酶、胃泌素含量的检测(n＝10)注：与正常组比较，p*<0.05，p**<0.01。3.1.6造模对小鼠脏器指数的影响与正常组相比，模型组小鼠肝、脾、胸腺、肾上腺指数均明显降低(p<0.05、p<0.01)，说明模型组在免疫功能方面呈低下状态。见表6。表6小鼠肝、脾、胸腺、肾上腺指数的检测(n＝10)注：与正常组比较，p*<0.05，p**<0.01。3.2肝郁脾虚外感小鼠模型建立及评价3.2.1小鼠的一般体征观察正常组小鼠皮毛光滑、行动敏捷，对外界刺激反应灵敏，大便色暗、颗粒饱满、量多。肝郁脾虚外感组小鼠毛发松散、呼吸短促、扎堆聚集，能听到肺泡水声，偶尔可见小鼠打喷嚏。与肝郁脾虚外感组相比，连花清瘟组小鼠状态不见明显好转，反而略显低迷；柴胡桂枝组小鼠症状得到一定改善，从扎堆状态逐渐开始活动，肺泡水声明显降低。3.2.2柴胡桂枝汤对肝郁脾虚外感小鼠肛温、体重的影响正常组小鼠的肛温在7d内略有波动，但无明显变化。肝郁脾虚外感组小鼠的肛温在前5d无显著变化，从第6d开始降低；在第7d，与正常组相比，肝郁脾虚外感组小鼠的肛温显著降低(p<0.01)。连花清瘟组小鼠肛温的变化和肝郁脾虚外感组的变化一致。柴胡桂枝组的肛温在这7d内无明显变化。肝郁脾虚外感造模过程中小鼠的肛温变化见图3、表7。正常组小鼠的体重略有波动，但无明显变化。肝郁脾虚外感组和连花清瘟组小鼠的体重在前3d缓慢升高，在后4d逐渐降低，在第7d，与正常组相比，此两组小鼠的体重显著降低(p<0.01)。柴胡桂枝组小鼠的体重一直上升，并在第7d显著高于模型组(p<0.01)。肝郁脾虚外感造模过程中小鼠的体重变化见图4、表7。表7肝郁脾虚外感造模第7d各组小鼠的体重、肛温检测(n＝10)注：与正常组比较，p*<0.05，p**<0.01；与肝郁脾虚外感组比较，p#<0.05，p##<0.01。3.2.3柴胡桂枝汤对肝郁脾虚外感小鼠饮食量、饮水量的影响与正常组相比，肝郁脾虚外感组小鼠的饮食量、饮水量均显著降低(p<0.01)。与肝郁脾虚外感组相比，柴胡桂枝组小鼠饮食量、饮水量均有显著地提高(p<0.05)，而连花清瘟组略有降低，说明柴胡桂枝汤能有效提高肝郁脾虚外感小鼠的消化功能，从而对其起到一定的治疗作用，而连花清瘟胶囊对其基本无疗效。见表8。表8肝郁脾虚外感造模各组小鼠的饮食量、饮水量检测(n＝10)注：与正常组比较，p*<0.05，p**<0.01；与肝郁脾虚外感组比较，p#<0.05，p##<0.01。3.2.4柴胡桂枝汤对肝郁脾虚外感小鼠脏器指数的影响与正常组相比，肝郁脾虚外感组小鼠的肝、胸腺、肾上腺指数均显著降低(p<0.01)。与肝郁脾虚外感组相比，柴胡桂枝组小鼠的肝、胸腺、肾上腺指数均有显著提升(p<0.01)，而连花清瘟组无明显改善，说明柴胡桂枝汤能有效改善肝郁脾虚外感小鼠的免疫功能，而连花清瘟胶囊无改善作用。与正常组相比，肝郁脾虚外感组小鼠的肺指数明显升高(p<0.01)。与肝郁脾虚外感组相比，柴胡桂枝组和连花清瘟组小鼠的肺指数均显著降低(p<0.01)，说明柴胡桂枝汤和连花清瘟胶囊均能有效改善因病毒感染造成的肺组织炎性浸润。见表9。表9肝郁脾虚外感造模各组小鼠的脏器指数结果检测(n＝10)注：与正常组比较，p*<0.05，p**<0.01；与肝郁脾虚外感组比较，p#<0.05，p##<0.01。3.2.5柴胡桂枝汤对肝郁脾虚外感小鼠血清淀粉酶、胃泌素含量的影响与正常组相比，肝郁脾虚外感组小鼠血清中淀粉酶、胃泌素含量均显著降低(p<0.01)。与肝郁脾虚外感组相比，柴胡桂枝组小鼠血清中淀粉酶、胃泌素含量均有显著地提高(p<0.05、p<0.01)，而连花清瘟组略有降低，说明柴胡桂枝汤能有效改善肝郁脾虚外感小鼠的脾虚状况，而连花清瘟胶囊无明显疗效。见表10。表10肝郁脾虚外感造模各组小鼠血清中淀粉酶、胃泌素含量的结果检测(n＝10)注：与正常组比较，p*<0.05，p**<0.01；与肝郁脾虚外感组比较，p#<0.05，p##<0.01。3.2.6柴胡桂枝汤对肝郁脾虚外感小鼠肺组织流感病毒h1n1的m基因表达的影响肝郁脾虚外感组小鼠肺组织有较高的流感病毒h1n1的m基因表达，与肝郁脾虚外感组相比，柴胡桂枝组和连花清瘟组小鼠肺组织病毒基因表达量均显著降低(p<0.01)，说明柴胡桂枝汤和连花清瘟胶囊都能有效改善肝郁脾虚外感小鼠的病毒感染症状。见表11。表11肝郁脾虚外感造模各组小鼠肺组织流感病毒h1n1的m基因表达量结果检测(n＝10)注：与正常组比较，p*<0.05，p**<0.01；与肝郁脾虚外感组比较，p#<0.05，p##<0.01。3.2.7柴胡桂枝汤对肝郁脾虚外感小鼠肺组织病理切片的影响正常组小鼠肺组织肺间质未出现炎症，肺泡大小正常，支气管上皮较完整无渗出物，毛细血管无出血，仅在小支气管周围有少量淋巴细胞。肝郁脾虚外感组小鼠出现较明显的病毒性肺炎症状，肺泡大小不一且间隔增宽，肺内毛细血管出现扩张、淤血，可见大量的淋巴细胞和单核细胞浸润。与肝郁脾虚外感组相比，柴胡桂枝组和连花清瘟组小鼠肺组织的炎症有不同程度的缓解，肺内毛细血管出血减少，炎性细胞也相应减少。从小鼠肺组织病理切片来看，柴胡桂枝汤和连花清瘟胶囊均对病毒性肺炎有一定疗效。见图5。对比例11实验材料1.1实验试剂利血平(分析纯，sigma公司，用1％乙酸溶液溶解，现配先用)、0.9％生理盐水、糖、elisa试剂盒(胃泌素等)等。1.2实验动物balb/c雄性小白鼠，spf级,40只，体重20±2g。1.3实验仪器高速低温离心机、千分之一电子天平等。2实验方法2.1实验分组balb/c雄性小白鼠40只，按体重随机分为三组：利血平高剂量组(10只)，利血平低剂量组(10只)，利血平中剂量组(10只)，正常组(10只)。2.2造模方法利血平低剂量组按0.16mg·kg-1·d-1腹腔注射利血平注射液，连续10天；利血平中剂量组按0.64mg·kg-1·d-1腹腔注射利血平注射液，连续10天；利血平高剂量组按1.28mg·kg-1·d-1腹腔注射利血平注射液，连续10天；正常组腹腔注射同等剂量的生理盐水，连续10天。2.3检测指标造模过程中每天观察记录小鼠的一般体征，体重、饮食量，肛温、体重，分别于造模的第十天测量各组小鼠(每组4只)的糖水偏爱度(选取0.8％蔗糖水，具体方法如下：造模前5天，小鼠自由饮水；第6天，2瓶均装0.8％蔗糖水100ml；第8天，l瓶0.8％蔗糖水和l瓶纯净水，各100ml；第10天，1瓶0.8％蔗糖水和1瓶纯净水，各100ml，并测量糖水以及纯净水消耗量。糖水偏好系数＝糖水消耗量/(糖水+纯净水消耗量)×100％。通过测定第10天消耗的糖水以及纯净水的量计算小鼠的糖水偏好系数，从而比较正常组与模型组之间的差异。)，于造模的最后第二天测量各组小鼠的强迫游泳不动时间(选取直径30cm、高50cm(60l)的塑料桶作为实验材料，实验中水温保持在22℃左右，水深不得低于15cm，以免小鼠脚趾接触桶底。实验前一天每只小鼠预游5min，24h后测定5min内小鼠强迫游泳不动时间)(每组6只)。造模完成后24h内禁食不禁水，于造模完成后第二天解剖小鼠(解剖前每组小鼠3％d-木糖灌胃，一小时后取血清)，取出胸腺、肾上腺、肝脏和脾脏，测定相关脏器指数并做肝和脾的组织切片，眼球取血，离心取上清，血清置于-20摄氏度保存，采用elisa法测定相应生化指标(5-羟色胺、去甲肾上腺素(hplc)--肝郁、d-木糖、胃泌素--脾虚)。2.4pls建模分析最佳造模方法利用pls统计学软件对两种造模方法进行筛选，最后确定最佳造模方法。3统计学方法单因素方差分析：实验数据用spss17.0软件统计分析，计量数据均以表示，组间比较采用单因素方差分析(one-wayanova)lsd检验，p<0.05为有统计学意义。±sd表示，组间比较采用单因素方差分析(one-wayanova)lsd检验，p<0.05为有统计学意义。二、实验结果1造模过程中小鼠的肛温、体重变化图为6造模过程中小鼠的肛温变化和图7造模过程中小鼠的体重变化。注射利血平中剂量的小鼠在第9天全部死亡，注射高剂量利血平的小鼠在第6天全部死亡。2小鼠的各项生理指标变化2.1造模过程中小鼠的饮食量变化图8为造模过程中小鼠的饮食量变化。2.2造模过程中小鼠相关指标结果检测表12造模过程中小鼠相关指标结果检测注：与正常组比较p*<0.05，p**<0.01。对比例21实验材料1.1实验试剂利血平(分析纯，sigma公司，用0.375％乙酸溶液溶解)、五羟色胺和去甲肾上腺素标准品、糖、d-木糖检测试剂盒(比色法)、elisa试剂盒(胃泌素)等。1.2实验动物balb/c雄性小白鼠，spf级,33只，体重20±2g。1.3实验仪器高速低温离心机、千分之一电子天平等。2实验方法2.1实验分组balb/c雄性小白鼠33只，按体重随机分为三组：利血平高剂量组(10只)，利血平低剂量组(10只)，正常组(13只)。2.2造模方法利血平低剂量组按0.16mg·kg-1·d-1腹腔注射利血平注射液，连续10天；利血平高剂量组按0.64mg·kg-1·d-1腹腔注射利血平注射液，连续10天；正常组腹腔注射同等剂量的0.375％乙酸溶液，连续10天。2.3检测指标造模过程中每天观察记录小鼠的一般体征，体重、饮食量，肛温、体重，分别于造模的第十天测量各组小鼠(每组4只)的糖水偏爱度(选取0.8％蔗糖水，具体方法如下：造模前5天，小鼠自由饮水；第6天，2瓶均装0.8％蔗糖水50ml；第8天，l瓶0.8％蔗糖水和l瓶纯净水，各50ml；第10天，1瓶0.8％蔗糖水和1瓶纯净水，各50ml，并测量糖水以及纯净水消耗量。糖水偏好系数＝糖水消耗量/(糖水+纯净水消耗量)×100％。通过测定第10天消耗的糖水以及纯净水的量计算小鼠的糖水偏好系数，从而比较正常组与模型组之间的差异。)，于造模的最后第二天测量各组小鼠的强迫游泳不动时间(选取直径30cm、高50cm(60l)的塑料桶作为实验材料，实验中水温保持在22℃左右，水深不得低于15cm，以免小鼠脚趾接触桶底。实验前一天每只小鼠预游5min，24h后测定5min内小鼠强迫游泳不动时间)(每组6只)。造模完成后24h内禁食不禁水，于造模完成后第二天解剖小鼠(解剖前每组小鼠3％d-木糖灌胃--10mg·kg-1，一小时后取血清)，取出胸腺、肾上腺、肝脏和脾脏，测定相关脏器指数并做肝和脾的组织切片，眼球取血，离心取上清，血清置于-20摄氏度保存，采用elisa法测定相应生化指标(5-羟色胺、去甲肾上腺素(hplc)--肝郁、d-木糖、胃泌素--脾虚)。2.4pls建模分析最佳造模方法利用pls统计学软件对两种造模方法进行筛选，最后确定最佳造模方法。3统计学方法单因素方差分析：实验数据用spss17.0软件统计分析，计量数据均以表示，组间比较采用单因素方差分析(one-wayanova)lsd检验，p<0.05为有统计学意义。三、实验结果1造模过程中小鼠的肛温、体重变化图9为造模过程中小鼠的肛温变化，图10为造模过程中小鼠的体重变化。2小鼠的各项生理指标变化2.1造模过程中小鼠的饮食量变化图11为造模过程中小鼠的饮食量变化。注射利血平高剂量组的小鼠在造模过程饮食量变化较大，因此0.64mg·kg-1·d-1腹腔注射利血平注射液不适合小鼠造模。2.2造模过程中小鼠相关指标结果检测表13造模过程中小鼠相关指标结果检测注：与正常组比较p*<0.05，p**<0.01。对比例31实验材料1.1实验试剂利血平(分析纯，sigma公司，用0.2％乙酸溶液溶解)、五羟色胺和去甲肾上腺素标准品、糖、d-木糖检测试剂盒(比色法)、elisa试剂盒(胃泌素)等。1.2实验动物balb/c雄性小白鼠，spf级,33只，体重20±2g。1.3实验仪器高速低温离心机、千分之一电子天平等。2实验方法2.1实验分组balb/c雄性小白鼠33只，按体重随机分为三组：利血平高剂量组(10只)，利血平低剂量组(10只)，正常组(13只)。2.2造模方法利血平低剂量组按0.24mg·kg-1·d-1腹腔注射利血平注射液，连续10天；利血平高剂量组按0.32mg·kg-1·d-1腹腔注射利血平注射液，连续10天；正常组腹腔注射同等剂量的0.2％乙酸溶液，连续10天。2.3检测指标造模过程中每天观察记录小鼠的一般体征，体重、饮食量，肛温、体重，分别于造模的第十天测量各组小鼠(每组6只)的糖水偏爱度(选取0.8％蔗糖水，具体方法如下：造模前5天，小鼠自由饮水；第6天，2瓶均装0.8％蔗糖水10ml；第8天，l瓶0.8％蔗糖水和l瓶纯净水，各10ml；第10天，1瓶0.8％蔗糖水和1瓶纯净水，各10ml，并测量糖水以及纯净水消耗量。糖水偏好系数＝糖水消耗量/(糖水+纯净水消耗量)×100％。通过测定第10天消耗的糖水以及纯净水的量计算小鼠的糖水偏好系数，从而比较正常组与模型组之间的差异。)，于造模的最后第二天测量各组小鼠的悬尾不动时间(每组6只)。造模完成后24h内禁食不禁水，于造模完成后第二天解剖小鼠(解剖前每组小鼠3％d-木糖灌胃--10mg·kg-1，一小时后取血清)，取出胸腺、肾上腺、肝脏和脾脏，测定相关脏器指数并做肝和脾的组织切片，眼球取血，离心取上清，血清置于-20摄氏度保存，用于测定d-木糖、胃泌素(5-羟色胺、去甲肾上腺素(hplc)--肝郁、d-木糖、胃泌素--脾虚)。全脑取出后-80摄氏度保存，用于测定相关神经递质--5-ht、ne。2.4pls建模分析最佳造模方法利用pls统计学软件对两种造模方法进行筛选，最后确定最佳造模方法。3统计学方法单因素方差分析：实验数据用spss17.0软件统计分析，计量数据均以表示，组间比较采用单因素方差分析(one-wayanova)lsd检验，p<0.05为有统计学意义。二、实验结果1造模过程中小鼠的肛温、体重变化图12为造模过程中小鼠的肛温变化，图13为造模过程中小鼠的体重变化。2小鼠的各项生理指标变化2.1造模过程中小鼠的饮食量变化图14造模过程中小鼠的饮食量变化。2.2造模过程中小鼠相关指标结果检测表14造模过程中小鼠生理指标结果检测注：与正常组比较p*<0.05，p**<0.01。表15造模过程中小鼠生化指标结果检测注：与正常组比较p*<0.05，p**<0.01。对比例41实验材料1.1实验试剂利血平(标准品，分析纯，用0.2％乙酸溶液配置，现配现用)，d-木糖、胃泌素elisa试剂盒，蔗糖，五羟色胺、去甲肾上腺素标准品，总rna提取试剂盒，h1n1病毒。1.2实验仪器悬尾实验装置、代谢笼、高效液相色谱仪、pcr扩增仪。1.3实验动物53只雄性balb/c小鼠，spf级，18-20g。3实验方法2.1实验动物分组及造模53只雄性balb/c小鼠随机分为2组：正常组13只，模型组40只。模型组按0.2mg·kg-1·d-1腹腔注射利血平注射液建立肝郁脾虚模型，连续10天；正常组腹腔注射同等剂量的0.2％乙酸溶液，连续10天。从第11天起，肝郁脾虚模型组根据肛温、体重随机分为4组：第1组按0.16mg·kg-1·d-1腹腔注射利血平注射液，同时每只小鼠滴鼻感染15微升h1n1病毒；第2组按0.16mg·kg-1·d-1腹腔注射利血平注射液，同时每只小鼠滴鼻感染20微升h1n1病毒；第3组按0.24mg·kg-1·d-1腹腔注射利血平注射液，同时每只小鼠滴鼻感染15微升h1n1病毒；第4组按0.24mg·kg-1·d-1腹腔注射利血平注射液，同时每只小鼠滴鼻感染20微升h1n1病毒。连续7天建立肝郁脾虚外感模型。正常组腹腔注射同等剂量的0.2％乙酸溶液，连续7天。2检测指标造模过程中每天观察记录小鼠的一般体征，体重、饮食量，肛温、体重，分别于造模的第十天测量各组小鼠(每组10只)的糖水偏爱度(选取0.8％蔗糖水，具体方法如下：造模前5天，小鼠自由饮水；第6天，2瓶均装0.8％蔗糖水10ml；第8天，l瓶0.8％蔗糖水和l瓶纯净水，各10ml；第10天，1瓶0.8％蔗糖水和1瓶纯净水，各10ml，并测量糖水以及纯净水消耗量。糖水偏好系数＝糖水消耗量/(糖水+纯净水消耗量)×100％。通过测定第10天消耗的糖水以及纯净水的量计算小鼠的糖水偏好系数，从而比较正常组与模型组之间的差异。)，于造模的最后第二天测量各组小鼠的悬尾不动时间(每组10只)。于造模第11天起开始观察小鼠的死亡率，于第17天测量各组小鼠的悬尾不动时间(每组6只)。造模完成后24h内禁食不禁水，于造模完成后第二天解剖小鼠(解剖前每组小鼠3％d-木糖灌胃--10mg·kg-1，一小时后取血清)，取出胸腺、肺组织、肾上腺、肝脏、脾脏和全脑，测定相关脏器指数并做肺的组织切片；眼球取血，离心取上清，血清置于-80摄氏度保存，用于测定d-木糖和胃泌素。肺组织取出后-80摄氏度保存，用于测定小鼠h1n1病毒载量和tnf-α、ifn-γ。全脑取出后-80摄氏度保存，用于测定相关神经递质--5-ht、ne。2.3pls建模分析最佳造模方法利用pls统计学软件对四种造模方法进行筛选，最后确定最佳造模方法。3统计学方法单因素方差分析：实验数据用spss17.0软件统计分析，计量数据均以表示，组间比较采用单因素方差分析(one-wayanova)lsd检验，p<0.05为有统计学意义。二、实验结果1肝郁脾虚造模过程中小鼠的肛温、体重变化图15为肝郁脾虚造模过程中小鼠的肛温变化，图16为肝郁脾虚造模过程中小鼠的体重变化2肝郁脾虚外感造模过程中小鼠的肛温、体重、死亡率变化图17为肝郁脾虚外感造模过程中小鼠的肛温变化，图18为肝郁脾虚外感造模过程中小鼠的体重变化，图19肝郁脾虚外感造模过程中小鼠的死亡率曲线。3小鼠的各项生理指标变化表16肝郁脾虚造模过程中小鼠生理指标结果检测注：与正常组比较p*<0.05，p**<0.01。建立肝郁脾虚外感复合病证小鼠模型，并通过柴胡桂枝汤和连花清瘟胶囊进行正治和反证。方法：腹腔注射利血平(0.32mg·kg-1)10d建立肝郁脾虚小鼠模型，在此基础上滴鼻感染甲型h1n1流感病毒建立肝郁脾虚外感小鼠模型；在接种流感病毒后，分3个组，分别为肝郁脾虚外感组、连花清瘟组、柴胡桂枝组；连花清瘟组和柴胡桂枝组分别灌胃成人等效剂量的连花清瘟胶囊(0.546g·kg-1)和柴胡桂枝汤(6.11g·kg-1)，连续6d。每天观察记录小鼠的一般体征，肛温、体重，饮食量、饮水量，测定小鼠的悬尾时间、旷场活动情况；测定小鼠的肝、脾、胸腺、肾上腺、肺指数；测定小鼠血清中淀粉酶(比色法)和胃泌素(elisa法)含量；qpcr法测定小鼠肺组织中流感病毒h1n1的m基因表达量，并观察小鼠肺组织的病理变化。结果：与正常组相比，肝郁脾虚模型组小鼠肛温无明显变化，体重、饮食量、饮水量均显著降低(p<0.05、p<0.01)，悬尾时间显著增加、旷场活动总路程显著减少(p<0.01)；肝郁脾虚模型小鼠的肝、脾、胸腺、肾上腺指数均显著降低(p<0.05、p<0.01)；肝郁脾虚模型小鼠血清中淀粉酶和胃泌素含量均显著降低(p<0.01)。与正常组相比，肝郁脾虚外感组小鼠肛温、体重、饮食量、饮水量均显著降低(p<0.01)，肝、胸腺、肾上腺指数显著降低(p<0.01)，肺指数显著升高(p<0.01)，血清中淀粉酶和胃泌素含量均显著降低(p<0.01)，肺组织有较高的流感病毒h1n1的m基因表达并伴有明显的病毒性肺炎症状；与肝郁脾虚外感组相比，柴胡桂枝组小鼠肛温、体重、饮食量、饮水量均显著升高(p<0.05、p<0.01)，肝、胸腺、肾上腺指数显著升高(p<0.01)，肺指数显著降低(p<0.01)，血清中淀粉酶和胃泌素含量均显著升高(p<0.05、p<0.01)，肺组织病毒基因表达量明显降低(p<0.01)，病毒性肺炎症状明显缓解；与肝郁脾虚外感组相比，连花清瘟组小鼠肛温无明显变化，体重、饮食量、饮水量均略有降低，肝、胸腺、肾上腺指数略有降低，血清中淀粉酶和胃泌素含量均有降低的趋势，肺指数显著降低(p<0.01)，肺组织病毒基因表达量明显降低(p<0.01)，病毒性肺炎症状得到一定缓解。结论：腹腔注射利血平结合滴鼻感染甲型h1n1流感病毒建立肝郁脾虚外感小鼠模型，此模型在一定程度上符合中医肝郁脾虚(少阳病)外感证的特点，柴胡桂枝汤和连花清瘟胶囊分别从正治和反证角度证实此模型成立，为之后的相关药效和机制研究奠定基础。显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。当前第1页12