干酪乳杆菌Zhang在改善急性肾损伤，防治肾间质纤维化中的应用的制作方法

本发明属于医药领域，涉及干酪乳杆菌zhang(l.caseizhang)的新用途，尤其是在改善急性肾损伤，防治肾间质纤维化中的新用途。
背景技术：
：近年来，越来越多的研究证实在慢性肾脏病(ckd)患者中存在肠道菌群失调，给予益生菌，可以改善肠道菌群紊乱，减少尿毒症毒素的产生而对ckd患者有益，然而，目前有关益生菌对急、慢性肾损伤影响的临床和基础研究较少，益生菌改善肾功能的具体机制尚未阐明，益生菌是否能改善肾损伤、延缓ckd进展也仍存在争议。由于许多益生菌对生理功能的调节具有菌株特异性，因此根据它们的功能特性选择适当的菌种干预是至关重要的。l.caseizhang是我国第一个完成宏基因组测序自主研发的一种干酪乳杆菌。张和平教授团队通过大量研究已证实l.caseizhang具有抗炎、调脂、改善胰岛素抵抗、拮抗肠道致病菌、降低肠道毒素、预防2型糖尿病和结肠癌等作用，目前该菌已应用于临床，但尚未见该菌在防治肾脏疾病中的相关报导。技术实现要素：本发明的目的是提供干酪乳杆菌zhang(l.caseizhang)在改善急性肾损伤，防治肾间质纤维化中的新用途，旨在提供一种安全有效的防治措施，更好地满足慢性肾脏疾病临床用药的需求。本发明解决上述技术问题的技术方案如下：通过构建小鼠双侧肾脏缺血再灌注(i/r)肾损伤模型，观察了干酪乳杆菌zhang对模型小鼠肾功能、tecs损伤、巨噬细胞浸润、炎症因子表达、肠道屏障损伤以及肾重/体重比和慢性肾间质胶原纤维沉积的影响，结果发现：l.caseizhang能明显改善肾功能，减轻tecs损伤，减少肾脏炎症因子分泌和巨噬细胞浸润，减少肠道损伤及炎症反应，有效改善肠道通透性。将观察周期延长至28天，结果发现治疗组的肾重/体重明显高于模型组，治疗组还能明显减少i/r晚期的胶原沉积，减少纤维化相关因子α-sma和col-i的表达。以上结果验证了l.caseizhang可以显著减轻i/r诱导的急性肾损伤及其继发的慢性肾间质纤维化，为治疗肾损伤的临床应用提供了依据。附图说明图1为结肠组织he染色和occludin荧光染色观察到的结肠组织损伤情况。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行详细地说明。应当说明的是，所述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，实施例中所涉及的各种实验操作，均为本领域的常规技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等予以实施。实施例11.材料本实验采用spf级6-7周龄雄性c57bl/6小鼠(体重约18-20g)购自北京华阜康生物科技有限公司，饲养于华中科技大学同济医学院动物房spf级屏障环境中，小鼠无菌饲料及饮用水均由该动物房提供。适应性喂养l周后，将实验动物分别随机分成5组，每组10只，各组处理如下：①假手术组(sham组)：生理盐水灌胃；②模型组(i/r组)：生理盐水灌胃后造模；③普通干酪乳杆菌组(i/r+lact组)：造模前灌服普通干酪乳杆菌4周，造模后，继续灌服直至处死；④干酪乳杆菌l.caseizhang组(i/r+lac.z组)：提前给予4周l.caseizhang(1x109cfu/d)灌服后造模，继续灌服直至处死。小鼠饲养及操作流程均严格按照美国nih机构以及华中科技大学同济医学院动物管理委员会规定执行。所用生理盐水为临床医用生理盐水，普通乳杆菌购买于中国台湾亚芯生物科技有限公司，干酪乳杆菌l.caseizhang由科拓恒通、内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室张和平教授提供。2.方法2.1小鼠双侧肾脏缺血再灌注(i/r)模型构建1)小鼠称重后用1％戊巴比妥钠以10μl/g的浓度进行麻醉，剃除小鼠背部毛发，使其趴于温控仪的加热板上，四肢用胶带固定，温控仪探头插入小鼠肛门监测肛温，待体温基本稳定在36.8-37.2℃之间时可开始手术。2)用碘伏消毒小鼠背侧皮肤，将左右两侧背部皮肤纵向切开，先逐层暴露右侧肾脏，用玻璃分针制成的拉钩将肾脏挑出(动作需轻柔，注意勿损伤肝脏)，充分暴露右肾蒂，用无创微动脉夹夹闭右肾动脉，开始计时30min。3)迅速暴露左侧肾脏，同样用玻璃拉钩挑出左肾，充分暴露左肾蒂，用无创微动脉夹夹闭左肾动脉，开始计时30min。双侧肾脏夹闭时间间隔最好不超过1min。4)观察到双侧肾脏从粉红色变为紫黑色证明缺血成功，将双肾放回腹腔中。5)夹闭30min后，轻轻取下微动脉夹，肾脏很快从紫黑色恢复成粉红色证明再灌注成功，将肾脏复位，用注射器往腹腔补充约300-500μl37℃温生理盐水，以防小鼠术后脱水。6)逐层缝合小鼠肌肉和皮肤切口，整个手术过程小鼠体温需控制在36.6-37.4℃之间。7)用纱布将缝合好的小鼠包起来，放在恒温电热毯上复温，待其可以活动后放回笼中，笼子做好标记。注：假手术组(sham组：仅仅暴露出肾脏，但不夹闭肾动脉，其它同缺血再灌注手术组小鼠)。2.2粪便、肾脏、血清及结肠标本的收集1)术后第5d和第28d，先去动物房留取小鼠粪便组织，将小鼠背部皮肤及尾巴用手抓住，刺激小鼠排便，收集新鲜干净的小鼠粪便于无菌无酶的2.0mlep管中(收集约6-8颗)，封口胶封口后，置于冰盒中，2h内储存于-80℃冰箱中，勿反复冻融。2)将小鼠取回实验室，先记录小鼠体重，捏住小鼠背侧皮肤及尾巴，剪去双侧胡须，用弯镊摘取小鼠眼球，将血液收集于肝素抗凝管中，边取血边按压小鼠心脏，取血完毕，盖上抗凝管盖子，迅速上下颠倒使血液与抗凝剂充分接触，室温静置30min，3000rpm，离心10min，将血清分装至干净ep管中，封口，置于-80℃长期保存，避免反复冻融，用于检测代谢组学的血清标本需先在液氮中快速冷冻，再放入-80℃保存。3)取完血后将小鼠颈椎脱臼处死，仰卧位固定于泡沫板上，泡沫板置于搪瓷盘中，迅速剪开小鼠胸腹腔，将灌注针插入心尖搏动最明显处，暴露下腔静脉并剪断，用冰pbs缓冲液(约20ml/只)匀速缓慢的进行灌注，可见肝脏和肾脏逐渐变白，当下腔静脉流出清亮液体时即可结束灌注。4)依次摘取肾脏、脾脏、以及结肠组织，置于冰pbs中，剥离肾脏及脾脏的筋膜，用滤纸吸干多余水分后，称重并记录。5)将肾脏标本用刀片冠状面切成两半，一半放入4％的多聚甲醛组织固定液中固定24h，另一半肾脏的1/3留作pcr，2/3留作westernblot，将组织放入干净ep管中，长期保存于-80℃冰箱中。用于检测代谢组学的肾脏组织标本需先在液氮中快速冷冻，再放入-80℃保存。6)用冰pbs将结肠组织中粪便冲干净，再将组织置于冰pbs中摇洗3次，每次3min，切取小段固定部位结肠组织固定于4％多聚甲醛中。7)肾脏组织和结肠组织固定24h后，放入脱水机中脱水浸蜡，脱水完成后，将同一组小鼠组织包埋于一个蜡块中，肾脏、结肠分开包埋，做好标记。8)切片：用石蜡切片机将蜡块切成3-4μm的薄片，展开铺于载玻片上，吹干，做好标记放入切片盒中，常温保存。2.3检测指标及方法应用血生化试剂盒检测小鼠血清肌酐及尿素氮水平；高碘酸-无色品红(pas)染色观察肾脏组织损伤；ltl染色检测各组肾脏近端小管刷状缘情况；免疫荧光检测kim-1、f4/80的表达；实时荧光定量pcr(rt-pcr)检测肾组织中炎性因子(il-1β,il-6,tnf-α,il-10)表达变化；结肠组织he染色和occludin荧光染色观察结肠组织损伤情况；masson染色观察肾脏组织纤维化情况；免疫荧光检测α-sma、collagen-i的表达；westernblot检测肾组织α-sma蛋白表达。3.结果与分析1)l.caseizhang对小鼠血清肌酐及尿素氮的影响。造模5d后小鼠血清肌酐及尿素氮检测结果见表1，可以看出，l.caseizhang干预可以降低肾脏缺血再灌注小鼠模型的血清尿素及肌酐，说明能改善i/r诱导的急性肾损伤的肾功能。表1造模5d后的鼠血清肌酐及尿素氮水平分组血清尿素(mg/dl)血清肌酐(mg/dl)sham组67.8±3.990.51±0.13i/r组136.9±11.751.63±0.07i/r+lact组117.6±9.241.27±0.05i/r+lac.z组95.8±6.42*1.10±0.05*与i/r组比较，*p<0.05。2)l.caseizhang对tecs损伤的影响。从pas病理染色中可以观察到，i/r组小鼠的肾小管出现坏死，管型形成，小管扩张，水肿，刷状缘缺失等，表明受到严重损伤，i/r+lact组和i/r+lac.z组可不同程度降低肾小管损伤，肾小管损伤评分见表2；从ltl免疫荧光染色中观察到，i/r组小鼠的肾脏近端小管刷状缘数量减少，而i/r+lact组和i/r+lac.z组可不同程度增加肾脏近端小管刷状缘数量，结果见表3；免疫荧光检测还观察到i/r组的kim-1表达量增加，而i/r+lact组和i/r+lac.z组的kim-1表达量均出现不同程度的降低，结果见表4。以上结果表明l.caseizhang可明显减轻肾脏缺血再灌注导致的tecs损伤。表2不同处理组对肾小管损伤评分的影响分组肾小管损伤评分sham组——i/r组4.5±0.67i/r+lact组3.8±0.75i/r+lac.z组2.2±0.81*与i/r组比较，*p<0.05。表3不同处理组对肾脏近端小管刷状缘数量的影响分组肾脏近端小管刷状缘数量sham组96.9±8.0i/r组39.5±9.7i/r+lact组57.2±10.5i/r+lac.z组67.8±8.6*与i/r组比较，*p<0.05。表4不同处理组对kim-1表达量的影响分组kim-1表达量sham组——i/r组62.7±12.9i/r+lact组41.4±10.8i/r+lac.z组23.4±10.4*与i/r组比较，*p<0.05。3)l.caseizhang对巨噬细胞浸润的影响。f4/80免疫荧光染色检测巨噬细胞，i/r组小鼠的肾间质出现大量巨噬细胞浸润，i/r+lact组和i/r+lac.z组可不同程度减少肾间质巨噬细胞浸润，并且l.caseizhang作用明显优于普通干酪乳杆菌，结果见表5，说明l.caseizhang可明显减少肾脏缺血再灌注导致的巨噬细胞浸润。表5不同处理组巨噬细胞浸润的情况分组巨噬细胞浸润面积(％)sham组——i/r组6.4±1.6i/r+lact组4.2±1.2i/r+lac.z组2.5±0.6*与i/r组比较，*p<0.05。4)l.caseizhang对炎症因子表达的影响。实时荧光定量pcr(rt-pcr)检测肾组织中炎性因子(il-1β,il-6,tnf-α,il-10)表达变化，发现i/r+lact组和i/r+lac.z组可不同程度减少肾脏促炎因子il-1β、il-6、tnf-α的分泌，增加抑炎因子il-10的分泌，结果见表6，说明l.caseizhang可明显减少肾脏缺血再灌注损伤后的炎症因子。表6不同处理组对炎症因子表达的影响分组il-1βil-6tnf-αil-10sham组1.00±0.121.00±0.091.00±0.061.00±0.16i/r组11.26±0.4613.10±0.2223.86±0.272.38±0.41i/r+lact组6.39±0.214.19±0.1814.52±0.223.26±0.25i/r+lac.z组4.82±0.18*2.53±0.12*8.16±0.11*3.47±0.30*与i/r组比较，*p<0.05。5)l.caseizhang对肠道屏障损伤的影响。i/r可引起肠道炎症和损伤，主要表现为炎症反应和肠道紧密连接蛋白缺失，结肠组织he染色显示，益生菌干预可以明显减轻肠道炎症损伤，肠道紧密连接蛋白occludin的荧光染色显示益生菌组均明显增多，结果见图1，说明l.caseizhang明显改善肾脏缺血再灌注损伤后的肠道通透性。6)l.caseizhang对小鼠肾重/体重比的影响。i/r造模28d后，肾脏组织可出现明显萎缩而在益生菌干预组肾脏萎缩较i/r组明显改善，肾重体重比值明显升高，结果见表7，说明l.caseizhang可改善肾脏缺血再灌注损伤诱导的肾脏萎缩。表7不同处理组小鼠肾重/体重比的情况分组小鼠左肾重/体重比小鼠右肾重/体重比sham组0.0066±0.00050.0069±0.0006i/r组0.0044±0.00080.0049±0.0010i/r+lact组0.0051±0.00120.0053±0.0005i/r+lac.z组0.0060±0.0006*0.0061±0.0008*与i/r组比较，*p<0.05。7)l.caseizhang对慢性肾间质胶原纤维沉积的影响。i/r造模28d后，masson病理染色显示益生菌组肾间质胶原纤维沉积明显减少，l.caseizhang组较普通嗜酸乳杆菌组效果明显，结果见表8；同时，免疫荧光检测还观察到i/r组的α-sma及collagen-i表达量增加，而i/r+lact组和i/r+lac.z组的α-sma及collagen-i表达量均出现不同程度的降低，结果见表9；westernblot检测也证实益生菌组肾脏组织中α-sma的表达明显减少，结果见表10。以上结果表明l.caseizhang可明显减轻肾脏缺血再灌注损伤诱导的慢性肾间质胶原纤维沉积。表8不同处理组masson病理染色情况分组masson染色阳性面积(％)sham组——i/r组8.2±2.5i/r+lact组4.8±1.2i/r+lac.z组2.8±0.8*与i/r组比较，*p<0.05。表9不同处理组对α-sma及collagen-i表达量的影响与i/r组比较，*p<0.05。表10wb检测不同处理组中α-sma表达量的情况分组α-sma表达量sham组1±0.1i/r组6.1±0.6i/r+lact组3.8±0.3i/r+lac.z组2.7±0.2*与i/r组比较，*p<0.05。结论：通过pas病理染色及ltl、kim-1免疫荧光染色发现l.caseizhang能明显减轻tecs损伤；rt-pcr结果提示l.caseizhang治疗后肾脏炎症因子分泌减少；免疫荧光检测l.caseizhang治疗组巨噬细胞浸润明显减少；结肠he染色表明l.caseizhang治疗有效减少肾脏i/r后的肠道损伤及炎症反应；occludin荧光染色结果证实l.caseizhang可有效改善肾脏i/r后的肠道通透性。将观察周期延长至28天探讨l.caseizhang对肾损伤的长期效应，结果发现治疗组(普通干酪乳杆菌组和l.caseizhang组)的肾重/体重明显高于i/r组，利用masson病理染色发现治疗组(尤其是l.caseizhang组)明显减少i/r晚期的胶原沉积，免疫荧光结果显示纤维化相关因子α-sma和col-i在益生菌干预组均明显减少。wb也显示α-sma在益生菌干预组均明显减少。以上结果表明，相对于普通干酪乳杆菌，l.caseizhang可以显著减轻i/r诱导的急性肾损伤及其继发的慢性肾间质纤维化，为临床治疗肾损伤提供了依据。当前第1页12