本发明具体涉及一种三叶青藤叶配方颗粒及其制备工艺。
背景技术：
三叶青(tetrastigmahemsleyanumdielsetgilg.)葡萄科崖爬藤属，是我国特有的珍稀药用植物、民间常用药，以块根或全草入药；具有清热解毒、祛风化痰、活血止痛等功效。主要生长在荫密、较高海拔、腐殖质较高的山间谷、灌木丛或丛林间，近年来，因其良好的抗肿瘤作用，人工种植三叶青产业发展迅速。目前，有关三叶青地上部分即藤叶的基础研究相对较少。
课题组前期研究表明，三叶青藤叶含有黄酮类、酚类、油脂类、氨基酸、萜类、强心苷类及糖类等成分，其中黄酮类是三叶青藤叶的主要有效成分；由三叶青藤叶提取的总黄酮有效部位具有良好的抗炎解热镇痛作用，其药效物质基础已基本明确；三叶青藤叶抗炎镇痛有效部位总黄酮的主要成分包括荭草苷、异荭草苷、异荭草苷-2’-o-鼠李糖苷、绿原酸、新绿原酸等，并探究了三叶青抗炎镇痛提取物的体内过程。
三叶青藤叶的临床应用多为煎熬汤剂，辅助抗肿瘤治疗，但由于藤叶体积较大、贮存携带不便，服用前需临时煎煮，口服汤剂的顺应性较差，有效成分不易完全煎出等问题，故选择研制服用、携带、贮藏、运输方便，溶解迅速，免煎易服的三叶青藤叶配方颗粒，可替代饮片应用于临床。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题，在于提供一种三叶青藤叶配方颗粒的制备工艺。
本发明是这样实现的：一种三叶青藤叶配方颗粒的制备工艺，包括以下步骤：
(1)取三叶青藤叶饮片加8-12倍量水，浸泡1h，提取1-3次，每次1-2h，合并滤液，滤液浓缩至相对密度1.05，得三叶青藤叶水煎煮汤剂浓缩液；
(2)将三叶青藤叶水煎煮汤剂浓缩液，喷雾干燥，进风温度160℃-180℃，雾化压力0.30bar-1.05bar，泵数10％-14％，得中间体粉末；
(3)按照质量比中间体粉末:糊精＝3:1将中间体粉末和糊精混合，润湿剂乙醇浓度为70％-90％，过100目筛混匀，制成软硬适中的软材，过14目筛，60℃烘干2h，即得三叶青藤叶配方颗粒。
进一步地，所述(1)中，三叶青藤叶饮片加12倍量水，浸泡1h，提取三次，每次1.5h。
进一步地，所述(2)中，进风温度180℃，雾化压力1.05bar，泵数11％。
本发明的优点在于：三叶青藤叶中药配方颗粒，既能保持汤剂原有的疗效及特点，便于贮存，又能方便携带服用，溶解迅速。
【具体实施方式】
实施例1
三叶青藤叶配方颗粒的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：取三叶青藤叶饮片加12倍量水(m/v)，浸泡1h，提取三次，每次1.5h，合并滤液，滤液浓缩至相对密度1.05(60℃)得三叶青藤叶水煎煮汤剂浓缩液。
步骤2：取三叶青藤叶水煎煮汤剂浓缩液，喷雾干燥，进风温度180℃，雾化压力1.05bar，泵数11％，得中间体粉末。
步骤3：取中间体粉末与糊精(3:1)，润湿剂乙醇浓度为80％，过100目筛混匀，制成软硬适中的软材，过14目筛，60℃烘干2h，即得三叶青藤叶配方颗粒。
实施例2
本部分与实施例1不同之处在于：
步骤1：取三叶青藤叶饮片加8倍量水，浸泡1h，提取一次，每次1h，合并滤液，滤液浓缩至相对密度1.05(60℃)得三叶青藤叶水煎煮汤剂浓缩液。
实施例3
本部分与实施例1不同之处在于：
步骤1：取三叶青藤叶饮片加10倍量水，浸泡1h，提取两次，每次2h，合并滤液，滤液浓缩至相对密度1.05(60℃)得三叶青藤叶水煎煮汤剂浓缩液。
实施例4
本部分与实施例1不同之处在于：
步骤2：取三叶青藤叶水煎煮汤剂浓缩液，喷雾干燥，进风温度160℃，雾化压力0.30bar，泵数10％，得中间体粉末。
实施例5
本部分与实施例1不同之处在于：
步骤2：取三叶青藤叶水煎煮汤剂浓缩液，喷雾干燥，进风温度170℃，雾化压力0.55bar，泵数14％，得中间体粉末。
实施例6
本部分与实施例1不同之处在于：
步骤3：取中间体粉末与淀粉(3:1)，润湿剂乙醇浓度为70％，过100目筛混匀，制成软硬适中的软材，过14目筛，60℃烘干2h，即得三叶青藤叶配方颗粒。
实施例7
本部分与实施例1不同之处在于：
步骤3：取中间体粉末与乳糖(3:1)，润湿剂乙醇浓度为90％，过100目筛混匀，制成软硬适中的软材，过14目筛，60℃烘干2h，即得三叶青藤叶配方颗粒。
按上述实施例1-3的步骤，生产三批三叶青藤叶配方颗粒，具体实验结果见表1。
表1
三叶青藤叶配方颗粒与汤剂等效比实验
炎症反应是机体最基本的抗损伤过程，其中，慢性炎症模型以肉芽增生为特点，植入大鼠皮下的棉球刺激作用可引起结缔组织的增长，与临床上的炎症后期病理改变类似，因此选择大鼠棉球肉芽肿模型为慢性炎症模型，根据初步建立的等效比，比较配方颗粒及汤剂对大鼠棉球肉芽肿的抑制率，评价两者是否具有等同药效相关性，具体结果见表2。
实验结果表明，模型组大鼠干燥后棉球肉芽肿与原棉球质量有显著差异(p<0.05)，提示大鼠棉球肉芽肿慢性炎症模型成立。与模型组比较，阳性药醋酸地塞米松组对大鼠肉芽肿炎症造成增生有明显的抑制作用，其抑制率为50.42％；三叶青藤叶配方颗粒、三叶青藤叶汤剂均能显著减少大鼠肉芽肿的重量(p<0.05)；对大鼠棉球肉芽肿炎症造成组织增生的抑制率，配方颗粒低、高剂量组分别为15.70％、37.27％，汤剂低、高剂量组分别为14.59％，35.73％，表明三叶青藤叶配方颗粒、三叶青藤叶汤剂均具有抗炎作用且对大鼠肉芽肿组织增生的抑制作用呈剂量依赖性，且配方颗粒高、低剂量组与对照汤剂高、低剂量组的肉芽肿炎症抑制率在统计学上无显著性差异(p＞0.05)，在该等效比下，经大鼠棉球肉芽肿增生抑制作用药效学试验验证，1g三叶青藤叶配方颗粒与三叶青藤叶饮片3g药效基本一致。
表2对大鼠棉球肉芽肿增生的抑制作用(n＝10，
注:与模型组比较:p*<0.05，p**<0.01
验证三叶青藤叶配方颗粒与汤剂生物等效性(药代动力学)
等效性研究是评价新剂型质量的重要方式，通过受试制剂与对照制剂主要药代动力学参数auc、cmax均值之比的90％置信区间与规定的限度相比较，进行等效性评估，是否一致，是判断能否作为替代药品上市的依据之一。研究基于建立的三叶青藤叶配方颗粒大鼠血浆五个效应组分血药浓度测定的uplc-ms体内定量分析方法，分析考察大鼠灌胃给药后新绿原酸、绿原酸、荭草苷、异荭草苷、异荭草苷-2’-o-鼠李糖苷的血药浓度及药代动力学行为及特性，评价三叶青藤叶配方颗粒替代或补充饮片的生物等效性。
药代动力学实验结果表明，三叶青藤叶五个主要效应组分新绿原酸的cmax分别为(39.38±0.87)配方颗粒、(34.71±1.74)汤剂ng·ml-1，绿原酸的cmax分别为(70.33±1.82)配方颗粒、(63.82±2.13)汤剂ng·ml-1，荭草苷的cmax分别为(58.72±0.91)配方颗粒、(54.14±2.91)汤剂ng·ml-1，异荭草苷的cmax分别为(15.32±0.41)配方颗粒、(13.98±1.30)汤剂ng·ml-1，异荭草苷-2’-o-鼠李糖苷的cmax分别为(118.88±2.13)配方颗粒、(105.87±3.63)汤剂ng·ml-1；经方差分析，提示三叶青藤叶配方颗粒与汤剂的cmax无显著性差异(p＞0.05)。新绿原酸auc(0-∞)分别为(307.78±19.72)配方颗粒、(292.60±25.45)汤剂ng·h·l-1，绿原酸的auc(0-∞)分别为(262.39±18.84)配方颗粒、(263.48±39.84)汤剂ng·h·l-1，荭草苷的auc(0-∞)分别为(266.48±15.73)配方颗粒、(253.26±15.16)汤剂ng·h·l-1，异荭草苷的auc(0-∞)分别为(531.94±28.11)配方颗粒、(554.90±17.94)汤剂ng·h·l-1，异荭草苷-2’-o-鼠李糖苷的auc(0-∞)分别为(562.10±19.83)配方颗粒、(532.20±62.97)汤剂ng·h·l-1；经方差分析，提示三叶青藤叶配方颗粒与汤剂的auc(0-∞)无显著性差异(p＞0.05)。另外，与汤剂比较，配方颗粒t1/2(半衰期)和mrt(药物分子体内平均驻留时间)均有缩短，提示三叶青配方颗粒比饮片汤剂起效更快。结果见表3.
三叶青藤叶配方颗粒与汤剂五个效应组分的药动学参数cmax、auc(0-∞)均无显著性差异，提示两剂型差异无统计意义；经双单侧检验法在90％的置信度下检验，初步评价三叶青藤叶配方颗粒、三叶青藤叶汤剂两剂型具有生物等效性，实验结果为临床应用三叶青配方颗粒替代饮片提供了科学依据,结果见表4。
表3灌胃给药后配方颗粒与汤剂主要药动学参数比较(n＝6，x±s)
表4三叶青藤叶配方颗粒、汤剂生物等效性分析
综上所述，三叶青藤叶配方颗粒、三叶青藤叶汤剂两剂型具有生物等效性，为三叶青藤叶配方颗粒可作为替代饮片提供了进一步的临床应用指导。
三叶青藤叶配方颗粒急性毒性试验(安全性评价)
为评价三叶青藤叶配方颗粒用药的安全性，实验依据《中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则》，采用最大耐受量(mtd)试验法，通过最大给药浓度及最大小鼠灌胃体积给药，观察小鼠的急性毒性反应，初步评价三叶青藤叶配方颗粒的口服用药安全性。
取昆明小鼠40只，雌雄各半，随机分为给药组和空白组，每组20只，给药前禁食不禁水12h。空白组灌胃蒸馏水0.4ml/10g，给药组灌胃三叶青藤叶配方颗粒最大浓度药液0.4ml/10g。给药后密切观察6h内各组小鼠状况，连续观察14d，每天一次，观察记录小鼠外观、行为活动、精神状态、摄食、饮水、排泄情况、是否有中毒症状及死亡情况，同时称量给药前、给药后第1、2、3、4、5、7、9、11、14d体质量，记录体质量变化，若有小鼠死亡，立刻将死亡小鼠解剖，肉眼观察小鼠的心、肝、脾、肺、肾等脏器。第14d处死各组小鼠，对其主要脏器进行肉眼观察比较，比较病理变化，若发现肉眼可见病变，则进行病理组织心态学检查，同时称取各脏器湿重，计算脏器指数。
脏器指数＝脏器湿重(mg)/体重(g)。
观察给药后症状
给药后第14d，脱颈处死，解剖，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾，称取各脏器湿重，计算脏器指数。
采用spss20.0软件对数据进行处理分析，用t检验比较各组间的差异性，p＞0.05无显著性差异。
小鼠急性毒性实验结果：
结果表明，给药后10～15min，小鼠行动减缓，对外界刺激反应迟钝，25～30min后，开始逐渐恢复正常活动及饮食饮水，在鼠笼内攀爬，观察期内无动物死亡。小鼠反应症状指标见表5。
表5小鼠反应症状指标
小鼠脏器指数：实验结果表明，与空白组比较，给药组的小鼠各脏器的颜色、质地无差异，脏器指数无显著性差异。
表6小鼠急性毒性mtd实验体质量变化的影响
表7小鼠脏器指数
实验研究证明，三叶青藤叶配方颗粒具有良好的抗炎作用，初步安全性预实验，以最大给药浓度最大给药体积小鼠1次口服灌胃，无dm值(100％死亡率)，故选择mtd试验法进行三叶青藤叶配方颗粒急性毒性试验。根据《中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则》，计算小鼠最大耐受药量倍数，以耐受人临床用量的100倍以上为安全，根据三叶青成人民间服用量15g/d计算，小鼠最大耐受药量约相当于临床用量的126倍；提示三叶青藤叶配方颗粒毒性低，口服用药安全。
传统汤剂已不能适应现代人们的快节奏生活，存在服用剂量大，携带不便，服用前需临时煎煮，有效成分不易完全煎出等问题，研制三叶青藤叶中药配方颗粒，既能保持汤剂原有的疗效及特点，便于贮存，又能方便携带服用。
三叶青藤叶配方颗粒以三叶青藤叶饮片为原料，优选水煎煮提取工艺、喷雾干燥工艺，控制中间体质量，优化成型工艺，获得制备工艺稳定，质量可控的三叶青藤叶配方颗粒；计算三叶青藤叶配方颗粒与饮片煎煮汤剂的等效比，通过大鼠棉球肉芽组织增生慢性炎症模型抗炎作用研究，配方颗粒与饮片(1:3)量效比例的汤剂二者的药效作用，结果无显著性差异，具有等同的药效相关性。三叶青藤叶配方颗粒、水煎煮汤剂大鼠体内生物利用度和药动学研究表明，三叶青藤叶配方颗粒与三叶青藤叶汤剂间具有生物等效性。