一种磁性氧化铁与元素硒纳米复合微粒及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物材料领域，具体涉及一种磁性氧化铁与元素硒纳米复合微粒及其制备方法和应用。

背景技术：

现今，细菌感染被认为是影响世界医疗保健体系的一个重大问题。当病人进行外科手术或骨科植入时，细菌会从病人的皮肤或粘膜进入伤口，引起细菌感染或植入失效。更严重的是细菌接触表面后容易形成一层生物膜。细菌生物膜一旦形成，就会阻止抗生素等药物渗入生物膜内部，使抗生素疗法效果较差或完全失效。

针对这一问题，生物纳米技术得到了快速发展，抗菌型纳米颗粒正逐步取代抗生素以消除细菌耐药性，其中，银和硒纳米颗粒备受关注。但银会产生活性氧原(ros)而对哺乳动物细胞产生潜在毒性，并且部分人体对银过敏。相反，硒是能在人体内找到的一种必要微量元素，硒可以控制ros的存在，是一种天然抗氧化蛋白质。硒在生物医学应用领域已引起了广泛兴趣，具有抗菌、抗癌和生物相容性。硒对许多细菌有效，包括金黄色葡萄球菌(s.aureus)和大肠杆菌(e.coli)等。但因为渗透问题，硒对10μm厚的细菌生物膜的抗菌效果很有限。

技术实现要素：

针对背景技术中存在的技术问题，本发明的目的是提供一种磁性氧化铁与元素硒纳米复合微粒及其制备方法和应用，该复合微粒同时含有元素硒纳米微粒和磁性氧化铁纳米微粒，在外加磁场作用下，磁性氧化铁纳米微粒可以将复合微粒中的硒纳米微粒一起渗入细菌生物膜，从而对生物膜的处理效果显著增强。

本发明采用的技术解决方案是：向亚硒酸钠和古胱甘肽(gsh)混合溶液中加入磁性氧化铁纳米微粒，在碱性催化剂的作用下得到固体粗品复合微粒，经离心分离和磁性分离后再冷冻干燥制得的磁性氧化铁与元素硒纳米复合微粒。

磁性氧化铁与元素硒纳米复合微粒的具体制备方法步骤如下：

(1)将0.01～0.07mol/l的亚硒酸钠溶液和0.01～0.07mol/l的gsh溶液按体积比1：4混合，混合后在平台振动器上振荡15min，振荡速度为300rpm，得到混合溶液；

振荡获得混合溶液的过程中，需控制亚硒酸钠和gsh的浓度，并且使二者浓度相同，混合后可以得到硒二谷胱甘肽中间体，以便后续步骤加碱之后得到元素硒。

(2)在步骤(1)的混合溶液中加入50～300mg磁性氧化铁，继续振荡15min；最后，加入碱性催化剂(1.0mol/lnaoh)溶液，使混合溶液的ph值调至10～13，继续振荡3h，振荡速度为250rpm，得到粗品复合微粒；

或者，优选为：先将50～300mg磁性氧化铁分散在水相溶液中，再与亚硒酸钠和gsh混合溶液混合，这样磁性氧化铁的分散效果更好。

磁性氧化铁用量太高不易分散，且会产生游离的氧化铁，用量太少影响磁性，不能得到符合要求的磁性复合微粒。

(3)步骤(2)得到的粗品复合微粒经去离子水洗涤3次，经6000rpm离心分离10min，然后再经磁性分离后冷冻干燥，得到磁性氧化铁与元素硒纳米复合微粒。

离心分离可以除去水溶性物质，如碱、多余的古胱甘肽，磁性分离是为了得到具有磁性的复合产品，排除未复合成功的元素硒。

所述磁性氧化铁为磁性四氧化三铁纳米微粒，采用共沉淀法制备，其制备方法为：将0.15g低分子量壳聚糖(脱乙酰度为75％-85％)溶解在30ml1％的醋酸溶液中，用1.0mol/lnaoh将ph值调至4.8。加入1.34gfecl2·4h2o和3.40gfecl3·6h2o于上述壳聚糖溶液得到混合溶液。将此混合溶液强力搅拌，先后加入30ml25％的氨水和10ml0.75％的tpp溶液。50℃继续反应1h，整个反应在除氧通氮条件下进行。反应结束后粗品用去离子水洗涤3次，经离心分离和磁性分离，冷冻干燥，得固体磁性氧化铁样品。

制得的磁性氧化铁纳米微粒的粒径为1-20nm；其中，低分子量壳聚糖作为为稳定剂，三聚磷酸钠(tpp)为交联剂。

所述碱性催化剂为1.0mol/l的naoh溶液。

所述磁性分离采用铁、钴、镍等永久性磁铁。

本发明方法制得的复合微粒可用于细菌生物膜的处理，药物传送等生物医药领域，其具体应用方法为：将冷冻干燥后的复合微粒经紫外灯灭菌后使用高温灭菌水配成水溶液，溶液浓度为0.025-0.25mg/ml，除去沉淀，直接作用在生物膜上。

本发明首先采用共沉淀法制备粒径为1-20nm的磁性氧化铁纳米微粒，其稳定剂为带阳电荷的壳聚糖，加入亚硒酸钠和gsh溶液后，形成硒二谷胱甘肽中间体，在碱性条件下，亚硒酸根离子被还原为元素硒，附着在壳聚糖表面，得到含磁性氧化铁和元素硒的复合微粒。其中，碱性强弱会影响元素硒的形成形状。碱性弱，得近球形元素硒纳米微粒；碱性强，得棒状元素硒。所得复合微粒同时具有抗菌抗癌性能和磁性，其生物相容性好，对细菌生物膜的处理效果明显，并可在多种生物医药领域有广泛应用。

本发明的有益效果在于：

(1)将磁性氧化铁与元素硒结合，在外加磁场的作用下，磁性氧化铁能将元素硒一同渗入生物膜内部，大大增强元素硒的渗透能力，同时也更有效发挥了元素硒对细菌生物膜的抗菌效果。

(2)所用磁性氧化铁的粒径为1-20nm，其本身具有一定的抗菌性能，与元素硒结合，能发挥其协调作用，进一步提高该复合微粒的抗菌效果。

(3)使用表面带阳电荷的壳聚糖作为稳定剂，可吸附溶液中的负电荷，如亚硒酸根离子、硒负离子，其本身具有生物相容性，不会引起明显的细胞毒性。

(4)制备过程简单、容易操作。

下面结合附图对本实验进一步说明。

附图说明

图1为实施例1中磁性氧化铁纳米微粒的透射电镜图。

图2为实施例1中磁性氧化铁纳米微粒的xrd图。

图3为实施例1中磁性氧化铁与元素硒纳米复合微粒的透射电镜图。

图4为实施例2中磁性氧化铁与元素硒纳米复合微粒的透射电镜图。

图5为实施例1和对比实施例1中不同样品的抗生物膜活性图。其中，a为控制组(pbs)(空白实验)，b为元素硒(senps)，c为磁性氧化铁(ionps)，d为复合微粒(seionps)；绿色表示活细胞，红色表示死细胞。

具体实施方式

现在结合具体实施例对本发明作进一步说明，以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。

实施例1

(1)磁性氧化铁纳米微粒的制备：将0.15g低分子量壳聚糖(脱乙酰度为75％-85％)溶解在30ml1％的醋酸溶液中，用1.0mol/lnaoh将ph值调至4.8。加入1.34gfecl2·4h2o和3.40gfecl3·6h2o于上述壳聚糖溶液。将此混合物强力搅拌，先后加入30ml25％的氨水和10ml0.75％的tpp溶液。50℃继续反应1h，整个反应在除氧通氮条件下进行。反应结束后粗品用去离子水洗涤3次，经离心分离和磁性分离，冷冻干燥，得固体磁性氧化铁样品，经xrd证实为磁性四氧化三铁，粒径为7.0-12.3nm。

(2)磁性氧化铁与元素硒纳米复合微粒的制备；将8ml0.07mol/l的亚硒酸钠溶液与32ml0.07mol/l的gsh溶液混合，在平台振荡器上室温振荡15min形成硒二古胱甘肽中间体，并使反应达到平衡，振荡速度为300rpm。然后，加入150mg冷冻干燥的磁性氧化铁纳米微粒，继续振荡15min。加入3.0ml1.0mol/l的naoh溶液，溶液ph值为11.08，250rpm继续反应3h。粗品用去离子水洗涤3次，经离心分离和磁性分离，冷冻干燥，得固体复合微粒样品。

图1和图2分别为磁性氧化铁的透射电镜图和xrd图；图3为磁性氧化铁与元素硒纳米复合微粒的透射电镜图，黑色近球形的颗粒为元素硒，颜色较浅的细颗粒为磁性氧化铁，两者粘附在一起。

图5为不同样品处理后细菌生物膜中死细胞和活细胞的分布图，测试仪器为德国蔡斯lsm700的激光共聚焦显微镜。其中，红色点表示死细胞，绿色点表示活细胞，蓝色虚线为磁场分界线。所用细菌膜为s.aureus成膜菌株培养两天后产生的细菌生物膜，生物膜培养好之后，在方形容器底部的左侧放置一小块圆形磁铁(大小与1角硬币相近)，右侧无磁铁作用，加入样品溶液进行处理。图5a和图5b分别为控制样和元素硒作用后的生物膜。图5a左右两侧的活细胞分布相近，无明显变化；图5b两侧的活细胞和死细胞的分布相近，无明显变化。图5c和图5d分别为磁性氧化铁以及磁性氧化铁和元素硒复合样品处理过的生物膜。图5c虚线左侧的死细胞明显比右侧多，说明磁场作用会增强磁性氧化铁的抗菌效果；图5d虚线左侧的死细胞分布明显比右侧多，且高于图5b和图5c，说明磁场作用显著增强了复合微粒的抗菌效果，明显强于磁性氧化铁和元素硒单独作用的效果。

实施例2

(1)磁性氧化铁纳米微粒的制备：同实施例1。

(2)磁性氧化铁与元素硒纳米复合微粒的制备；将8ml0.05mol/l的亚硒酸钠溶液与32ml0.05mol/l的gsh溶液混合，在平台振荡器上室温振荡15min，振荡速度为300rpm。然后，加入100mg冷冻干燥的磁性氧化铁纳米粒子，继续振荡15min。加入3.5mlmol/l的naoh溶液，溶液ph值为11.73，250rpm继续反应3h。粗品用去离子水洗涤3次，经离心分离和磁性分离，冷冻干燥，得固体复合微粒样品。

图4为磁性氧化铁与元素硒纳米复合微粒的透射电镜图，元素硒成棒状，颜色较浅的细颗粒为磁性氧化铁，两者粘附在一起。

实施例3

(1)磁性氧化铁纳米微粒的制备：同实施例1。

(2)磁性氧化铁与元素硒纳米复合微粒的制备；将8ml0.01mol/l的亚硒酸钠溶液与32ml0.01mol/l的gsh溶液混合，在平台振荡器上振荡15min，振荡速度为300rpm。然后，加入50mg冷冻干燥的磁性氧化铁纳米粒子，继续振荡15min。加入3.5mlmol/l的naoh溶液，溶液ph值为11.73，250rpm继续反应3h。粗品用去离子水洗涤3次，经离心分离和磁性分离，冷冻干燥，得固体复合微粒样品。

实施例4

(1)磁性氧化铁纳米微粒的制备：同实施例1。

(2)磁性氧化铁与元素硒纳米复合微粒的制备；将8ml0.05mol/l的亚硒酸钠溶液与32ml0.05mol/l的gsh溶液混合，在平台振荡器上室温振荡15min，振荡速度为300rpm。然后，先将100mg磁性氧化铁分散在水相溶液中，再与亚硒酸钠和gsh混合溶液混合，继续振荡15min。加入3.5mlmol/l的naoh溶液，溶液ph值为11.73，250rpm继续反应3h。粗品用去离子水洗涤3次，经离心分离和磁性分离，冷冻干燥，得固体复合微粒样品。

对比实施例1

将8ml0.07mol/l的亚硒酸钠溶液与32ml0.07mol/l的gsh溶液混合，在平台振荡器上室温振荡15min形成硒二古胱甘肽中间体，并使反应达到平衡，振荡速度为300rpm。然后，加入3.0ml1.0mol/l的naoh溶液，溶液ph值为11.08，250rpm继续反应30min。粗品用去离子水洗涤3次，经离心分离和磁性分离，冷冻干燥，得硒元素微粒样品。

对比实施例2

(1)磁性氧化铁纳米微粒的制备：同实施例1。

(2)磁性氧化铁与元素硒纳米复合微粒的制备；将8ml1.0mol/l的亚硒酸钠溶液与32ml1.0mol/l的gsh溶液混合，在平台振荡器上室温振荡15min，振荡速度为300rpm。然后，加入100mg冷冻干燥的磁性氧化铁纳米粒子，继续振荡15min。加入3.5mlmol/l的naoh溶液，溶液ph值为11.73，250rpm继续反应3h。粗品用去离子水洗涤3次，经离心分离和磁性分离，冷冻干燥，无法得到固体复合微粒样品。