本发明属于乳腺癌的分子药物技术领域，尤其涉及mir-218在制备乳腺癌化疗药物增敏剂中的应用。
背景技术：
microrna(mirna)是一类内源性非编码的短链rna片段，长度一般为17-23个核苷酸。存在于人类基因组中的mirnas约有1000种，占基因总数的2％，却可对人体中超过30％的基因起到调控作用。近年来，mirna与肿瘤的关系已成为现阶段肿瘤学基础研究的一个热点，mirna可作为肿瘤诊断、治疗及预后的标志物。
mir-218是一种存在于人体内的微小rna，定位于人染色体中12p13.1，包含21核苷酸，其序列为“uugugcuugaucuaaccaugu”。mir-218具有和其他mirnas相似的形成机制：首先在rna聚合酶ii作用下形成pri-mir-218，进而被drosha核糖核酸酶酶切，形成大概为70nt的茎环结构pre-mir-218。在核转运因子exportin-5的作用下，pre-mir-218抵达细胞质，由dicer剪切，形成一个不完全配对的rna双螺旋-mir-218，最后降解为单链mir-218，通过与其靶基因结合沉默靶基因发挥作用。在正常的生理过程中，mir-218通过影响靶基因的表达参与多种信号转导通路的调控，从而调节正常的生理过程。
乳腺癌是目前世界范围内女性最常见的恶性肿瘤，严重危害女性的生命健康。美国肿瘤学会预测，2019年美国将有超过27.1万乳腺癌新发病例，占女性恶性肿瘤新发病例的30％，稳居各类型肿瘤发病率的第一位；超过4万的死亡病例，位居第二(siegel,r.l.；miller,k.d.；jemal,a.,cancerstatistics,2019.cacancerjclin69(2019)7-34.)。虽然乳腺癌的诊疗方法取得了很大的进步，但已发生淋巴结或远端转移的进展期乳腺癌仍具有较高的死亡风险。在乳腺癌的术后，经常采用化疗的方法，为了增强化疗的效果，通常使用化疗增敏剂，但是目前的化疗增敏剂种类较少，总体增敏效果不理想。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供mir-218在制备乳腺癌化疗药物增敏剂中的应用，增加乳腺癌化疗药物增敏剂的种类，提高增敏效果。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
mir-218在制备乳腺癌化疗药物增敏剂中的应用。
优选的，所述mir-218的核苷酸序列如seqidno：1所示。
优选的，所述化疗药物包括紫杉醇。
优选的，所述化疗药物包括阿霉素。
优选的，所述mir-218在化疗药物增敏剂中的浓度为50～150nmol/l。
本发明提供了mir-218在制备靶向下调daam1基因表达的药物中的应用。
本发明的有益效果：本发明提供了mir-218在制备乳腺癌化疗药物增敏剂中的应用，本发明中，所述mir-218能够显著增加乳腺癌细胞对紫杉醇和阿霉素的敏感性；另外，所述mir-218能够靶向下调daam1基因的表达，通过靶向下调daam1基因的表达，抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭能力。
附图说明
图1为mir-218在正常乳腺组织和乳腺癌标本中表达情况，其中(a)为乳腺癌组织与癌旁正常乳腺组织中mir-218表达量的比较，(b)为在35例癌与癌旁配对的组织中，癌组织中mir-218的表达量比较，(c)为无淋巴结转移的乳腺癌和已发生转移的癌组织中mir-218的表达量比较，(d)为大小不同的肿瘤组织中mir-218的表达量比较；
图2为mir-218直接靶向下调daam1基因；其中(a)为mir-218与daam1基因的3’-utr的结合区域示意图，(b)为daam1-3’-utr转染组和daam1-3’-utr-del转染组的荧光素酶活性比较，(c)为在mir-218和daam1-3’-utr共转染组中，荧光素酶活性明显下调，(d)为过表达mir-218的mda-mb-231细胞中，daam1蛋白的表达水平；
图3为过表达mir-218对乳腺癌mda-mb-231细胞的侵袭能力的影响；其中，(a)为显微镜视图，(b)为(a)的统计结果图；
图4为mir-218对乳腺癌mda-mb-231细胞增殖能力的抑制情况；
图5为mir-218对乳腺癌mda-mb-231、sum1315细胞的化疗药物的敏感性的影响，其中a～e分别为紫杉醇、阿霉素、环磷酰胺、多西他赛和山奈酚。
具体实施方式
本发明提供了mir-218在制备乳腺癌化疗药物增敏剂中的应用。本发明中，所述mir-218还包括mir-218的前体和类似物；本发明中，所述mir-218的核苷酸序列如seqidno：1所示，具体为uugugcuugaucuaaccaugu。本发明对所述mir-218的来源没有特殊限定，采用化学合成获得或通过构建真核细胞表达载体进行表达获得。本发明中，所述化疗药物包括常规的乳腺癌化疗药物，优选为紫杉醇或阿霉素。本发明中，所述乳腺癌化疗药物增敏剂优选的以mir-218为唯一活性成分，也可以包括其他mir-218可接受的活性成分或辅料。在本发明中，所述mir-218在化疗药物增敏剂中的浓度优选为50～150nmol/l，更优选为80～120nmol/l，最优选为100nmol/l。
在本发明中，所述mir-218能够靶向下调daam1基因表达，细胞中过表达mir-218能有效降低其靶标基因daam1的蛋白表达，明显抑制乳腺癌mda-mb-231细胞的侵袭和增殖能力，而过表达daam1基因可以部分挽救mir-218对乳腺癌细胞侵袭和增值能力的抑制。mir-218作为紫杉醇或阿霉素的化疗增敏剂，以提高化疗药对乳腺癌的治疗效果，具有很好的实际应用价值。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.细胞培养
乳腺癌细胞株mcf-7、mda-mb-231、sum1315均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。三株乳腺癌细胞均培养在含10％(v/v)胎牛血清(fbs)的dulbecco’s培养基中，培养基添加100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素，所有细胞均放置于含5％co2的37℃培养箱内，2～3天传代一次。
2.乳腺癌细胞及组织中微小rna的提取纯化
本次研究共纳入123名病例，均为2014年至2017年南京医科大学第一附属医院确诊为乳腺癌并实施手术的患者。我们收集了123例乳腺癌组织和35例相邻的正常组织。使用trizol试剂提取乳腺癌细胞以及乳腺癌临床标本中的总rna，使用mirvanatmmirnaisolation(ambion,austin,tx)试剂盒提取并纯化微小rna，并将其溶于无rnase的水中，通过测定od260、od280数值，并经琼脂糖凝胶电泳确定提取的微小rna含量和质量。
3.实时定量pcr分析
用sybrpremixextaqtm试剂盒(takara,dalian，china)在appliedbiosystems7500实时定量pcr系统上进行。使用δct法对mirna的表达量进行分析：首先，测定每个样品在荧光阈值水平上的循环次数。接下来，通过计算δct值显示mir-218的ct值与u6的ct值之间的差别(δct＝ct(mir-218)-ct(u6))。mir-218的倍数表示采用2-δδct方法。结果如图1所示，(a)与癌旁正常乳腺组织相比，癌组织中mir-218的表达量明显降低；(b)在35例癌与癌旁配对的组织中，癌组织中mir-218的表达量明显降低；(c)与无淋巴结转移的乳腺癌组织相比，已发生转移的癌组织中mir-218的表达量明显降低；(d)在不同大小的肿瘤组织(肿瘤组织＜2cm；肿瘤组织＞2cm)中mir-218的表达量的表达无差异。
4.荧光报告载体实验
固相亚磷酰胺三酯法合成基因daam13’-utr(5’-gccaugacuguucagaagcacaa-3’，seqidno：2)并连接与pgl3-对照载体的xbai位点。在转染前24h，将细胞接种到24孔板(约1.5×105细胞/孔)中。然后，使用80ngprl-tk，60pmol的mir-218类似物(5’-uugugcuugaucuaaccaugu-3’)或对照组mirna(microntmmirnamimics阴性对照，广州市锐博生物科技有限公司)以及200ng的pgl3-daam1-3'-utr或pgl3-daam1-3'-utr-del通过lipofectamine2000转染入细胞。使用双荧光素酶实验报告系统在转染后24h检测荧光素酶活性。之后将每个转染孔的萤火虫荧光素酶活性标准化为海肾荧光素酶活性。结果如图2所示，其中(b)荧光素酶实验显示相比daam1-3’-utr转染组，daam1-3’-utr-del转染组的荧光素酶活性明显上调；(c)在mir-218和daam1-3’-utr共转染组中，荧光素酶活性明显下调。
5.蛋白质印迹分析
为验证转染mir-218类似物是否抑制靶基因daam1的表达，采用蛋白质印记分析。将mda-mb-231细胞置于6孔板(约6×105细胞/孔)中。72h后，用mir-218类似物或对照的mirna类似物转染，使用裂解缓冲液处理细胞并匀浆获得细胞裂解液。mir-218类似物和对照的mirna类似物对照由上海genepharma公司化学合成。通过8％的sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离总蛋白质(室温，110v，120min)。取出聚丙烯酰胺凝胶进行pvdf膜电转移(4℃，100v，30min)；取出pvdf膜，置于5％的脱脂牛奶封闭液中，室温下封闭0.5h；加入一抗(兔抗β-actin蛋白抗体或兔抗daam1蛋白抗体，购自武汉三鹰公司)，室温下分别孵育1h、3h；tbst清洗4次，每次5min；加入二抗(羊抗兔igg抗体，购自武汉三鹰公司)，室温下孵育lh；tbst清洗4次，每次5min；加入增强化学发光试剂，曝光，然后进行显影、灰度值定量处理。结果如图2(d)所示，过表达mir-218的mda-mb-231细胞中，daam1的蛋白水平明显下调。
6.侵袭实验
在改良的boyden小室中评估细胞侵袭能力，其中上下层小室用聚碳酸酯膜(8.0mm孔径)分隔，隔膜上涂有基质胶(37℃，30min，厚度1mm)。转染了mir-218类似物的mda-mb-231细胞培养板中生长至亚融合后将其分离，然后离心(1000rpm，5min)并在无血清培养基(添加5mg/mlbsa)中制成单细胞悬浮液。含有5×104个细胞的悬浮液添加到上层小室中。含有500ng/mlwnt5a的培养基添加到boyden小室的下层。在37℃条件下使细胞向下侵袭6h。此后丢弃培养基，使用0.5％结晶紫的静止的细胞进行染色。通过在光学显微镜下计算入侵细胞的数量评估细胞的侵袭能力。结果如图3所示，过表达mir-218显著抑制乳腺癌细胞mda-mb-231的侵袭能力，而通过转染外源性的daam1可部分逆转mir-218介导细胞侵袭力的下降。
7.cck-8实验
将转染后的乳腺癌细胞按105/孔的密度种于96孔板中，培养48h后每孔加入100μl的cck-8试剂，放入37℃培养箱避光培养30min，使用酶标仪检测波长450nm处的吸光度值，评价细胞的增殖能力。结果如图4所示，过表达mir-218显著抑制乳腺癌细胞mda-mb-231的增殖能力，而通过转染外源性的daam1可部分逆转mir-218介导乳腺癌细胞mda-mb-231增殖受限。
8.体外药敏实验
将mda-mb-231和sum1315乳腺癌细胞接种到6孔板(约6×105细胞/孔)中，并分别用100nmol/l20μlmir-218类似物或对照组mirna类似物转染。转染后24h，将细胞接种到96孔板(约5×103细胞/孔)中。向所述接种细胞后的96孔板中分别加入紫杉醇、阿霉素、环磷酰胺、多西他赛和山奈酚，使终浓度分别为紫杉醇100ng/ml、阿霉素1000nmol/l、环磷酰胺100nmol/l、多西他赛100nmol/l和山奈酚200μmol/l；处理乳腺癌细胞48h。之后通过mtt法评估细胞的增殖情况。在细胞转染mir-218后24h用化疗药物处理，细胞存活率在化疗药物处理后48h测定。
结果如图5所示，其中(a)、(b)表明，与对照组相比，mir-218在mda-mb-231和sum1315乳腺癌细胞中的过表达显著提高细胞对紫杉醇、阿霉素的敏感性。
(c)、(d)、(e)表明mir-218在mda-mb-231和sum1315细胞中的过表达未能增加细胞对环磷酰胺，多西他赛和山奈酚的敏感性。
细胞增殖情况详见表1。
表1转染mir218后不同化疗药物作用细胞的半抑制浓度(ic50)
由上述实施例可知，所述mir-218可增强乳腺癌细胞的紫杉醇、阿霉素的药物敏感性。此外，相比正常乳腺组织，mir-218在乳腺癌组织中的表达量明显降低，相比无淋巴结转移的乳腺癌组织，已发生转移的癌组织中mir-218的表达量也明显降低；转染mir-218提高mda-mb-231细胞中mir-218水平，则其靶标基因daam1基因的蛋白表达明显下降，同时使该细胞的侵袭和增殖能力显著下降。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>南京医科大学
<120>mir-218在制备乳腺癌化疗药物增敏剂中的应用
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>21
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
uugugcuugaucuaaccaugu21
<210>2
<211>23
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
gccaugacuguucagaagcacaa23