槐耳提取物在制备治疗和/或预防高脂饮食致肝损伤相关疾病的制剂中的用途的制作方法

本发明涉及一种食用菌提取物在制备治疗和/或预防高脂饮食致肝损伤相关疾病的制剂中的用途，尤其涉及槐耳提取物在制备治疗和/或预防高脂饮食致肝损伤相关疾病的制剂中的用途。

背景技术：

肠道微生物组被誉为“人体第二套基因组”，与人类健康息息相关。人类肠道微生物种类多达1000种以上，其中厚壁菌门和拟杆菌门为优势菌群，肠道基因组中的基因数量为人类自身基因组的100多倍。肠道菌群与宿主存在着互利共生关系，在肠道中保持着动态平衡，当平衡被打破时，人就有可能患上各种疾病。已有研究证实：(1)肠道菌群与肥胖相关，肥胖人群存在肠道菌群结构失调，细菌多样性下降；肥胖小鼠的拟杆菌门少，厚壁菌门多；将肥胖小鼠的肠道微生物移植到无菌小鼠上，会导致后者脂肪量增加。对于肥胖的人来说，长期摄入高脂饮食，可造成肠道菌群结构的改变，失衡的肠道菌群会产生内毒素进入人体，被免疫细胞识别后产生多种炎症因子，导致机体处于低度炎症状态，产生代谢异常，使得从食物中摄取的能量容易转换成脂肪，造成肥胖；(2)肝脏和肠道在生物学功能上是密切相关、相互影响的。肝脏与肠道菌群通过肠-肝轴相互作用，肠道菌群与肝脏疾病密切，肝脏患病时，会影响肠道菌群的结构和功能，而肠道菌群失调时又会反过来影响肝脏功能，肝硬化患者双歧杆菌等有益菌数量降低，而肠杆菌、肠球菌等有害菌数量增多。

高脂饮食可以改变肠道菌群结构，使有益菌减少，有害菌增多，破坏肠道菌群的平衡，进而影响肝脏功能，造成肝损伤，并且随着我国生活水平的发展及饮食结构等问题的增加，由高脂饮食导致的肝损伤的发病率明显增加，迫切需要开发在制备治疗和/或预防高脂饮食致肝损伤相关疾病方面的制剂。

技术实现要素：

针对以上不足，本发明提供一种槐耳提取物在制备治疗和/或预防高脂饮食致肝损伤相关疾病的制剂中的用途，功能显著明确，能够药用化，具有实用性。

本发明通过以下方案达到上述目的：

在本发明的第一方面，提供一种槐耳提取物在治疗和/或预防高脂饮食致肝损伤相关疾病中的用途。

在本发明的第二方面，提供一种槐耳提取物在制备治疗和/或预防高脂饮食致肝损伤相关疾病的制剂中的用途。

在本发明的第三方面，提供一种治疗和/或预防高脂饮食致肝损伤相关疾病的制剂，所述制剂包含槐耳提取物。

在本发明的第四方面，提供一种治疗和/或预防高脂饮食致肝损伤相关疾病的药物，包含槐耳提取物和药学上可接受的载体。

在本发明的第五方面，提供一种槐耳提取物的制备方法，包括：将槐耳子实体粉碎后，依次用醇提、水提、naoh碱水提取，分别得到提取溶液，再分别经浓缩、冷冻干燥，得到槐耳醇提取物、槐耳水提取物、槐耳碱提取物。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明的制备方法简单易行、运行成本低，本发明的制备方法中的提取溶剂只使用了乙醇、水、naoh水溶液，可以回收再利用，无有机试剂残留风险，保证了槐耳提取物的天然品质的同时且对环境友好，属于绿色制造技术。

(2)本发明依次采用乙醇、水、和naoh水溶液提取槐耳子实体，原料提取较完全，充分利用了原料，在保证提取物效果的基础上原料利用率也很高。

(3)本发明的槐耳提取物不仅能明显有助于高脂饮食致肝损伤的修复，而且还对与肝损伤相关的疾病表现出明显的治疗和/或预防效果，例如能有效缓解炎症的恶化，改善免疫相关的各项生理病理指标，可以用于药物、保健品等各种领域中，具有极大的经济和社会价值。

附图说明

图1为实施例2的小肠组织he染色病理切片图。

图2为实施例2的肝脏组织病理切片图。

具体实施方式

在本发明的第一方面，提供一种槐耳提取物在治疗和/或预防高脂饮食致肝损伤相关疾病中的用途。

其中，所述高脂饮食致肝损伤相关疾病包括但不限于肝脏脂肪变性、非酒精性脂肪肝炎、肝硬化、肝衰竭。

在本发明的第二方面，提供一种槐耳提取物在制备治疗和/或预防高脂饮食致肝损伤相关疾病的制剂中的用途。

其中，所述高脂饮食致肝损伤相关疾病包括但不限于肝脏脂肪变性、非酒精性脂肪肝炎、肝硬化、肝衰竭。

在本发明的第三方面，一种预防和/或治疗高脂饮食致肝损伤相关疾病的制剂，所述制剂包含槐耳提取物。

优选的，所述制剂包括药物、保健品或食品。

其中，所述高脂饮食致肝损伤相关疾病包括但不限于肝脏脂肪变性、非酒精性脂肪肝炎、肝硬化、肝衰竭。

在本发明的第四方面，一种预防和/或治疗高脂饮食致肝损伤相关疾病的药物，包含槐耳提取物和药学上可接受的载体。

其中，所述高脂饮食致肝损伤相关疾病包括但不限于肝脏脂肪变性、非酒精性脂肪肝炎、肝硬化、肝衰竭。

本发明中所述的“药学上可接受的载体”还可以理解为“稀释剂”或“辅料”等，在医药领域内众所周知且描述于例如雷明顿医药科学(remington’spharmaceuticalsciences)，马克出版公司(mackpublishingco.)(a·r·格纳诺(a.r.gennaro)编，1985)。这些物质在所使用的剂量和浓度下对接受者来说是无毒，包括诸如磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐和其它有机酸盐等缓冲液；诸如抗坏血酸等抗氧化剂；诸如聚精氨酸等低分子量(小于约10个残基)肽；诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白等蛋白质；诸如聚乙烯吡咯烷酮等亲水聚合物；诸如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸等氨基酸；单糖、二糖和包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精的其它碳水化合物；诸如edta等螯合剂；诸如甘露醇或山梨醇等糖醇；诸如钠等抗衡离子；和/或诸如吐温(tween)、泊洛尼克(pluronics)或聚乙二醇等非离子型表面活性剂；还包括包括无菌水、盐水、葡萄糖、油(如玉米油、花生油及类似物)、酸。进一步还可以包括防腐剂、润湿剂、乳化剂、及类似物等。

本发明的槐耳提取物或药物的给药剂量可以随具体给药方法和被治疗的客体或类型而变化。该剂量足以产生预期的有益效果，并且可以配制用于单一剂量施用或多重剂量施用。

本发明中所述的药物可以通过本领域技术人员已知的任何途径施用，包括口服、肌内、静脉内、真皮内、病灶内等途径。施用可以是局部、表面或者全身的。在任何给定的情况下最合适的途径取决于多种因素，例如疾病的性质、疾病的进程、疾病的严重性等。作为优选，本发明的槐耳提取物或包含槐耳提取物在内的药物通过口服给药。

本发明的所述槐耳提取物还可以与第二活性化合物/第二治疗剂一起施用，同时、相继或并行施用。在分别施用时，本发明的所述槐耳提取物或包含槐耳提取物的药物与第二活性化合物或第二治疗剂可以以不同的用药频率或间隔施用。

在本发明的上述四个方面的用途或制剂中，所述槐耳提取物包括槐耳水提取物、槐耳醇提取物、槐耳碱提取物。

在一个实施例中，所述槐耳醇提取物为槐耳乙醇提取物。

在一个实施例中，所述槐耳碱提取物为槐耳氢氧化钠提取物。

优选的，在本发明的上述四个方面的用途或制剂中，所述槐耳提取物优选为下述制备方法制备得到的槐耳提取物。

在本发明的第五方面，提供一种槐耳提取物的制备方法，包括：将槐耳子实体粉碎后，依次用醇提、水提、氢氧化钠(naoh水溶液)碱水提取，分别得到提取溶液，再分别经浓缩、冷冻干燥，得到槐耳醇提取物、槐耳水提取物、槐耳碱提取物。

优选的，一种槐耳提取物的制备方法，包括：将槐耳子实体粉碎后，依次用95％乙醇提取、水提取、1％-2％naoh碱水提取，分别得到提取溶液，再分别经浓缩、冷冻干燥，得到槐耳醇提取物、槐耳水提取物、槐耳碱提取物。

优选的，一种槐耳提取物的制备方法，包括：将槐耳子实体粉碎后，采用乙醇回流提取，得到第一滤渣和醇提取溶液，将第一滤渣采用水回流提取溶液，得到第二滤渣和水提取溶液，再将第二滤渣采用1％-2％naoh水溶液回流提取，得到第三滤渣和碱提取溶液，将醇提取溶液、水提取溶液分别经过浓缩、冷冻干燥得到槐耳醇提取物、槐耳水提取物；将碱提取溶液经过浓缩、醇沉、冷冻干燥得到槐耳碱提取物。

优选的，所述乙醇回流提取包括：加入料液比为1:8-1:15的乙醇，回流提取2-4小时，抽滤，得到滤液、减压浓缩得到稠膏，稠膏经-80℃冷冻过夜，冷冻干燥，即得槐耳醇提物。

优选的，所述水回流提取包括：取醇提后的滤渣，采用料液比为1:8-1:15的水，回流提取1-3小时，抽滤，得到滤液、减压浓缩得到稠膏，稠膏经-80℃冷冻过夜，冷冻干燥，即得槐耳水提物。

优选的，所述1％-2％naoh碱水提取包括：取经醇和水提后的滤渣，采用料液比为1:8-1:15的碱水，搅拌下超声提取1-2小时，抽滤，得到滤液，加入醇类试剂沉淀，沉淀12-24小时，收集沉淀，经-80℃冷冻过夜，冷冻干燥，即得槐耳碱提物。

所述1％-2％naoh或所述1％-2％naoh碱水是指重量百分含量为1％-2％的naoh水溶液。

优选的，所述1％-2％naoh为2％naoh。

进一步优选的，所述沉淀的醇类试剂包括乙醇、甲醇。

进一步优选的，所述沉淀为加入液体4-6倍量的乙醇，沉淀12-24小时。

在本发明的第六方面，提供一种上述制备方法制备得到的槐耳提取物。

槐耳(ew'searonpagodatcmlibee)，为多孔菌科真菌槐栓菌的子实体，别名：槐檽、槐菌、槐鸡、槐鹅、槐蛾、赤鸡。槐栓菌trametesrobiniophilamurr。子实体无柄，菌盖半圆形，常呈覆瓦状，木栓质，棕褐色，近光滑，有少数环纹，菌肉黄白色，干后有香味，壁厚而光整，孔口黄白色，多角形，每1mm间5～6个，孢子无色，光滑，孢子印白色，常有囊状体。生长于槐及洋槐、青檀等树干上。分布于河北、山东、陕西、四川、重庆等地。野生资源稀缺，江苏等地采用固体发酵法培养槐栓菌以供药用。具有抗肿瘤、增强免疫功能和抗病毒等作用。

本发明中所述的“失调”可以理解为“失衡”、“紊乱”、或“疾病”等。

如本文中所使用，术语“包含”或“包括”指方法包括所列举的要素，但不排除其它要素。

本发明所述的槐耳为多孔菌科真菌槐栓菌的子实体，主成分为槐耳蛋白多糖，其水解产物含l-岩藻糖(fucose)，l-阿拉伯糖(arabinose)，d-木糖(xylose)，d-甘露糖(mannose)，d-半乳糖(galactose)，d-葡萄糖(glucose)等6种单糖，及天冬氨酸(asparticacid)，苏氨酸(threonine)，丝氨酸(serine)，谷氨酸(glutamicacid)，脯氨酸(proline)，甘氨酸(glycine)，丙氨酸(alanine)，胱氨酸(cystine)，缬氨酸(valine)，蛋氨酸(methionine)，异亮氨酸(isoleucine)，亮氨酸(leucine)，酪氨酸(tyrosine)，苯丙氨酸(phenylalanine)，赖氨酸(lysine)，组氨酸(histidine)，色氨酸(typtophane)，精氨酸(arginine)等18种氨基酸组成。这种食用菌价值极高。

以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1：槐耳提取物的制备，步骤如下：

(1)将槐耳子实体粉碎，采用料液比为1:8-1:15的乙醇，回流提取2-4小时，抽滤，得到滤液、减压浓缩得到适当浓度的稠膏，稠膏经-80℃冷冻过夜，入冷冻干燥机干燥，即得槐耳醇提取物。

(2)取上述经醇提后的滤渣，采用料液比为1:8-1:15的水，回流提取1-3小时，抽滤，得到滤液、减压浓缩得到适当浓度的稠膏，稠膏经-80℃冷冻过夜，入冷冻干燥机干燥，即得槐耳水提取物。

(3)取上述经醇和水提后的滤渣，采用料液比为1:8-1:15的2％naoh水溶液，搅拌下超声提取1-2小时，抽滤，得到滤液，加入适当浓度乙醇，沉淀12-24小时；收集沉淀，经-80℃冷冻过夜，入冷冻干燥机干燥，即得槐耳碱水提取物。

将得到的槐耳醇提取物、槐耳水提取物、槐耳碱水提取物进行多糖含量测定，多糖含量测定采用中华人民共和国农业行业标准ny/t1676-2008《食用菌中粗多糖含量的测定》方法；蛋白质含量测定采用凯氏定氮法。

表1为槐耳提取物中测定的粗多糖含量及蛋白质含量。

表1槐耳提取物中粗多糖及蛋白质含量

实施例2：槐耳提取物对高脂饮食诱导肥胖小鼠肝损伤的改善作用

1、试剂：

总胆固醇(t-cho)测试盒：南京建成生物工程研究所。

甘油三酯(tg)测试盒：南京建成生物工程研究所。

低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)测试盒：南京建成生物工程研究所。

高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)测试盒：南京建成生物工程研究所。

丙氨酸氨基转移酶(alt)测试盒、总蛋白(tp)测试盒、白蛋白(alb)测试盒和球蛋白(glb)测试盒都购自于南京建成生物工程研究所。

雌性c57小鼠30只，spf级，体重12-14g，日龄28-30d，购自于广东省医学实验动物中心，许可证号为scxk(粤)2013-0002。

大小鼠维持饲料：广东省医学实验动物中心，许可证号scxk(粤)2013-0002。

高脂高胆固醇饲料配方如表2所示。

表2高脂高胆固醇饲料的主要成分及能量构成

槐耳提取物按本发明实验例1制备得到。

2、方法

高脂饮食诱导肥胖小鼠模型的制备：受试动物饲养在广东省微生物所动物实验中心，饲养温度与湿度：23±1℃，55±10％，采用12h昼夜间断照明；饲养室条件始终保持稳定，以保证试验结果的可靠性。小鼠自由进食饮水。期间每日检查动物一次，未发现不健康的动物，取全部健康小鼠进行实验。50只c57小鼠经适应性饲养7d后，随机分成正常组、模型组、槐耳醇提组、槐耳水提组和槐耳碱提组，每组10只。正常组用普通饲料喂养，模型组和给药组用高脂高胆固醇饲料喂养，连续喂养2个月。

造模成功后，开始给药，给药组分别给予槐耳水提取物、槐耳醇提取物和槐耳碱提取物灌胃，药物浓度6mg/ml(180g提取物溶于30ml水中)，剂量3mg/只/天，给药量0.5ml/只/天，连续给药35天，同时正常组小鼠继续用普通饲料喂养，给药组和模型组小鼠换用普通饲料喂养。

3、结果观察

每天观察动物的外观体态(毛、色、形)和动态并作相应记录，每隔7d测量动物体重1次。

血液：停药24h后，动物取材测定指标。采集血样，摘眼球取血，血浆经3000rpm，10min离心两次收集血清，测定血清中t-cho、tg、ldl-c、hdl-c、tp、alb、glb、alt水平。

组织：摘眼球取血后，处死并解剖小鼠，取小鼠小肠和肝脏组织，固定在4％多聚甲醛中。小肠和肝脏组织被制成石蜡切片，小肠组织采用苏木素-伊红(he)法染色，肝脏组织分别采用苏木素-伊红(he)、masson、油红o(ors)，进行病理切片观察。

4、数据处理

所有数据以均数±标准差表示。多组间均数的比较采用单因素方差分析(one-wayanova)，组间均数两两比较，方差齐时采用lsd法；方差不齐时采用dunnett’st3法。由spss软件完成，α＝0.05。

观察发现，给药组的动物的毛皮比模型组的毛皮更平滑。

表3小鼠体重变化

^#p<0.05，^##p<0.01，^###p<0.001vs正常组；^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001vs模型组

各组的体重变化如表3所示。

从表3可以看出，经过治疗的动物的毛皮比模型组的毛皮更平滑。实验结束时，正常组和模型组之间的平均体重差异显著(p<0.05)，模型组小鼠在开始时平均体重约65.45g，在实验结束时平均体重为72.76g，说明高脂饮食诱导肥胖小鼠模型造模成功；与模型组相比，3个给药组小鼠平均体重显著下降(p<0.001)(表3)。这表明：给肥胖小鼠灌胃适量的槐耳提取物可以显著减缓体重增加。

各组的血脂四项检测结果如表4所示。

表4小鼠血清生化指标(mmol/l)

^#p<0.05，^##p<0.01，^###p<0.001vs正常组；^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001vs模型组

从表4可以看出，模型组中总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇比正常组显著升高(p<0.01或p<0.001)，高密度脂蛋白胆固醇比正常组显著降低(p<0.001)；与模型组相比，给药组中甘油三酯(t-cho)、总胆固醇(tg)、低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)水平显著下降(p<0.05或p<0.01或p<0.001)，高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)水平显著升高(p<0.05)。这表明：给肥胖小鼠灌胃适量的槐耳提取物可以显著降低血清中的总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白水平。

各组的肝功能测定结果如表5所示。

表5肝功能测定结果

^#p<0.05，^##p<0.01，^###p<0.001vs正常组；^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001vs模型组

血清中alt和alb/glb可反映肝功能受损程度，肝细胞受损时，alb合成下降，球蛋白平衡失调，致使alb/glb下降。从表5可以看出，与正常组相比，模型组小鼠血清中alt显著升高(p<0.05)，表明高脂饮食致肝损伤造模成功；与模型组相比，给药组中alt显著降低(p<0.05)，alb和alb/glb显著升高(p<0.05)。表明槐耳提取物可以改善肝损伤。

小肠组织he染色病理切片结果如图1所示，从图1可见，正常组小肠组织绒毛长而完整，模型组肠绒毛脱落严重，说明高脂饮食能够对小鼠的肠道造成损伤，说明模型是成功的。与模型组相比，经过药物处理后，给药组能够缓解损伤，促进肠道的修复。

肝脏组织病理切片结果如图2所示，从图2可以看出，he染色结果显示正常组小鼠肝细胞结构正常，模型组小鼠肝细胞体积增大，肝细胞细胞质内出现很多大小不一的圆形空炮，将细胞核推向一侧，局部有炎性细胞浸润现象；与模型组相比，给药组小鼠肝细胞脂肪空泡数量明显减少，炎性细胞浸润现象有所好转；masson染色和ors染色结果分别显示，与模型组相比，给药组小鼠肝细胞结构明显改善，趋于正常组。

发明人还发现，高脂饮食诱导肥胖小鼠模型，使其肠道菌群结构发生显著变化，在高脂高胆固醇饲料中添加槐耳提取物明显有助于肠道内优势菌群结构恢复，有助于菌群多样化，有效改善肠道菌群失调，修复肠道黏膜，有效抑制缓解炎症的恶化，改善免疫相关的各项生理病理指标。发明人认为，槐耳提取物可能是基于此从而能够改善高脂饮食导致的肝损伤，可以用于药物、保健品等各种领域中，具有极大的经济和社会价值。

以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。