一种治疗炎症性肠病的益生菌复合物的制作方法

本发明涉及益生菌药物领域，尤其涉及一种治疗炎症性肠病的益生菌复合物。
背景技术：
：大肠杆菌nissle1917(ecn)是来源于人体内肠道中的一种益生菌，被广泛用于预防传染性腹泻、炎症性肠疾病以及防止新生儿消化道内病原菌定殖；其使用方式主要是口服。在肠道疾病治疗治疗中，口服的ecn由于容易经受胃酸侵蚀以及消化道挤压摩擦，其到达肠道病灶时的活性已被大大降低，发挥的治疗作用十分局限。海藻酸钠和壳聚糖组成的保护性微胶囊目前已有报道，该微胶囊通常是由一层海藻酸钠包裹细菌后，交联钙离子，再在外侧包裹一层壳聚糖(e.colinisslemicroencapsμlationinalginate-chitosannanoparticlesanditseffectoncampylobacterjejuniinvitro，appliedmicrobiologyandbiotechnology，2018)。然而，此种微胶囊包裹的ecn在ph值为2.5的环境中静置1h后，仅千分之一的菌能存活下来；若将其置于ph更低、且含有胃蛋白酶的胃酸中，能存活下来的菌就会更少，对ecn的利用率极低。技术实现要素：为了解决上述问题，本发明提供了一种新的益生菌复合物。本发明提供了一种治疗炎症性肠病的益生菌复合物，它是先后用壳聚糖和海藻酸钠交替包裹大肠杆菌nissle1917，再由钙离子交联处于最外层的海藻酸钠后得到；所述包裹的总层数为大于2的偶数。如前述的益生菌复合物，所述包裹是将大肠杆菌悬液与壳聚糖或海藻酸钠溶液混合，经孵育、静置、富集菌体得到。如前述的益生菌复合物，它是由如下方法制备得到：(1)准备菌液：取16～24体积份的大肠杆菌nissle1917悬液，富集菌体，3～6体积份的pbs重悬；(2)壳聚糖包裹：将菌液与0.4～0.6体积份的壳聚糖溶液混匀，得混合液；在摇床中孵育7min以上，静置3min以上，富集菌体，3～6体积份的pbs重悬；(3)海藻酸钠包裹：将菌液与0.4～0.6体积份的海藻酸钠溶液混匀，得混合液；在摇床中孵育7min以上，静置3min以上，富集菌体，3～6体积份的pbs重悬；(4)依次重复步骤(2)和(3)，重复次数为4次，得包裹菌体悬液；(5)钙离子交联：将包裹菌体悬液与钙盐溶液混合，得混合液；静置3min以上，富集菌体，即得；步骤(2)所述壳聚糖溶液浓度为0.5～1.5mg/ml；优选的，为1mg/ml；步骤(3)所述的海藻酸钠溶液浓度为1.5～2.5mg/ml；优选的，为2mg/ml；步骤(5)所述混合液中钙离子终浓度为28～xmmol/l，其中xmmol/l为所述钙盐饱和溶液中钙离子浓度；优选地，钙离子终浓度为28.8mmol/l；以上各步骤的摇床孵育温度为25～39℃，摇床震荡频率为10～200rpm。如前述的益生菌复合物，所述大肠杆菌nissle1917在包裹时处在对数生长期。本发明还提供了一种治疗炎症性肠病的益生菌复合物的制备方法，包括如下步骤：(1)准备菌液：取16～24体积份的大肠杆菌nissle1917悬液，富集菌体，3～6体积份的pbs重悬；(2)壳聚糖包裹：将菌液与0.4～0.6体积份的壳聚糖溶液混匀，得混合液；在摇床中孵育7min以上，静置3min以上，富集菌体，3～6体积份的pbs重悬；(3)海藻酸钠包裹：将菌液与0.4～0.6体积份的海藻酸钠溶液混匀，得混合液；在摇床中孵育7min以上，静置3min以上，富集菌体，3～6体积份的pbs重悬；(4)依次重复步骤(2)和(3)，重复次数为4次，得包裹菌体悬液；(5)钙离子交联：将包裹菌体悬液与钙盐溶液混合，得混合液；静置3min以上，富集菌体，即得；步骤(2)所述壳聚糖溶液浓度为0.5～1.5mg/ml；优选的，为1mg/ml；步骤(3)所述的海藻酸钠溶液浓度为1.5～2.5mg/ml；优选的，为2mg/ml；步骤(5)所述混合液中钙离子终浓度为28～xmmol/l，其中xmmol/l为所述钙盐饱和溶液中钙离子浓度；优选地，钙离子终浓度为28.8mmol/l；以上各步骤的摇床孵育温度为25～39℃，摇床震荡频率为10～200rpm。如前所述的制备方法，步骤(1)的体积份数为20；和/或，步骤(1)、(2)或(3)所述的pbs体积份数是4；和/或，步骤(2)的壳聚糖溶液的体积份数是0.5；和/或，步骤(3)的海藻酸钠溶液的体积份数是0.5。如前所述的制备方法，步骤(4)所述重复次数为1。如前所述的制备方法，步骤(5)所述钙盐是氯化钙。如前所述的制备方法，步骤(1)所述大肠杆菌nissle1917处于对数生长期。如前所述的制备方法，步骤(1)所述大肠杆菌nissle1917的od600nm值为0.6。本发明还提供了前述益生菌复合物在制备治疗炎症性肠病药物中的用途。前述的用途中，所述炎症性肠病为结肠炎。本发明具有如下有益效果：1)本发明的复合物中，ecn可以正常生长。2)本发明的复合物在ph值为1.8且存在胃蛋白酶的条件下静置24h保持高达88％以上的ecn存活率。3)本发明的复合物还能可以在模拟的蠕动中的胃内处理24h维持80％以上的ecn存活率。4)本发明的复合物通过口服后，在肠道内仍具有显著的抗炎效果，具体体现在它可以抑制mpo，il-6，tnf-α在血清中的表达，促进il-10和zo-1蛋白的表达，对tnbs模型的大鼠的结肠炎症有改善作用；且该效果显著高于单独的ecn。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明图1：ecn交联包裹示意图；chi1alg1，壳聚糖和海藻酸钠分别包裹1层；chi2alg2，壳聚糖和海藻酸钠分别包裹2层。图2：未包裹的ecn的生长曲线。图3：zeta电位检测。图4：包裹、交联后的ecn的dapi/fitc荧光检测。图5：包裹、交联后的ecn的生长曲线。图6：细菌在模拟胃液中静止状态下的活性检测；标尺长度(bar)，10μm。图7：细菌在模拟胃肠液中震荡状态下的活性检测；标尺长度(bar)，10μm。图8：ecn复合物生物学功能实验设计。图9：不同处理的ecn治疗后各组大鼠的疾病活动指数(dai)变化。图10：不同处理的ecn治疗后各组血清中mpo的含量。图11：不同处理的ecn治疗后各组血清中il-10的含量。图12：不同处理的ecn治疗后各组血清中tnf-α的含量。图13：不同处理的ecn治疗后各组血清中il-6的含量。图14：不同处理的ecn治疗后各组大鼠结肠he染色图片(×400)。图15：不同处理的ecn治疗后各组大鼠结肠免疫组化染色图片(×400)。具体实施方式本部分涉及的试剂与实验动物如下：试剂：海藻酸钠(分子量：198.11，纯度：ar：99％)，壳聚糖(纯度：br：99％)均购于成都西亚试剂有限公司；磷酸盐缓冲液(pbs)，蛋白胨，酵母粉，氯化钠10g，琼脂粉，氯化钙，水合氯醛(w/v，10％)；抗zo-1抗体(santacruzbiotechnology，美国)；抗gapdh抗体(abcam，美国)；抗肌动蛋白抗体(abcam，美国)；hrp.羊抗大鼠igg(武汉博士德生物工程有限公司)；大鼠mpo、il-10、il-6、tnf-αelisa试剂盒均购自于上海bioswap生物技术有限公司。实验动物：sprague-dawley(sd)大鼠(n＝15)，雄性，体重350±60g，购买于四川达硕生物科技有限公司。实施例1本发明ecn复合物的制备方法1.菌体活化将0.5ml的ecn和0.5ml浓度为50％甘油于1.5ml离心管中混匀，保存于-80℃。细菌培养时，在lb固体培养基上平板划线，37℃培养箱过夜培养，再挑取菌落接种于lb液体培养基，于37℃、220rpm/min摇床过夜，再按1∶100的比例扩大培养，置于摇床37℃、220rpm培养。2.壳聚糖-海藻酸钠包裹选择对数生长期的ecn菌液20ml，冷冻离心机中4000rpm、4℃离心5min，弃上清，用5mlpbs洗涤两次后，4000rpm离心3min，弃上清，用4mlpbs重悬细菌。(1)壳聚糖包裹：向重悬液中加入0.5ml1mg/ml的壳聚糖溶液，上下摇晃10s后，置于摇床37℃、150rpm，10min，然后静置5min后，4000rpm离心5min，弃上清。用5mlpbs冲洗两遍，离心3min，弃上清，用4mlpbs重悬细菌。(2)海藻酸钠包裹：向重悬液中加入0.5ml2mg/ml海藻酸钠溶液，上下摇晃10s，置于摇床37℃、150rpm，10min，然后静置5min，离心5min，弃上清。用pbs冲洗两遍，4000rpm、4℃离心3min，弃上清，用4mlpbs重悬。重复上述步骤(1)和(2)，交替包裹壳聚糖和海藻酸钠；包裹一层壳聚糖即为“一层”，在此基础上包裹一层海藻酸钠则为“两层”，再包裹一层壳聚糖即为“三层”，以此类推，得到包裹了偶数层的ecn。“具体实施方式部分”将以包裹四层的ecn(2层壳聚糖和2层海藻胶)为例，介绍本发明的效果。3.氯化钙交联获得包裹四层的ecn，取4800μl，加入200μl8％(w/v)的cacl2。静止5min，离心去上清，交联完成。整个制备过程如图1所示。实施例2包裹前ecn活菌生长对数期判断包裹前，将ecn接种于lb培养基中，37℃、220r/min摇床培养，并在不同时间检测菌液od值，选择对数生长期的菌进行包裹，图中纵坐标代表od值，横坐标为培养的时间，具体步骤如下：1)从平板上挑取单个菌落接种于lb液体培养基中，于37℃、220r/min的摇床中培养至od600nm值为0.6左右。2)ecn的转接种取15支25ml试管，每支加入6mllb液体培养基，按1∶200的比例将菌液培养至od600nm值为0.6左右后分别接种到14支试管中，1支不接种，作为阴性对照。将15支试管于37℃、220r/min的恒温摇床中培养。3)分别于培养的0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13、5、14、14、5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24小时时取出3ml菌液，测定od600nm值。4)以培养时间为横坐标，以od值为纵坐标，绘出ecn在一定条件下的生长曲线。如图2所示，ecn的对数期在培养3～6小时，对应的od值是0.3～0.8。以下将以实验例的形式对本发明做进一步说明。但凡涉及到对比实验的，“包裹菌”、“包裹细菌”、“包裹ecn”、“包裹的菌”或其同义词指包裹了海藻酸钠和壳聚糖、但未交联钙离子的ecn，简写cecn；“交联cacl2菌”、“交联后的菌”、“交联后的ecn”或其同义词指在cecn的基础上再交联钙离子，简写gecn。实验例1zeta电位检测用ξ电位检测仪检测层层包裹0、1、2、3、4、5过程中每一层的电荷，取包裹后菌液，稀释后，用ξ电位检测仪检测层层包裹过程中每一层的电荷，根据每层的正负电荷比，判断其包裹情况，并绘制成图。如图3所示，在包裹过程中，带正电的壳聚糖就会与ecn结合，菌体表面所带负电荷减少，包裹上一层，当加入带负电的海藻酸钠，菌体表面的负电荷有增多，包裹上第二层，zeta电位的波动就代表包裹的层数。实验例2包裹荧光检测运用dapi和fitc标记菌体的方法来检测包裹效率。dapi，即4′，6-二脒基-2-苯基吲哚，一种标记细胞核的荧光染料，因其与dsdna有高度的亲和力，与dna结合后在最大激发波长340nm，最大发射波长488nm条件下时，会发出强烈的蓝色荧光，用于活菌和死菌的染色。fitc，异硫氰酸荧光素，fitc能和各种抗体蛋白结合，结合后的抗体不丧失与一定抗原结合的特异性，并在碱性溶液中具有强烈的黄绿色荧光。通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。用dapi标记未经包裹的裸菌，再用经fitc标记的壳聚糖包裹细菌，标记包裹上的菌体。最后将包裹结束的菌液涂片，置荧光显微镜下观察。先在λex＝340nm/λem＝488nm条件下观察被dapi标记的菌体，再在λex＝485nm/λem＝535nm条件下观察被fitc标记的菌体。两者取相同视野，截图比较菌体着色面积，计算出被包裹上的菌体所占的比例，从而判断包裹效率。具体操作：称取1g壳聚糖加10ml3％醋酸溶于90mlro水中，配成①液；量取10ml①液和10ml1mnacl溶于80mlro水中，其最终浓度为1mg/ml壳聚糖和0.03％醋酸，调ph到6.0-6.5。将上述壳聚糖溶液50ml，在30℃、150rpm恒温震荡培养箱中震荡30min，以vchi∶vfitc＝5∶1加入含fitc45.5ug/ml的pbs溶液，在30℃、150rpm避光反应5h后3000rpm离心10min收集沉淀，用pbs溶液重悬。结果：如图4所示，同一视野中经dapi标记的总菌呈蓝色荧光(a至d)与fitc探针标记的包裹的菌呈绿色荧光(a-1至d-1)所占面积，说明经dapi标记的总菌，与fitc标记包裹上壳聚糖菌的荧光区域大致相同，表明大量ecn是已经被包裹上。实验例3ecn包裹后的生长规律为了探究经壳聚糖和海藻酸钠以及氯化钙交联后，是否对ecn的生长有影响，我们还需对包裹后的ecn的生长情况进行观察。具体操作：1、将包裹后的细菌按一定比例稀释，取15支25ml试管，每支加入6mllb液体培养基，按1∶200的比例将菌液培养至od600nm值为0.6左右后分别接种到14支试管中，1支不接种，作为阴性对照。将15支试管于37℃、220r/min的恒温摇床中培养。2、分别于培养的0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13、5、14、14、5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24小时时取出3ml菌液，测定od600nm值。3、以培养时间为横坐标，以od值为纵坐标，绘出ecn在一定条件下的生长曲线。结果：从图5中可以看出，包裹后的ecn也能正常生长，所以当包裹的菌抵抗胃部环境后，进入到肠道也能在肠道继续生存。实验例4细菌在模拟胃液中静止状态下的活性检测具体操作：在三个离体的兔子的胃中加入5ml模拟胃液(取质量分数16％的稀盐酸16.4ml，加水800ml与胃蛋白酶10g，摇匀后加水稀释成1000ml，测定最终ph值是1.8)再分别将所制备的包裹细菌、交联cacl2菌和裸菌加入胃液中，放37℃培养箱中培养，分别在0h、4h、8h、12h、24h时取出进行荧光染色在荧光显微镜下观察两者的活率并进行比较。结果：如表1所示，模拟胃液中交联ecn不会轻易被胃酸消化。表1模拟胃液中ecn的存活率0h4h8h12h24h裸ecn99.73％52.72％34.17％27.63％18.35％包裹ecn99.42％86.53％82.29％75.87％67.62％交联ecn99.61％96.44％92.13％89.58％88.36％第24h的染色结果如图6所示，在静止胃液中，随着时间的延长包裹菌的存活率明显大于裸菌，交联了氯化钙的ecn的存活率也略高于包裹的菌，但结果在静止胃液中不是特别明显。pi染色后死菌呈现红色，表明在静止胃液中，交联氯化钙的ecn死亡的菌低于包裹的，包裹的菌的死亡数又低于未包裹的裸菌。实验例5细菌在模拟胃液中震荡状态下的活性检测具体操作：同样在三个离体的兔子的胃中加入5ml模拟胃液(同实施例4中的模拟胃液)再分别将制备的包裹细菌(cecn)、交联cacl2菌(gecn)和裸菌(ecn)加入胃液中，并加入玻璃砂同时使胃产生蠕动效果(胃外加入一些大的珠子，在摇床的带动下可以不停的挤压胃)放在37℃，144r/min的恒温摇床中培养，分别在0h、4h、8h、12h、24h时取菌液进行染色和平板计数，计算出两者的活率并进行比较。结果：如表2所示，交联菌在震荡情况下的胃液中存活率较高。表2震荡状态下模拟胃液中ecn的存活率0h4h8h12h24h裸ecn99.73％33.37％14.47％7.45％1.86％包裹ecn99.42％71.26％57.31％45.82％37.62％交联ecn99.61％93.16％92.68％86.74％82.57％第24h的染色结果如图7所示，交联了氯化钙的ecn在静止和震荡的胃液中的存活量差别不大，而包裹的ecn在静止和震荡得胃液中，震荡情况下ecn的存活量明显下降，说明经包裹的菌不耐机械摩擦，而交联了cacl2的菌更能抵抗机械力的损害。所以在包裹后再交联上氯化钙，更能在胃部环境更好地保护ecn菌。实验例6动物实验1.实验分组采用三硝基苯磺酸(tnbs)构建大鼠结肠炎模型，然后采用酶联免疫吸附试验(elisa)、he和免疫组化等方法探究口服不同形式的ecn后的抗炎效果，以此验证lbl包裹ecn的生物学功能。实验分为5组：a)健康组，直肠灌注25％的乙醇溶液(1ml/rat)，直肠灌注酒精的前后一周以2.0ml/rat/daypbs灌胃。b)pbs治疗组，直肠灌注tnbs(1ml/rat)，直肠灌注tnbs的前后一周以2.0ml/rat/daypbs灌胃。c)裸ecn组，直肠灌注tnbs(1ml/rat)，直肠灌注tnbs的前后一周以ecn灌胃。d)包裹ecn治疗组(ecn@chi/sa)，直肠灌注tnbs(1ml/rat)，直肠灌注tnbs的前后一周以ecn@chi/sa灌胃。e)交联后的ecn治疗组(ecn@chi/sa-ca)，直肠灌注tnbs(1ml/rat)，直肠灌注tnbs的前后一周以ecn@chi/sa-ca灌胃。各灌胃治疗组中ecn的数量为107cfu/天。预防治疗2周后处死大鼠，收集血液样本，离心，取血清分析mpo，tnf-α，il-6和il-10的表达水平；同时取结肠，部分于10％中性甲醛固定，进行he和免疫组化染色，观察炎症细胞的表达，验证ecn对结肠炎的治疗情况。实验设计思路如图8所示。2.大鼠疾病活动指数评测炎症性肠病(ibd)包括克罗恩病(cd)和溃疡性结肠炎(uc)，是一类临床表现复杂、治疗困难的疾病。根据临床表现难以作出准确而全面评价，因此各国专家制定出疾病活动指数(diseaseactivityindexdai)，以判断疾病活动性，指导治疗、观察疗效和判断预后。方法：根据表1指标对大鼠疾病活动指数进行测评，并以公式1进行dai值的计算。应用spss19.0统计软件包对结果数据进行分析，用均数±标准差(x±s)表示结果。采用独立样本t检验进行两组数据间的比较，采用单因素方差进行多组数据间比较分析，相关性用双变量分析，采用κ2检验计数资料，logistic法回归分析。p＜0.05认为有显著性差异。表1大鼠疾病活动指数监测指标dai值＝(体重下降百分率+大便形状+出血情况)/3(公式1)结果：结果如图9所示。给予tnbs后10-24h，pbs治疗组，裸ecn组，包裹ecn治疗组以及交联后的ecn治疗组开始出现明显的腹泻，不活动和厌食等症状。治疗后第4天pbs治疗组和裸ecn组dai评分明显高于健康组(p＜0.05)，稍高于包裹ecn治疗组和交联后的ecn治疗组(p＜0.05)说明有统计学差异。第6天，包裹ecn治疗组和交联后的ecn治疗组的dai评分明显低于pbs治疗组和裸ecn组，裸ecn组的dai评分与pbs治疗组无明显差别。(p＜0.01)说明有统计学显著差异。第7天，裸ecn组的dai评分与pbs治疗组无明显差别，pbs治疗组和裸ecn组的dai评分都高于包裹ecn治疗组和交联后的ecn治疗组(p＜0.05)说明有统计学差异。3.髓过氧物酶(mpo)检测mpo又称髓过氧化物酶，通常作为评价炎症程度指标，它的可以活性反应中性粒细胞的浸润。方法：使用ratmyeloperoxidase(mpo)elisakit检测试剂盒检测mpo，参考其说明书进行，具体包括：(1)配制80ng/ml，40ng/ml，20ng/ml，10ng/ml，0ng/ml和0ng/ml6个浓度梯度的标准品。将不同浓度的标准品各吸取50μl加入酶标包被板(2)先后将40μl样品和10μl生物素标记的抗mpo抗体加入酶标包被板中，样品、酶标试剂及生物素标记的抗mpo抗体不加入空白对照孔，其余各步操作相同。(3)温育酶标包被板30分钟，37℃。(4)弃去酶标包被板中液体，用稀释后的洗涤液洗涤酶标包被板，重复5次。(5)每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。(6)操作同第3步相同。(7)操作同第5步相同。(8)先后加入a.b显色剂50μl，37℃避光显色15分钟。(9)加入终止液50μl，终止反应。10.采用酶标仪在450nm波长测得各孔的吸光度(od值)。实验结果计算：以标准物的浓度为纵坐标，od值为横坐标，得到mpo标准曲线的直线回归方程式为y＝83.803x-0.5087(r2＝0.9916)，在方程式中带入样品的od值，得到样品浓度，即为样品的实际浓度。结果：如图10所示，pbs治疗组血清中的mpo含量为22.04ng/ml，健康组为16.678ng/ml，pbs治疗组血清中的mpo含量比健康组高(p＜0.05)，有统计学差异。交联后的ecn治疗组中，mpo含量为17.844ng/ml，低于包裹ecn治疗组和裸ecn组，血清mpo含量分别为19.772ng/ml和19.988ng/ml(p＜0.05)说明包裹和交联有助于保护ecn免受胃环境的破坏，具有较高的生物学活性。4.il-10检测il-10作为一种具有广泛生物学作用的细胞因子能够抑制多种炎症因子的分泌，作为生物体对肠黏膜炎症因子失衡一种反馈机制，即有抗炎作用。方法：使用ratinterleukin10(il-10)elisakit，按照操作说明检测样品中的od值，并绘制标准曲线。标准曲线绘制：配制480pg/ml，240pg/ml，120pg/ml，60pg/ml，30pg/ml，0pg/ml的6个浓度梯度的标准品，采用酶标仪在450nm波长测得各孔的吸光度(od值)，得到il-10的标准曲线。y＝464.15x-20.952(r2＝0.9977)。在方程式中带入样品的od值，得到样品浓度，即为样品的实际浓度。结果：如图11所示，pbs治疗组血清中的il-10含量为96.942pg/ml，健康组为25.897pg/ml，pbs治疗组血清中的il-10含量比健康组高(p＜0.05)，有统计学差异。交联后的ecn治疗组中，il-10含量为186.059pg/ml，高于包裹ecn治疗组和裸ecn组，血清il-10含量分别为170.742pg/ml和106.225pg/ml(p＜0.05)。说明包裹和交联有助于保护ecn免受胃环境的破坏，具有较高的生物学活性。5.tnf-α检测tnf-α(肿瘤坏死因子)是一种促炎症因子，它在血清中的表达水平与急性结肠炎密切相关。方法：使用rattumornecrosisfactorα(tnf-α)elisakit，按照操作说明检测样品中的od值，并绘制标准曲线。标准曲线绘制：配制640pg/ml，320pg/ml，160pg/ml，80pg/ml，40pg/ml，0pg/ml的6个浓度梯度的标准品，采用酶标仪在450nm波长测得各孔的吸光度(od值)，得到tnf-α的标准曲线，y＝374.63x-15.923(r2＝0.9912)。在方程式中带入样品的od值，得到样品浓度，即为样品的实际浓度。结果：如图12所示，pbs治疗组血清中的tnf-α含量为132.805pg/ml，健康组为50.068pg/ml，pbs治疗组血清中的tnf-α含量比健康组高(p＜0.05)，有统计学差异。交联后的ecn治疗组中，tnf-α含量为100.962pg/ml，低于包裹ecn治疗组和裸ecn组，血清tnf-α含量分别为124.938pg/m；和125.209pg/ml(p＜0.05)说明包裹和交联有助于保护ecn免受胃环境的破坏，具有较高的生物学活性。6.il-6检测il-6是敏感反映机体炎症和组织损伤严重程度的重要指标，中性粒细胞的活化，聚集可以被其促进。方法：使用ratinterleukin-6(il-6)elisakit，按照操作说明检测样品中的od值，并绘制标准曲线。标准曲线绘制：配制480pg/ml，240pg/ml，120pg/ml，60pg/ml，30pg/ml，0pg/ml的6个浓度梯度的标准品，采用酶标仪在450nm波长测得各孔的吸光度(od值)，得到il-6的标准曲线，y＝547.81x-17.332(r2＝0.9955)。在方程式中带入样品的od值，得到样品浓度，即为样品的实际浓度。结果：图13所示，pbs治疗组血清中的il-6含量为102.638pg/ml，健康组为17.64pg/ml，pbs治疗组血清中的il-6含量比健康组高(p＜0.05)，有统计学差异。交联后的ecn治疗组中，il-6含量为58.266pg/ml，低于包裹ecn治疗组和裸ecn组，血清il-6含量分别为78.891pg/ml和102.091pg/ml(p＜0.05)说明包裹和交联有助于保护ecn免受胃环境的破坏，具有较高的生物学活性。7.结肠的he和免疫组化染色(1)he染色治疗后14天，取各治疗组大鼠结肠进行he染色。结果如图14所示，与健康组大鼠结肠相比较，pbs治疗组中的肠上皮损伤严重，粘膜下层有大量的中性粒细胞浸润，黏膜及腺体脱落，裸ecn组和包裹ecn治疗组的肠黏膜璧增厚，有明显的水肿，依然有大量炎性细胞浸润，而交联后的ecn治疗组的肠粘膜除有少量的炎性细胞浸润之外，与健康组相比无明显的病理学改变。(2)紧密连接蛋白zo-1免疫组化染色紧密连接蛋白zo-1是各种组织紧密连接屏障功能和通透性功能的评价指标，当肠黏膜屏障受损坏时，zo-1的表达量会降低。取治疗后的结肠组织切片用4％多聚甲醛固定进行石蜡包埋。石蜡块切成4μm切片。向切片加正常山羊血清28℃放置20min，封闭内源性过氧化氢酶然后将切片用pbs洗涤。用抗zo-1抗体(1∶200稀释)浸润切片4℃过夜。切片用pbs洗涤三次，每次5分钟，并与hrp标记的山羊抗兔igg二抗孵育1小时。最后，用dab溶液显色，并用苏木精进行复染。用抗肌动蛋白抗体孵育的切片作为阳性对照，将切片孵育在0.01mol/lpbs(ph7.4)中，代替抗zo-1抗体溶液，作为阴性对照。图15所示的免疫组化染色结果表明，ihc染色结果可以看到在结肠上皮表面上方的上皮细胞及其隐窝之间存在zo-1(棕黄色)。在pbs治疗组中，结肠zo-1表达显著降低。交联后的ecn治疗组的结肠zo-1的表达增加。裸ecn组和包裹ecn治疗组结肠中zo-1与pbs治疗组相比，差距不大，都比健康组中zo-1的表达量少。说明交联后的ecn相比裸菌和包裹后的ecn，具有更为优越的耐胃微环境的能力，从而具有较好的生物学活性。综上，本发明使用层层自组装的方法，将ecn包裹在壳聚糖和海藻酸钠中，然后通过氯化钙交联，增强其对机械摩擦的耐受性。经壳聚糖和海藻酸钠包裹和氯化钙交联后，ecn具有良好的生长性能；且能抵抗胃内低ph和机械摩擦，保持细菌存活率在70％以上；进而起到良好的体内(肠道内)抗炎作用。当前第1页12