一种布渣叶黄酮总苷及其制备方法和应用与流程

本发明属于中药、天然药物技术领域，具体涉及一种布渣叶黄酮总苷及其制备方法和应用。

背景技术：

随着高脂高糖饮食的日渐常态化，籍此诱发的非酒精性脂肪肝病（non-alcoholicfattyliverdisease，nafld）的发病率正逐年提高，且有低龄化发展趋势。nafld已成为世界范围内的常见慢性肝病之一。nafld一般是指由肝细胞中过多的脂肪沉积造成的肝脏脂肪变性，严重时会伴有肝细胞损伤和肝脏炎症与纤维化。由于nafld的发病机制较为复杂，目前尚无特异、高效的治疗药物和方案，普遍的做法是控制饮食与药物干预。由于nafld往往伴随着肝脏内脂肪沉积、脂代谢紊乱、高脂血症和不同程度的炎症，近期降脂、抗炎治疗也成为nafld的研究热点。nafld的治疗药物主要包括降脂类药物、抗氧化类药物、胰岛素增敏剂类药物和抗炎类药物等。这些药物的作用原理主要是通过减轻肥胖、降低血脂、改善胰岛素抵抗、维持体内脂质代谢平衡等方式来改善代谢综合征，从而控制nafld的发展。

近年来，天然药物，尤其是药食同源性植物提取物，以其副作用小的优势成为nafld预防和治疗药物研究中的热点。其中，许多植物类黄酮提取物以其具有的抗氧化、清除自由基、抑菌、抗炎、免疫调节等生物活性，被广泛地深入研究和开发。因此，基于饮食诱导的nafld动物模型，从药食两用资源中去寻找和发现具有防治nafld的天然药物（植物药），以及具有增强肝脏糖脂代谢韧性的功能性膳食补充剂，有着重要的科学意义和应用价值。

布渣叶为椴树科植物破布叶（microcospaniculatal.）的干燥叶，具有消食化积、清热利湿的功效，用于饮食积滞、感冒发热、湿热黄疸等。布渣叶化学成分比较复杂，研究发现主要含有黄酮类、生物碱、三萜类、挥发油类等化合物，其中黄酮类化学成分主要有牡荆苷、异牡荆苷、水仙苷等。cn102836188b公开了布渣叶总黄酮提取物在降血脂药物中的应用。经检索，尚未发现关于布渣叶黄酮总苷在制备防治nafld药物以及增强肝脏糖脂代谢韧性的功能性膳食补充剂中的应用。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于提供一种布渣叶黄酮总苷，经实验验证，该布渣叶黄酮总苷能对高脂高果糖饮食诱导肥胖大鼠的肝脏脂肪变性和炎症起到保护作用。

本发明的再一目的在于提供上述布渣叶黄酮总苷的制备方法。

本发明的另一目的在于提供布渣叶黄酮总苷的新应用。

本发明是通过以下技术方案实现；

一种布渣叶黄酮总苷，黄酮苷类化合物占布渣叶黄酮总苷质量的50%以上，所述黄酮苷类化合物包含黄酮碳苷和黄酮氧苷，其中，黄酮碳苷占布渣叶黄酮总苷质量的30~50%，黄酮氧苷占布渣叶黄酮总苷质量的10~20%。

可以通过高效液相色谱法对本发明布渣叶黄酮总苷中上述各组分进行定性和定量分析。作为本发明一个优选的技术方案，所述黄酮碳苷包括至少如下六种组份：维采宁-ii，牡荆苷，异牡荆苷，夏胡塔苷，异夏胡塔苷和异佛莱心苷；所述黄酮氧苷包括至少如下三种组份：紫云英苷，烟花苷和水仙苷。

作为本发明进一步优选的技术方案，基于布渣叶黄酮总苷的总质量，各组分含量分别为：维采宁-ii1-5%，夏胡塔苷0.5-4%，异夏胡塔苷1-5%，牡荆苷5-15%，异牡荆苷6-15%，异佛莱心苷15-25%，烟花苷2-6%，紫云英苷0.5-4%，水仙苷5-12%。

本发明还提供了上述的布渣叶黄酮总苷的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

以水为提取溶剂，将布渣叶加热回流提取，提取液浓缩后经大孔树脂吸附，依次用水、

质量浓度为10%和70%乙醇顺序洗脱，将70%乙醇洗脱液浓缩后用甲醇溶解，再经制备色谱分离，以水和甲醇梯度洗脱，收集含黄酮苷的洗脱液，浓缩、干燥得到布渣叶黄酮总苷。

为了充分提取有效成分，布渣叶与水的质量体积比可以控制在1：10-15，加热回流提取1-2次，每次1-2小时。

为了保证较好的吸附效果，本发明所述的大孔树脂可以优选为d101或ab-8大孔树脂。

本发明的加热回流提取液浓缩后，离心，取上清液，经大孔树脂吸附，依次用水、质量浓度为10%和70%乙醇顺序洗脱，收集70%乙醇洗脱液，减压浓缩后得到布渣叶总黄酮，然后用适量的甲醇溶解，再经制备色谱（c18填料）分离，以水和甲醇梯度洗脱，280nm波长检测，收集含黄酮苷的洗脱液，浓缩、干燥即得布渣叶黄酮总苷。本发明所述的干燥可以为喷雾干燥或真空干燥。最后将所得布渣叶黄酮总苷采用hplc进行定性、定量分析，可以准确的得到各组分的种类和含量，为进一步药效研究奠定了基础。

其中，水和甲醇梯度洗脱的色谱柱为(φ21.2mm×250cm,10μm)；流速为21.4ml/min，水（a）和甲醇（b）洗脱程序为：0~12min,82%→70%(a);10~22min,70%→45%(a);22~40min,45%→30%(a);40~45min，30%→20%(a)。

本发明的制备方法采用大孔树脂富集后再经制备色谱分离，最后产物经hplc进行定性、定量分析，得到布渣叶黄酮总苷中含有不少于50%质量百分比的黄酮苷类化合物，经进一步分析，黄酮苷类化合物主要包含黄酮碳苷和黄酮氧苷，其中，黄酮碳苷占布渣叶黄酮总苷质量的30~50%，黄酮氧苷占布渣叶黄酮总苷质量的10~20%。

本发明将上述布渣叶黄酮总苷，进行了生物活性评价研究，采用高脂高果葡糖浆（hfhf，high-fathigh-fructosecornsyrup）饮食诱导的sd（spraguedawley）大鼠非酒精性脂肪肝（nafld，non-alcoholicfattyliverdisease）模型，通过测定肝脏组织ast和alt酶活性，肝脏组织tg/tc含量，血清和肝脏组织tnf-α、il-6和il-1β等炎症因子，以及肝组织病理学观察等指标证实布渣叶黄酮总苷（mptfg，microcospaniculatatotalflavoneglycosides）有有效治疗或缓解饮食诱导nafld模型大鼠肝脏脂肪变性，能显著减轻模型大鼠代谢性炎症，提示布渣叶黄酮总苷（mptfg）可用于饮食诱导nafld的防治和代谢性炎症药物或增强肝脏糖脂代谢韧性功能性膳食补充剂的开发，极具开发价值。

本发明还提供了上述布渣叶黄酮总苷在制备防治或治疗饮食诱导肝脏脂肪变性药物中的应用。

本发明还提供了上述的布渣叶黄酮总苷在制备防治或治疗饮食诱导肝脏慢性炎症药物中的应用。

本发明以制备得到的布渣叶黄酮总苷为活性成分，加上药学上可接受的辅料，制备成防治饮食诱导肝脏脂肪变性或代谢性炎症的药物剂型，适宜的剂型可以为片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、丸剂、散剂等。

本发明还提供了上述的布渣叶黄酮总苷在制备增强肝脏糖脂代谢韧性功能性膳食补充剂中的应用。

本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：

本发明的布渣叶黄酮总苷中含有不少于50%质量百分比的黄酮苷类化合物，其中，黄酮碳苷占布渣叶黄酮总苷质量的30~50%，黄酮氧苷占布渣叶黄酮总苷质量的10~20%；所得的布渣叶黄酮总苷经实验验证其能有效改善hfhf饮食所致大鼠肝组织脂肪变性，能显著减轻模型大鼠代谢性炎症，且所得的黄酮总苷源于药食同源植物，安全可靠，无毒副作用，可作为活性成分应用于制备防治饮食诱导nafld或代谢性炎症药物以及增强肝脏糖脂代谢韧性功能性膳食补充剂。

附图说明

图1为实施例1制备方法流程图；

图2为布渣叶黄酮总苷（mptfg）hplc色谱图，其中各色谱峰分别为：（1.维采宁-ii；2.异夏佛塔苷；3.夏佛塔苷；4.牡荆苷；5.异牡荆苷；6.异佛莱心苷；7.烟花苷；8.紫云英苷；9.水仙苷）；

图3为实施例2的给药方案流程图；

图4为实施例2中布渣叶黄酮总苷对sd大鼠体脂率及皮下脂肪组织形态学的影响图；

图5为实施例2中布渣叶黄酮总苷改善饮食诱导肥胖大鼠的肝组织病理学变化图；

图6为实施例2中布渣叶黄酮总苷减轻饮食诱导肥胖大鼠的肝脏脂质蓄积柱形图；

图7为实施例2中布渣叶黄酮总苷改善肝脏代谢功能柱形图；

图8为实施例2中布渣叶黄酮总苷减轻饮食诱导肥胖大鼠肝脏组织炎症柱形图；

图9为实施例3的给药方案流程图；

图10为实施例3中布渣叶总黄酮苷对sd大鼠体脂率及皮下脂肪组织形态学的影响图；

图11为实施例3中布渣叶黄酮总苷改善饮食诱导肥胖大鼠的肝组织病理学变化图；

图12为实施例3中布渣叶黄酮总苷减轻饮食诱导肥胖大鼠的脂代谢异常柱形图；

图13为实施例3中布渣叶黄酮总苷改善肝脏代谢功能柱形图；

图14为实施例3中布渣叶黄酮总苷减轻饮食诱导肥胖大鼠肝脏组织炎症柱形图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明具体的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。

实施例1：

如图1所示：一种布渣叶黄酮总苷的制备方法，包括如下步骤：

取4kg布渣叶，加50l去离子水，加热回流提取2次，每次2小时；提取液减压浓缩到8l，离心，取上清液上d101或ab-8大孔树脂柱吸附，接着用去离子水、10%、70%、95%乙醇顺序洗脱，将70%乙醇洗脱液减压浓缩，得布渣叶总黄酮，用适量甲醇溶解；再经制备色谱分离（c18填料）水和甲醇梯度洗脱，280nm波长检测，收集含黄酮苷的洗脱液，浓缩并喷雾干燥得到布渣叶黄酮总苷（mptfg），并用hplc进行定性、定量分析。

其中，水和甲醇梯度洗脱的色谱柱为(φ21.2mm×250cm,10μm)；流速为21.4ml/min，水（a）和甲醇（b）洗脱程序为：0~12min,82%→70%(a);10~22min,70%→45%(a);22~40min,45%→30%(a);40~45min，30%→20%(a)。

hplc进行定性、定量分析的色谱条件为：kromasilc18柱（250mm×4.6mm,5μm）；流动相为甲醇（a）和水（0.2%磷酸，b），流速为1ml/min。梯度洗脱程序：0-10min，80%→68%（b）；10-26min，68%→64%（b）；26-40min，64%→55%（b）；40-50min，55%→20%（b）；进样量10μl，检测波长280nm，柱温35℃。

如图2所示，经过定性分析，上述得到的布渣叶黄酮总苷（mptfg）中，主要化合物的结构式如下：

经过定量分析，按质量百分数计，上述得到的布渣叶黄酮总苷（mptfg）中，黄酮苷类化合物占布渣叶黄酮总苷质量的50%以上，其中，黄酮碳苷占布渣叶黄酮总苷质量的30~50%，黄酮氧苷占布渣叶黄酮总苷质量的10~20%。各化合物的含量如下：维采宁-ii（1，2.9±0.6%），夏胡塔苷（2，1.6±0.7%），异夏胡塔苷（3，2.9±0.4%），牡荆苷（4，10.1±0.6%），异牡荆苷（5，11.5±0.8%），异佛莱心苷（6，19.7±1.8%），烟花苷（7，3.7±1.1%），紫云英苷（8，1.7±0.8%），水仙苷（9，8.7±1.2%）。

实施例2：布渣叶黄酮总苷（mptfg）预防给药改善饮食诱导肥胖大鼠肝脏脂肪变性和炎症

实验药品与试剂

总胆固醇（tc）、甘油三酯（tg）、谷丙转氨酶（alt）和谷草转氨酶（ast）试剂盒购自上海荣盛生物药业有限公司。大鼠肿瘤坏死因子α(tnf-α)、大鼠白介素1β(il-1β)和大鼠白介素6(il-6)elisa试剂盒由武汉华美生物工程有限公司提供。

实验动物

健康雄性spraque-dawley大鼠24只，5周龄，体重130-150g，spf级，购自广东省实验动物中心，许可证号：scxk（粤）2013-0002，合格证号：no.44007200052450。动物饲养在广东药科大学实验动物中心spf级动物房。动物饲养温度：20~25℃，湿度：40%-70%，12h:12h昼夜间断照明；自由进食饮水。

所有动物在适应性喂养1周后，根据大鼠体重、血糖、tg、tc等指标分为对照组（cont，n=7）、高脂高果糖模型组（hff，n=9）和预防给药组（hff_tfg，n=8）。对照组给予维持饲料和饮用水，高脂高果糖模型组给予脂肪含量60%的高脂饲料和12.5%的果葡糖浆饮水，预防给药组给予脂肪含量60%的高脂饲料和12.5%的果葡糖浆饮水，同时灌胃给药mptfg，具体给药方案如图3所示。

实验方法

实验结束时，将大鼠麻醉，腹主动脉取血样；同时取大鼠肝脏、腹股沟皮下脂肪，称重，将其中一部分用4%多聚甲醛保存用于组织切片，其余部分-80℃冰箱冻存。

取相同部位的肝小叶，经常规4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋，切片，h&e染色，光镜下观察。血清ast和alt含量，肝脏组织tg、tc和炎症因子tnf-α、il-1β、il-6等均使用商品试剂盒，根据说明书进行测定。

所有数据均采用平均值±标准差(`x±sd)表示。采用spss22.0软件进行统计分析，比较两组间的差异采用独立样本t检验分析，以p<0.05表示两组间差异有统计学意义。

实验结果

转氨酶是肝脏正常运转过程中必不可少的“催化剂”，且肝细胞是转氨酶的主要生存地。当肝细胞发生炎症、中毒、坏死等时会造成肝细胞的受损，转氨酶便会释放到血液里，使血清转氨酶升高。转氨酶的种类很多，其中以谷丙转氨酶（alt）和谷草转氨酶（ast）最为重要。通过肝脏alt和ast测定结果的比较发现，与cont组相比，hff组血清alt和ast明显上升，说明肝细胞受损。而在mptfg的干预下，alt和ast显著降低且具有统计学意义（p<0.05）（图7），提示mptfg对饮食诱导肥胖大鼠的肝脏有保护作用。

在预防性干预实验过程中，实施例中采用随着体重的增加而逐步加大给药剂量的策略，对于hff组和hff_tfg组大鼠，通过对肝脏、脂肪的组织病理学观察（图4-5），发现mptfg可降低sd大鼠的肝重指数，减轻肝脏脂肪变性；同时降低了肝脏中tg、tc含量，改善肝脏脂质蓄积（图6）。通过肝脏alt和ast测定结果的比较发现，与cont组相比，hff组大鼠血清alt和ast明显上升，而在mptfg的干预下显著降低，提示mptfg具有保肝作用（图7）。同时，与cont组相比，在高脂高果糖饮食条件下，hff组大鼠肝脏炎症因子il-6和il-1β浓度均显著升高；而hff组与hff_tfg组相比，除了tnf-α外，肝脏炎症因子il-6和il-1β浓度均有显著性下降（图8）。说明高脂高糖饮食诱发肥胖大鼠肝脏炎症，而mptfg具有改善肝脏炎症的作用。

实施例3：布渣叶黄酮总苷（mptfg）治疗饮食诱导肥胖大鼠肝脏脂肪变性和炎症

实验药品与试剂

总胆固醇（tc）、甘油三酯（tg）、谷丙转氨酶（alt）和谷草转氨酶（ast）试剂盒为上海荣盛生物药业有限公司产品。大鼠肿瘤坏死因子α(tnf-α)、大鼠白介素1β(il-1β)和大鼠白介素6(il-6)elisa试剂盒由武汉华美生物工程有限公司提供。

实验动物

健康雄性spraque-dawley大鼠24只，5周龄，体重130-150g，spf级，购自广东省实验动物中心，许可证号：scxk（粤）2013-0002，合格证号：no.44007200052450。动物饲养在广东药科大学实验动物中心spf级动物房。动物饲养温度：20~25℃，湿度：40%-70%，12h:12h昼夜间断照明；自由进食饮水。

适应性喂养1周后，根据大鼠体重、血糖、tg、tc等指标分为对照组（cont，n=7）和高脂高果糖组（hff，n=17）；对照组给予维持饲料和饮用水，高脂高果糖组给予脂肪含量60%的高脂饲料和12.5%的果葡糖浆饮水。在12周后，再依据体重、血糖、tg等指标将hff组分成高脂高果糖组（hff，n=9）和治疗给药组（hff-tfg，n=8）；高脂高果糖模型组继续给予脂肪含量60%的高脂饲料和12.5%的果葡糖浆饮水，治疗给药组给予脂肪含量60%的高脂饲料和12.5%的果葡糖浆饮水，同时灌胃给药mptfg，具体给药方案如图9所示。

实验方法

实验结束时，将大鼠麻醉，腹主动脉取血样；同时取大鼠肝脏、腹股沟皮下脂肪，称重，将其中一部分用4%多聚甲醛保存用于组织切片，其余部分-80℃冰箱冻存。

取相同部位的肝小叶，经常规4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋，切片，h&e染色，光镜下观察。血清ast和alt含量，肝脏组织tg、tc和炎症因子tnf-α、il-1β、il-6等均使用商品试剂盒，根据说明书进行测定。

所有数据均采用平均值±标准差(`x±sd)表示。采用spss22.0软件进行统计分析，比较两组间的差异采用独立样本t检验分析，以p<0.05表示两组间差异有统计学意义。

实验结果

在治疗性干预实验过程中，实施例中采用120mg/kg体重的给药剂量，对于hff组和hff_tfg组大鼠，通过对肝脏、脂肪组织的病理切片观察（图10-11），发现布渣叶黄酮总苷可降低sd大鼠的肝重指数，减轻肝脏脂肪变性；同时降低了肝脏中tg、tc含量，改善肝脏脂质蓄积（图12）。通过肝脏alt和ast测定结果的比较发现，与cont组相比，hff组大鼠血清alt和ast明显上升，而在布渣叶总黄酮苷的干预下显著降低，提示布渣叶总黄酮苷具有保肝作用（图13）。同时，与cont组相比，在高脂高果糖饮食条件下，hff组大鼠肝脏炎症因子il-6和il-1β浓度均显著升高；而hff组与hff_tfg组相比，除了tnf-α外，肝脏炎症因子il-6和il-1β浓度均有显著性下降（图14）。说明高脂高果糖饮食诱发肥胖大鼠肝脏炎症，而布渣叶总黄酮苷具有改善肝脏炎症的作用。

综上，本发明通过饲喂60%高脂饲料联合12.5%果葡糖浆饮水，成功诱导了sd肥胖大鼠的肝脏脂肪变性和炎症模型；通过动物实验，证实了无论在预防性干预，还是在治疗性干预的情形下，布渣叶黄酮总苷mptfg均能对高脂高果糖饮食诱导肥胖大鼠的肝脏脂肪变性和炎症起到保护作用。因此，布渣叶总黄酮苷可作为防治或治疗饮食诱导肝脏脂肪变性和炎症药物进行开发，或用作增强肝脏代谢韧性的功能性膳食补充剂进行开发。