具抗人类酵母菌功能的兰花萃取物及其组合物的制作方法

本发明属于天然提取物技术领域，具体涉及具抗人类酵母菌功能的兰花萃取物及其组合物。

背景技术：

兰科植物是被子植物的最大科之一，全世界约有700属20000种，广泛分布于除两极和极端干旱沙漠地区以外的各种陆地生态系统中，热带地区分布最多。我国兰科植物为194属1388种，在全国各省市、自治区均有分布，主要集中于我国的西南地区和台湾地区，尤以喜马拉雅山脉东段、横断山脉地区、西双版纳地区，滇东-桂西山地、台湾东部山地、海南岛南部、黔桂交界山区、鄂西渝东山地、秦岭伏牛山一带最为丰富。在兰科植物中有很多珍稀的药用植物，如天麻(gastrodiaelata)、金线莲、金钗石斛、山慈菇等都是具有较高的药用价值的品种。兰科植物具有清热解毒、活血调经、润肺化痰、生津止渴、止血、敛疮的功效。兰科植物资源广泛，药用价值高，然而在2015年版药典中收录的仅有白及、天麻、金钗石斛、石斛和山慈菇5个兰科药材。在兰科植物中菲类化合物分布较广泛，此外还含有黄酮、甾醇、三萜、小分子酚酸、蒽醌、多糖类化合物。目前为止，对于兰科植物详细的化学成分研究的主要集中在白及属、杜鹃兰属、独蒜兰属、石斛属、金石斛属、毛兰属、贝母兰属、石仙桃属、石豆兰属、手参属、天麻属、开唇兰属、竹叶兰属、绶草属的一些种。菲类的生理活性，除早期发现的的抗菌活性外，近年来又发现一些菲类化合物有抗肿瘤作用、抗病毒作用、抗炎作用、抗变态反应、降血脂等多种生理活性。这与兰科植物的抗菌、抗癌、镇咳平喘、降血脂、抗氧化等作用基本吻合。可以说，菲类化合物是兰科植物的特征性成分。

酵母菌是一种常见的条件致病菌，在真菌门传统分类系统中，分属于子囊菌亚门、担子菌亚门和半知菌亚门，其包括4种类型，有56个属，五百多个种。酵母菌不仅广泛分布于自然界，也存在于人体的各个不同部位。而其中以白假丝酵母菌为最为常见的致病菌，它主要定植于皮肤和黏膜，如口腔、胃肠道、阴道等处，正常情况下不致病。当机体免疫力下降时，则可导致特定组织器官及深部组织的念珠菌感染，如白假丝酵母菌常引起急性假膜型念珠菌性口炎和义齿性口炎。在人类免疫缺陪病罹患者中，系统性念珠菌感染会导致高达76％的死亡率。同时，白假丝酵母菌也同时是医院获得性感染最常化的病原真菌。申请号为201710585961.7的发明专利申请提供一种兰花萃取物包含至少一抗人类酵母菌成分，而该萃取物萃取自一兰花部位，且该抗人类酵母菌成分具有抗人类酵母菌的活性。一种兰花萃取物添加产品为将该兰花萃取物添加于一原材料内，以制成一抗人类酵母菌组成物。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种不仅具有光谱抑菌能力，而且对人类酵母菌能够发挥优良的抗菌效果，尤其对白假丝酵母菌的抑菌效果更有效，能够有效预防或治疗牙周炎症，且具有防止蛀牙、抑制牙菌斑、美白牙齿作用的具抗人类酵母菌功能的兰花萃取物。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

具抗人类酵母菌功能的兰花萃取物，包含至少一具有抗人类酵母菌活性的化合物，其结构式如(i)所示：

上述化合物具有抗白假丝酵母菌的活性。

本发明兰花萃取物中含有具有抗人类酵母菌活性的化合物，不仅具有光谱抑菌能力，而且对人类酵母菌能够发挥优良的抗菌效果，尤其对白假丝酵母菌的抑菌效果更有效，能使白假丝酵母菌生物被膜细胞呈现不同程度的核固缩、核碎裂或颗粒状荧光等现象，损害线粒体功能，使其电位降低，提升白色念珠菌生物被膜细胞内ros的水平，激活了耐药白假丝酵母菌细胞内的metacaspase活性，提升其凋亡率，进而产生抗白假丝酵母菌和抗耐药白假丝酵母菌的作用。此外，本发明兰花萃取物中还含有其他生物活性成分，可发挥协同作用，可以抑制白假丝酵母菌酵母相向菌丝相的转换，也能从多个方面抑制白假丝酵母菌生物膜的形成，同时使患者白细胞的吞噬功能增强，提高人类机体免疫力。

本发明还公开了兰花萃取物的用途，在制备抗人类酵母菌感染制剂中的用途。兰花萃取物中具有数个功能特性的活性萃取物，成分天然，具有抗人类酵母菌、抗氧化效果，在体外细胞实验及人体实验均证实其安全性，具有实际的商品应用性。

本发明进一步公开了具抗人类酵母菌功能的兰花萃取物的制备方法，包括如下步骤：

s1：将兰花粉加入甲醇中，经提取获得提取液，加入葡聚糖酶和亚硫酸氢钠，微波复合酶解反应后浓缩，得到浸膏i；

s2：将浸膏i用石油醚萃取至颜色不再变化，浓缩，得到浸膏ii；

s3：将浸膏ii经乙酸乙酯超声萃取，合并萃取液，浓缩，得到浸膏iii；

s4：将浸膏iii经正丁醇萃取，合并萃取液，浓缩，干燥，得到兰花萃取物。

本发明制备方法中葡聚糖酶、亚硫酸氢钠的存在具有如下技术效果：一方面在微波的作用下能够使得木棉花水萃物中含有抗人类酵母菌功能的化合物(i)，另一方面能够通过酶解反应能够将兰花多糖分解为低聚糖或葡萄糖，且在亚临界水萃取过程中，产生的低聚糖或葡萄糖可与兰花中的游离氨基酸以及酚酸类进一步反应生成多糖基物质，在多糖物质上引入大量的-nh2和-cooh，不但能通过渗透到人类酵母菌的细胞核中与dna相结合，干扰和抑制mrna以及蛋白质的合成，从而赋予木兰萃取物杀菌作用，而且还可以作为螯合剂，选择性结合痕量金属，从而抑制人类酵母菌的生长，能够与化合物(i)发挥增益作用，进一步提高兰花萃取物的抗人类酵母菌功能。

上述兰花粉包括花和/或叶和/或茎和/或根。

上述葡聚糖酶的添加量为兰花粉重量0.20-0.30‰。

上述亚硫酸氢钠添加至浓度为50-200ppm。

上述微波复合酶解温度为50-60℃、功率为300-500w、时间为5-15min。

本发明最后公开了具抗人类酵母菌功能的兰花萃取物的组合物，包含上述兰花萃取物。

上述组合物用于制备抗菌美白牙膏。口腔是人体中最复杂的微生态系，正常情况下有各种条件致病性真菌寄生，尤其是酵母菌尤其是被认为是口腔菌斑生物膜的重要组成成分，在口腔真菌菌种中检出率最高。本发明组合物用兰花萃取物不仅具有光谱抑菌能力，且对人类酵母菌能够发挥优良的抗菌效果，尤其对白假丝酵母菌的抑菌效果更有效，能够有效预防或治疗牙周炎症，同时本发明组合物用兰花萃取物还能够在牙齿上有良好的附着性，能持续起效，减少微生物的粘附，提高牙齿的表面光泽度，达到防止蛀牙、抑制牙菌斑、美白牙齿的目的。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明兰花萃取物中具有数个功能特性的活性萃取物，成分天然，不仅具有光谱抑菌能力，而且对人类酵母菌能够发挥优良的抗菌效果，尤其对白假丝酵母菌的抑菌效果更有效，能够有效预防或治疗牙周炎症；本发明兰花萃取物还能够在牙齿上有良好的附着性，能持续起效，减少微生物的粘附，提高牙齿的表面光泽度，达到防止蛀牙、抑制牙菌斑、美白牙齿的目的。

本发明采用了上述技术方案提供具抗人类酵母菌功能的兰花萃取物及其组合物，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。

附图说明

图1为本发明试验例2中dapi染色的荧光显微镜图；

图2为本发明试验例2中caspase酶活性的荧光显微镜图。

具体实施方式

为使本发明的上述及其他目的、特征及优点能更明显易懂，下文特列举本发明的较佳实施例，作详细说明如下：

本发明的具抗人类酵母菌功能的兰花萃取物，包含至少一具有抗人类酵母菌活性的化合物，其结构式如(i)所示：

上述化合物具有抗白假丝酵母菌的活性。

本发明兰花萃取物中含有具有抗人类酵母菌活性的化合物，不仅具有光谱抑菌能力，而且对人类酵母菌能够发挥优良的抗菌效果，尤其对白假丝酵母菌的抑菌效果更有效，能使白假丝酵母菌生物被膜细胞呈现不同程度的核固缩、核碎裂或颗粒状荧光等现象，损害线粒体功能，使其电位降低，提升白色念珠菌生物被膜细胞内ros的水平，激活了耐药白假丝酵母菌细胞内的metacaspase活性，提升其凋亡率，进而产生抗白假丝酵母菌和抗耐药白假丝酵母菌的作用。此外，本发明兰花萃取物中还含有其他生物活性成分，可发挥协同作用，可以抑制白假丝酵母菌酵母相向菌丝相的转换，也能从多个方面抑制白假丝酵母菌生物膜的形成，同时使患者白细胞的吞噬功能增强，提高人类机体免疫力。

本发明的兰花萃取物的用途，在制备抗人类酵母菌感染制剂中的用途。兰花萃取物中具有数个功能特性的活性萃取物，成分天然，具有抗人类酵母菌、抗氧化效果，在体外细胞实验及人体实验均证实其安全性，具有实际的商品应用性。

本发明的具抗人类酵母菌功能的兰花萃取物的制备方法，包括如下步骤：

s1：将兰花粉加入甲醇中，经提取获得提取液，加入葡聚糖酶和亚硫酸氢钠，微波复合酶解反应后浓缩，得到浸膏i；

s2：将浸膏i用石油醚萃取至颜色不再变化，浓缩，得到浸膏ii；

s3：将浸膏ii经乙酸乙酯超声萃取，合并萃取液，浓缩，得到浸膏iii；

s4：将浸膏iii经正丁醇萃取，合并萃取液，浓缩，干燥，得到兰花萃取物。

本发明制备方法中葡聚糖酶、亚硫酸氢钠的存在具有如下技术效果：一方面在微波的作用下能够使得木棉花水萃物中含有抗人类酵母菌功能的化合物(i)，另一方面能够通过酶解反应能够将兰花多糖分解为低聚糖或葡萄糖，且在亚临界水萃取过程中，产生的低聚糖或葡萄糖可与兰花中的游离氨基酸以及酚酸类进一步反应生成多糖基物质，在多糖物质上引入大量的-nh2和-cooh，不但能通过渗透到人类酵母菌的细胞核中与dna相结合，干扰和抑制mrna以及蛋白质的合成，从而赋予木兰萃取物杀菌作用，而且还可以作为螯合剂，选择性结合痕量金属，从而抑制人类酵母菌的生长，能够与化合物(i)发挥增益作用，进一步提高兰花萃取物的抗人类酵母菌功能。

上述兰花粉包括花和/或叶和/或茎和/或根。

其中，兰花萃取物具体通过如下步骤制备：

s1：将兰花原料于110-120℃的温度下烘干，然后粉碎至20-100目，得兰花粉，以增加兰花粉与萃取溶剂的接触表面积，借此提升后续萃取的萃取效率，当原料粒径为40-60目，活性物质的萃取率达到最大，而后，随着粒径的减小，萃取率反而逐渐减小。这是由于原料兰花粉的细胞外层是由纤维素和半纤维素等物质构成的细胞壁，质壁坚硬，犹如细胞的外壳有保护内含物的作用。若原料颗粒的粒径过大，当萃取温度一定时，则细胞壁的阻力会使萃取剂在短时间内难以快速扩散至颗粒内部，因而影响了有效成分的溶剂化和向外扩散；萃取率就减小了；当原料通过粉碎处理，原料的粒径变小了，细胞壁被破坏的程度就增大了，整个原料的颗粒被溶剂浸润的时间就缩短了，有效成分溶剂化的速度和扩散速度也就自然加快了，同时粒径减小也增加了萃取剂与原料的接触面积和萃取通道，从而有利于提高萃取率，但并不是原料的粒径越小越好，原料过细，虽然此时对原料细胞壁的破坏更加彻底，但却增加了原料的堆积密度，物料空隙率下降，通透性变差，致使萃取剂水只能沿着阻力小的线路穿过料层，形成许多针孔，使萃取显著不均匀。同时，颗粒太细，不仅会导致流路堵塞，使萃取柱柱压过高，而且还会造成原料结块，现沟流，对萃取不利，因而就出现了原料粒径过小，萃取率不再提高，反而减小的现象，因此，提取过程中原料的粒径应该适当，优选颗粒粒径为40-60目；

s2：按料液比为1:4-6(g/ml)(如1:4.2、1:4.5、1:5.2、1:5.8等)将兰花粉加入甲醇中提取40-60h(如42h、44.5h、48h、54h、55h、57h等)，过滤，重复2-4次，合并滤液得提取液，然后加入兰花粉重量0.20-0.30‰的葡聚糖酶(如0.21‰、0.22‰、0.23‰、0.24‰、0.26‰、0.28‰等)和亚硫酸氢钠，亚硫酸氢钠添加至浓度为50-200ppm(如60ppm、75ppm、92ppm、100ppm、110ppm、150ppm、170ppm、185ppm等)，然后在50-60℃(如51℃、52.5℃、53℃、56℃、57℃、59℃等)、300-500w(如320w、350w、380w、415w、450w、480w等)下微波复合酶解反应5-15min(如6min、7min、8min、11min、12.5min、14min等)，浓缩，得到浸膏i；

s3：将浸膏i分散于水中，用石油醚萃取至颜色不再变化，减压浓缩，得到浸膏ii；

s4：将浸膏ii经乙酸乙酯超声萃取，重复多次，合并萃取液，减压浓缩，得到浸膏iii；

s5：将浸膏iii经正丁醇萃取，重复多次，合并萃取液，浓缩，干燥，得到兰花萃取物。

本发明最后公开了具抗人类酵母菌功能的兰花萃取物的组合物，包含上述兰花萃取物。

上述组合物用于制备抗菌美白牙膏。口腔是人体中最复杂的微生态系，正常情况下有各种条件致病性真菌寄生，尤其是酵母菌尤其是被认为是口腔菌斑生物膜的重要组成成分，在口腔真菌菌种中检出率最高。本发明组合物用兰花萃取物不仅具有光谱抑菌能力，且对人类酵母菌能够发挥优良的抗菌效果，尤其对白假丝酵母菌的抑菌效果更有效，能够有效预防或治疗牙周炎症，同时本发明组合物用兰花萃取物还能够在牙齿上有良好的附着性，能持续起效，减少微生物的粘附，提高牙齿的表面光泽度，达到防止蛀牙、抑制牙菌斑、美白牙齿的目的。

上述组合物还包含制剂允许的添加剂。作为该添加剂，没有特别限定，可举出例如：保存材料、抗氧化剂、增稠稳定剂、乳化剂、食物纤维、ph调节剂等。

下面，结合具体实施例对本发明实施方式作进一步说明。

实施例1：

兰花萃取物通过如下步骤制备：

s1：将兰花原料于110℃的温度下烘干，然后粉碎至20目，得兰花粉；

s2：按料液比为1:4(g/ml)将兰花粉加入甲醇中提取40h，过滤，重复2次，合并滤液得提取液，然后加入兰花粉重量0.20‰的葡聚糖酶和亚硫酸氢钠，亚硫酸氢钠添加至浓度为50ppm，然后在50℃、300w下微波复合酶解反应5min，浓缩，得到浸膏i；

s3：将浸膏i分散于水中，用石油醚萃取至颜色不再变化，减压浓缩，得到浸膏ii；

s4：将浸膏ii经乙酸乙酯超声萃取，重复多次，合并萃取液，减压浓缩，得到浸膏iii；

s5：将浸膏iii经正丁醇萃取，重复多次，合并萃取液，浓缩，干燥，得到兰花萃取物。

实施例2：

兰花萃取物通过如下步骤制备：

s1：将兰花原料于115℃的温度下烘干，然后粉碎至50目，得兰花粉；

s2：按料液比为1:5(g/ml)将兰花粉加入甲醇中提取50h，过滤，重复3次，合并滤液得提取液，然后加入兰花粉重量0.25‰的葡聚糖酶和亚硫酸氢钠，亚硫酸氢钠添加至浓度为120ppm，然后在55℃、400w下微波复合酶解反应8min，浓缩，得到浸膏i；

s3：将浸膏i分散于水中，用石油醚萃取至颜色不再变化，减压浓缩，得到浸膏ii；

s4：将浸膏ii经乙酸乙酯超声萃取，重复多次，合并萃取液，减压浓缩，得到浸膏iii；

s5：将浸膏iii经正丁醇萃取，重复多次，合并萃取液，浓缩，干燥，得到兰花萃取物。

实施例3：

兰花萃取物通过如下步骤制备：

s1：将兰花原料于120℃的温度下烘干，然后粉碎至100目，得兰花粉；

s2：按料液比为1:6(g/ml)将兰花粉加入甲醇中提取60h，过滤，重复4次，合并滤液得提取液，然后加入兰花粉重量0.30‰的葡聚糖酶和亚硫酸氢钠，亚硫酸氢钠添加至浓度为200ppm，然后在60℃、500w下微波复合酶解反应15min，浓缩，得到浸膏i；

s3：将浸膏i分散于水中，用石油醚萃取至颜色不再变化，减压浓缩，得到浸膏ii；

s4：将浸膏ii经乙酸乙酯超声萃取，重复多次，合并萃取液，减压浓缩，得到浸膏iii；

s5：将浸膏iii经正丁醇萃取，重复多次，合并萃取液，浓缩，干燥，得到兰花萃取物。

对比例1：

兰花萃取物通过如下步骤制备：

s1：将兰花原料于115℃的温度下烘干，然后粉碎至50目，得兰花粉；

s2：按料液比为1:5(g/ml)将兰花粉加入甲醇中提取50h，过滤，重复3次，合并滤液得提取液，然后加入兰花粉重量0.25‰的葡聚糖酶，然后在55℃、400w下微波复合酶解反应8min，浓缩，得到浸膏i；

s3：将浸膏i分散于水中，用石油醚萃取至颜色不再变化，减压浓缩，得到浸膏ii；

s4：将浸膏ii经乙酸乙酯超声萃取，重复多次，合并萃取液，减压浓缩，得到浸膏iii；

s5：将浸膏iii经正丁醇萃取，重复多次，合并萃取液，浓缩，干燥，得到兰花萃取物。

对比例2：

兰花萃取物通过如下步骤制备：

s1：将兰花原料于115℃的温度下烘干，然后粉碎至50目，得兰花粉；

s2：按料液比为1:5(g/ml)将兰花粉加入甲醇中提取50h，过滤，重复3次，合并滤液得提取液，然后加入兰花粉重量0.25‰的亚硫酸氢钠，亚硫酸氢钠添加至浓度为120ppm，然后在55℃、400w下微波复合酶解反应8min，浓缩，得到浸膏i；

s3：将浸膏i分散于水中，用石油醚萃取至颜色不再变化，减压浓缩，得到浸膏ii；

s4：将浸膏ii经乙酸乙酯超声萃取，重复多次，合并萃取液，减压浓缩，得到浸膏iii；

s5：将浸膏iii经正丁醇萃取，重复多次，合并萃取液，浓缩，干燥，得到兰花萃取物。

对比例3

兰花萃取物通过如下步骤制备：

s1：将兰花原料于115℃的温度下烘干，然后粉碎至50目，得兰花粉；

s2：按料液比为1:5(g/ml)将兰花粉加入甲醇中提取50h，过滤，重复3次，合并滤液得提取液，然后在55℃、400w下微波复合酶解反应8min，浓缩，得到浸膏i；

s3：将浸膏i分散于水中，用石油醚萃取至颜色不再变化，减压浓缩，得到浸膏ii；

s4：将浸膏ii经乙酸乙酯超声萃取，重复多次，合并萃取液，减压浓缩，得到浸膏iii；

s5：将浸膏iii经正丁醇萃取，重复多次，合并萃取液，浓缩，干燥，得到兰花萃取物。

试验例1：

兰花萃取物的抗人类酵母菌效果

滤纸片法测定抑菌圈：将配制好灭过菌的固体琼胶培养基熔化后倒入培养皿中，每皿20ml，待冷却凝固后，用无菌吸管分别加入0.1ml白假丝酵母菌和临床耐氟康唑培养16h的白假丝酵母菌的悬液(菌体含量为1×10⁵～1×10⁶cfu/ml)，用无菌涂布器将菌液涂布均匀，制成含菌平板。选择吸水性强的定性滤纸，用打孔器打成若干直径为6mm的圆形滤纸片，分装于洁净干燥的小培养皿内，干热灭菌后，浸在浓度为20ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml兰花萃取物溶液中，用无菌镊子镊取浸有兰花萃取物溶液的滤纸片贴在含菌平板上，每个培养皿放置3个纸片。放入培养箱于37℃恒温倒置培养24h，取出后测定滤纸片抑菌圈直径大小，抑菌效果如表1所示。由表1可知，相同浓度的兰花萃取物溶液的条件下，抑菌圈的大小排序为：实施例2＞对比例2＞对比例1＞对比例3，获得的兰花萃取物的抑菌效果好于对比例1获得的兰花萃取物。这说明本发明的兰花萃取物具有优良的抗真菌功能，且制备方法中葡聚糖酶、亚硫酸氢钠的存在能提高兰花萃取物的抗白假丝酵母菌和抗耐药白假丝酵母菌的功能。

表1兰花萃取物的抗真菌效果

试验例2：

1.白假丝酵母菌生物被膜细胞的获取

获取临床耐氟康唑培养16h的白假丝酵母菌生物被膜用吸管和微量取液器反复吹打，混悬器震荡混匀，低倍镜下鉴定是生物被膜分散细胞，后用pbs溶液重悬。

2.凋亡的药物诱导及脱壁处理

把实施例2兰花萃取物按终浓度50μg/ml和阳性对照药两性霉素b(0.5μg/ml)分别加入到白假丝酵母菌生物被膜分散细胞悬液(2×10⁶cfu/ml)中，另设不加药的空白组，在37℃静置孵育16h，后用1ml冷无菌pbs溶液离心(4000r/min)五分钟，此操作重复2次。然后对各组细胞进行脱壁处理：加脱壁促进剂(50mmk2hpo4，5mmedta，50mmdtt)，摇床培养30min(37℃,100r/min)，用无菌冷pbs溶液清洗2次后，再加入1.5％蜗牛酶溶液，30℃、100r/min摇床孵育45min，无菌冷pbs缓冲液清洗2次后，将得到脱壁的原生质体状态的白假丝酵母菌并经显微镜镜检。

3.dapi染色

经上述药物凋亡诱导并经过脱壁处理的临床白假丝酵母菌生物被膜细胞以70％乙醇固定渗透10min，3000r/min离心5min收集。后用2ml冷无菌pbs溶液离心(4000r/min)5min，此操作重复2次。后加入10μg/ml的dapi，室温条件下避光染色20min。取20μl菌悬液置于含有多聚赖氨酸的载玻片上，室温黏附5min后，用10％甲醛固定10min，后用2ml冷无菌pbs溶液离心(4000r/min)五分钟，此操作重复3次后置于荧光显微镜下观察并拍照。dapi是一种能够与dna强力结合的荧光染料，可以穿透细胞膜与细胞核中的双链结合而产生荧光，以此来判断细胞核的碎裂和皱缩。结果如图1所示。图1中a为实施例2兰花萃取物组、b为对照组、c为空白组，空白组的耐药白假丝酵母菌呈弥漫均匀的低强度荧光，实施例2兰花萃取物组和对照组均具有较强的荧光强度，说明兰花萃取物组能够诱导临床耐药白假丝酵母菌细胞的凋亡。

3.caspase酶活性的测定

将经上述药物凋亡诱导并经过脱壁处理的临床白假丝酵母菌生物被膜细胞，离心收集细胞，用2ml冷无菌pbs溶液离心(4000r/min)5min，此操作重复3次后，加100μl的10μm的fitc-vad-fmk试剂在30℃条件下避光染色lh后均匀涂布在含有多聚赖氨酸的载玻片上，置于荧光显微镜下观察并拍照。caspase是存在于细胞质中能选择性切割某些蛋白质具有类似结构的蛋白酶，从而诱导细胞凋亡。在临床白假丝酵母菌生物被膜细胞中，存在caspase同源结构类似物，即metacaspase，因此，选用fitc-vad-fmk可在原位检测metacaspase的活性。结果如图1所示。图1中a为实施例2兰花萃取物组、b为对照组、c为空白组，空白组中可见细胞有极其微弱的荧光，实施例2兰花萃取物组和对照组均具有较强的荧光强度，说明兰花萃取物组能够激活耐药白假丝酵母菌细胞内的metacaspase活性。

4.活性氧(ros)水平的检测

把分别加入实施例2兰花萃取物(50μg/ml)菌液、amb阳性对照组和空白组离心5min(3000rpm)，后用1ml冷无菌pbs溶液离心(4000r/min)五分钟，此操作重复3次后，再加1.5％的蜗牛酶脱壁处理，再用无菌冷pbs清洗2至3次，按照试剂盒说明书加入dcfh-da试剂，培养20min(37℃避光)。每4min稍微摇匀一下，以便白假丝酵母菌生物被膜分散细胞和探针接触充分。再用冷无菌pbs洗涤细胞2至3次后用流式细胞仪检测dcfh-da的荧光强度，荧光现象的强弱代表ros水平。实施例2兰花萃取物组的ros为6.28％，对照组的ros为11.01％，空白组的ros为0.41％，这说明实施例2兰花萃取物组可显著提高耐药白假丝酵母菌生物被膜细胞内ros水平。

试验例3

兰花萃取物的美白效果测试

1.pcr测试

1.1试验用牙膏

牙膏包括如下成分及其重量份：实施例2兰花萃取物、聚乙二醇-4006份、黄原胶0.4份、甘油18份、香精0.5份、山梨醇20份、去离子水24份。

1.2pcr测试用牙齿预处理

使用牛永久性门牙制成长宽4mm的方块，将其嵌入洁净、自塑固化的丙烯酸牙托内组成1.5cm长宽的唇表釉质模拟方块。使用打磨机使方块的表面平整，再使用湿润的400#砂纸将磨痕去除，最后用氧化铝进行抛光。制作完成的试验样品还必须放在解剖显微镜下观察，以去掉缺陷样。在着色前，样品还需在0.2m的hcl中腐蚀60秒，用水冲洗干净后再用1％的植酸腐蚀60秒。

样品在最后的清洗后放入着色装置中，装置中特富龙的旋转棍以1.5rpm恒转转动，釉质方块沿着旋转棍径向排列以一定间隔穿在塑料螺丝上，浸泡在染色用肉汤中染色。

将肉汤加入装置的槽内，并将牙齿样品放入其中，保持在37℃恒速转动。这个程序共进行连续十天，每天更换一次肉汤，每次更换肉汤时，均需用去离子水对汤槽与釉质方块进行清洗，以清除肉汤内残留的碎屑。从第十一天开始，着色汤内将加入fecl3·6h2o，这种肉汤仍然每天一换直至釉质表面形成较深色的薄膜层(l*值30-35)。将着色样品取出清洗干净后冷藏在保湿箱内备用。

试验样本室温干燥晾干30分钟，用分光光度计对其中心点进行检测，使用cielab颜色表可得到一个l*平均值。

1.3试验

样品放置在v-8交叉摩擦测试机上，浸泡在标准稀释膏浆中，用尼龙标准刷以150g的压力往复摩擦800次，完成摩擦测试后再次测量l^*值。按照如下公式计算pcr：

其中，ltf和lti分别代表样品测试前与测试后的l^*值；

lcf和lci分别代表焦磷酸钙标准样测试前与测试后的l^*值，标准参考值为100。试验组的pcr值为124.21，这表明：试验组对牙齿的磨耗更低但清洁能力更好，这样的产品更符合现代人对健康的注重与对牙膏产品清洁的要求。进一步说明添加木兰萃取物能够减少牙膏对牙齿的摩擦损耗、提高牙齿的清洁能力与表面光泽度，以较安全温和的物理方法增加了牙膏的美白作用。

上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。